Введение к работе
Актуальность проблемы. Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) - фермент, катализирующий окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии АТР и
о ,
Mg2 , сопровождаемое выделением квантов света. Неослабевающий научный интерес к изучению структуры и функций фермента обусловлен широкими возможностями биоаналитического применения люцифераз. Это связано с уникальной специфичностью и высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции.
Уникальной особенностью люцифераз светляков является наличие большого числа свободных SH-групп остатков цистеина, содержание которых в молекуле варьируется в широком диапазоне для люцифераз из светляков разных видов. Являясь наиболее реакционно-способными аминокислотными остатками, SH-группы цистеина могут выполнять в ферментах разнообразные функции: поддерживать третичную структуру белка за счёт образования внутримолекулярных дисульфидных связей; принимать непосредственное участие в каталитической реакции в качестве нуклеофила; координировать ионы металлов-кофакторов в активном центре фермента. Кроме того, свободные остатки цистеина, не входящие в состав активного центра, могут играть ключевую роль на разных этапах фолдинга фермента, образовывать межмолекулярные S-S-связи; участвовать в реакциях обратимого окисления, выполняющих важную роль в регуляторных процессах в клетке.
Роль остатков цистеина в функционировании люцифераз в настоящее время остаётся неясной. Немногочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что хотя остатки цистеина в молекуле люцифераз не входят в состав активного центра и не участвуют в структурообразовании молекулы, они чрезвычайно важны для функционирования фермента, поскольку их химическая модификация и мутагенез приводит к существенным изменениям свойств люцифераз. Так, было показано, что замена всех 4-х остатков Cys в люциферазе Photinus pyralis на Ser приводит к резкому падению ферментативной активности (до 6,5%); кроме того, прослеживается существенное взаимовлияние между данными остатками.
Самопроизвольное окисление белков, обусловленное, в первую очередь, окислением свободных SH-групп остатков цистеина, как наиболее реакционно- способных, является одной из существенных проблем биотехнологии. Исключение доступных для окисления остатков цистеина из состава молекулы люциферазы может способствовать стабилизации фермента. В то же время наличие свободных остатков цистеина, доступных для модификации, открывает возможности для проведения направленной конъюгации люциферазы, что может существенным образом расширить её биотехнологическое применение.
Для увеличения выхода данного фермента и упрощения процедуры очистки в структуру люциферазы была введена шестигистидиновая последовательность (His- таг), и был осуществлён переход к использованию экспрессионной плазмиды pETL7. Ранее вопрос о влиянии His-тага на свойства люциферазы в литературе не рассматривался, однако он является важным, поскольку существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения His-тага в состав его молекулы.
Данная работа посвящена изучению функции неконсервативных остатков цистеина в молекуле люциферазы светляков Luciola mingrelica: изучению возможности замены данных остатков в структуре молекулы для повышения стабильности фермента за счёт снятия эффекта окислительной инактивации фермента, а также возможности использования этих остатков для проведения направленной конъюгации люциферазы светляков. Ещё одной актуальной задачей являлось изучение влияния шестигистидиновой последовательности на С-конце люциферазы на свойства данного фермента.
Цели и задачи исследования.
-
Изучение роли неконсервативных остатков Cys62,146,164 в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза.
-
Изучение влияния шестигистидиновой последовательности (His-тага) на С- конце молекулы люциферазы светляков L. mingrelica на свойства фермента.
-
Изучение роли неконсервативных остатков Cys62,86,146 и 164 в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей дополнительную шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы.
-
Изучение возможности использования свободных SH-групп люциферазы для проведения направленной конъюгации.
В соответствии с целями в диссертационной работе были поставлены
следующие задачи:
1. Получение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, несущих единичные замены: Cys62Ser, Cys146Ser, Cys164Ser. Изучение каталитических свойств данных ферментов и влияния вводимых замен на кинетику процесса термоинактивации люциферазы.
-
-
Изучение влияния шестигистидиновой последовательности на С-конце люциферазы на свойства исходного фермента и его мутантных форм: Cys62Ser, Cys86Ser, Cys146Ser и Cys164Ser.
-
Получение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, содержащей шестигистидиновую последовательность на С-конце молекулы, несущих множественные замены: Cys62/146Ser, Cys62/164Ser, Cys86/146Ser, Cys146/164Ser и Cys62/146/164Ser для выявления возможного взаимовлияния остатков цистеина.
-
Изучение возможности проведения направленной конъюгации c использованием свободных остатков цистеина в молекуле люциферазы.
Научная новизна. Впервые продемонстрирован стабилизирующий эффект мутаций неконсервативных остатков цистеина Cys62Ser, Cys146Ser и Cys164Ser в молекуле люциферазы L. mingrelica, который определяется частичным снятием эффекта окислительной инактивации при замене остатка Cys62 и практически полным снятием данного эффекта при замене остатков Сys146 и Cys164. Показано, что введение указанных замен снижает зависимость стабильности люциферазы от ее концентрации. Особенно яркий стабилизирующий эффект замены остатков Cys наблюдается при низких концентрациях фермента. Введение С-концевой шестигистидиновой последовательности приводит к изменению каталитических свойств люциферазы, а также к смене механизма термоинактивации и исчезновению концентрационной зависимости стабильности фермента. Впервые показана критическая роль остатка Cys86 для функционирования люциферазы. Продемонстрировано наличие взаимного влияния между остатками Cys62 и Cys164 в молекуле люциферазы, несущей С-концевую шестигистидиновую последовательность.
Практическая значимость работы. Показано, что введение замен Cys146Ser и Cys164Ser приводит к трехкратной стабилизации фермента, а также практически полностью исключает протекание процесса окислительной инактивации, что позволяет избежать использования дитиотреитола в качестве протектора для предотвращения окисления SH-групп при очистке и хранении люциферазы светляков. Показано, что использование остатка Cys146, локализованного на поверхности белковой глобулы, открывает широкие возможности для проведения химической конъюгации люциферазы с различными биоспецифичными молекулами.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: IV Международный Московский биотехнологический конгресс "Биотехнология 2007: Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2007), 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Shanghai, China, 2008), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007» (Москва, Россия, 2007), V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, Россия, 2008), International conference "Biocatalysis 2009: Fundamentals and Applications" (Arkhangelsk, Russia, 2009), VI Международный Московский биотехнологический конгресс "Биотехнология 2011: Состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2011) и VI Съезд Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Россия, 2011).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 9 тезисов докладов конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 135 страниц печатного текста, 41 рисунок, 27 таблиц и 155 ссылок.
Принятые в тексте обозначения. WT - люцифераза, аминокислотная последовательность которой идентична природной люциферазе; WT-His - люцифераза, содержащая дополнительную шестигистиновую последовательность на C-конце фермента; 4TS - термостабильный мутант люциферазы; His-таг - концевая шестигистидиновая последовательность; ДТТ - дитиотреитол; DTNB - 5,5'- дитиобис-2-нитробензойная кислота; SPDP - N-сукцинимидил 3-(2- пиридилдитио)пропионат; knn - константа скорости инактивации.
Похожие диссертации на Изучение роли остатков цистеина в функционировании люциферазы светляков Luciola mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза
-
