Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1. Строение люцифераз светляков 8
1.1. Механизм биолюминесцентной реакции люциферазы 8
1.2. Первичные структуры люцифераз жуков 9
1.3. Пространственная структура и активный центр люциферазы светляков 11
2. Спектры биолюминесценции люцифераз 16
2.1. Особенности спектров биолюминесценции люцифераз жуков 16
2.2. Физико-химические представления о влиянии окружения на спектры испускания флуорофоров 17
2.3. Механизмы изменения спектров биолюминесценции, описанные в литературе. 21
2.4. Связь между структурой и спектрами биолюминесценции люцифераз 28
3. Стабильность люциферазы светляков 31
3.1. Факторы, влияющие на стабильность люциферазы светляков 31
3.2. Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза 33
3.3. Повышение устойчивости ферментов к действию органических растворителей методом мутагенеза 36
2 Экспериментальная часть 38
1. Вещества и реагенты 38
2. Штаммы и плазмиды 40
3. Аппаратура 41
4. Методики проведения экспериментов 42
4.1. Выделение и очистка люциферазы 42
4.2. Изучение свойств люциферазы 44
4.3. Методы работы с ДНК 47
4.4. Конструирование плазмид 48
4.5. Получение мутантной формы люциферазы с заменой G216N, A217N методом сайт-направленного мутагенеза 51
4.6. Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом случайного мутагенеза 51
4.7. Получение мутантных форм люциферазы с повышенной термостабильностью методом направленной эволюции 55
4.8. Компьютерное моделирование и анализ структуры люциферазы L. mingrelica 56
3 Результаты и обсуждение 57
1. Получение и свойства двойного мутанта G216N,A217L 57
1.1. Получение и физико-химические свойства мутанта 57
1.2. Спектры биолюминесценции 58
1.3. Термостабильность мутанта G216N,A217L 61
1.4. Обсуждение эффектов замены G216N,A217L 62
2. Векторы для получения люциферазы и сравнение свойств различных форм рекомбинантного фермента дикого типа 65
2.1. Конструирование использованных плазмид 65
2.2. Экспрессия генетических конструкций и очистка рекомбинантных ферментов.. 70
2.3. Сравнение свойств различных форм рекомбинантной WT-люциферазы 74
3. Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза 78
3.1. Отбор мутантов с измененным спектром биолюминесценции 79
3.2. Выделение, каталитические свойства и стабильность мутантов 82
3.3. Спектры биолюминесценции мутантов 83
2.1. Обсуждение эффекта замены Y35 на Asn, His 89
4. Получение мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО 92
5. Повышение термостабильности люциферазы методом направленной эволюции 96
5.1 Случайный мутагенез и скрининг мутантов по термостабильности 97
5.2 Кинетические свойства и спектры биолюминесценции мутанта 4TS 104
5.3 Термостабильность мутанта 4TS 106
5.4 Сравнение свойств мутанта 4TS и нативной люциферазы 109
Выводы 111
- Первичные структуры люцифераз жуков
- Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза
- Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом случайного мутагенеза
- Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза
Введение к работе
Биолюминесценция широко распространена в природе и встречается во многих группах живых организмов [1-3], например, среди насекомых, бактерий, кишечнополостных, грибов и т. д. В основе биолюминесценции во всех случаях является реакция окисления субстрата - люциферина - молекулярным кислородом, катализируемая ферментом - люциферазой. Люциферхп^ и люцифераза являются собирательными названиялш: стрз^ стуры фермента, субстрата и механизм протекания реакции у разных групп могут быть совершенно различными.
Люциферин-люциферазная система светляков является одной и наиболее часто используемых [4] и давно изучаемых [5]. Она обладает наиболее высоким квантовым выходом [6, 7] среди других биолюминесцентиых процессов. Для протекания реакции в этом случае кроме люциферпна необходим также второй субстрат - АТФ. Высокая специфичность к АТФ и простота детекции света обусловили применение люциферазы в качестве высокоэффективного реагента для определения ультрамалых количеств АТФ, что широко используется для оценки биомассы, жизнеспособности клеток, определения метаболитов и бактериальных загрязнений [8, 9]. Люцифераза также широко используется в качестве удобного гена-репортера [9-11] для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Кроме того, этот фермент применяется в пиросеквенпровании [12]. Известны работы по применению люциферазы для изучения белок-белковых взаимодействий. [13-15] и в качестве метки в иммуноферментном [16, 17] и ДНК-анализе [17].
Химическая схема реакции и продукт идентичны для всех люцифераз жуков, но при этом максимумы спектров биолюминесценции люцифераз из различных видов лежат в диапазоне волн от зеленого (Лтах'^ 5^34 нм) до красного (^ nii?x=623 им) [18], то есть различия в спектрах определяются свойствами люциферазы [19]. Люциферазы жуков кроме того можно условно разделить на две группы по чувствительности спектра биолюминесценции к рН [18]: рН-нечувствительные люциферазы жуков-щелкунов и нескольких др}тих видов, у которых Ятах и форма спектра практически не изменяются при понижении рН, и рН-чувствительные люциферазы светляков, для которых Лтах биолюминесценции смещается от 540-570 нм (зеленое или желто-зеленое свечение) при рН8 до •-620 нм (красное свечение) при рНб. Такой значительный сдвиг обычно объясняют тем, что продукт реакции (электронно-возбужденный оксилюциферин) может существовать в активном центре в двух различных молекулярных формах: в виде «зеленого» и «красного» излучателей. В зависилюсти от условий нх соотношение изменяется, что определяет Атак и форму спектра биолюминесценции. Но несмотря на то, что исследования ферментативной реакции люциферазы светляков ведутся уже более 50 лет [6], конкретная природа этих форм и механизм влияния структуры фермента на спектр биолюминесценции до сих пор однозначно не установлены и являются предметом обсуждения [18, 20-22]. Благодаря многочисленным работам по мутагенезу различных люцифераз было выявлено множество аминокислотных остатков как в активном центре фермента, так и вне его, мутации которых приводят к сдвигу в положении спектра биолюминесценции, изменяют форму спектра и его рН-зависилюсть.
Актуальной задачей является поиск новых положений в структуре люциферазы, влияющих па спектр биолюминесценции, что представляет значительный теоретический интерес и способно приблизить нас к пониманию механизма взаимосвязи между структурой фермента и спектрами биолюминесценции. В связи с тем, что практически все известные мутации такого типа были обнаружены на участке люциферазы после 225 остатка, интересен вопрос, насколько важное участие в формировании спектра биолюминесценции принимают остатки из начальной области фермента. Кроме того, мутанты с различными спектральными свойствами \югут быть полезны в качестве геновмаркеров при изучении экспрессии генов in vivo [23, 24].
Практическое применение люцифераз жуков, в том числе и изучаемой нами люциферазы светляков Luciola mingrelica, часто ограничивается низкой стабильностью нативных ферментов при повышенных температурах. В частности, период снижение активности люциферазы в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), который нередко используется для разрушения бактерий при определении внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом. Известен ряд работ, в которых стабильность люциферазы была успешно повышена методами направленного и случайного мутагенеза [25-28].
Целью данной работы было:
1. Получение и изучение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, обладающих: • измененными спектралп! биолюминесценции; • повышенной устойчивостью к ДМСО; • повышенной температурной стабильностью.
2. Анализ взаилюсвязи между изменениями структуры и функциональных свойств мутантных ферментов.
В соответствии с целью в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
1. Получение мутанта люциферазы с заменами G216N, A217L. Изучение его термостабильности и каталитических свойств.
2. Конструирование плазмид на основе системы рЕТ, кодирующих люциферазу с концевой полигистидиновой последовательностью, что позволяет проводить высокоэффективную экспрессию и быструю очистку люциферазы светляков.
3. Получение мутантов люциферазы, обладающих измененными спектрами биолюминесценции, с помощью случайного мутагенеза первых 225 остатков фермента. Исследование влияния полученных мутаций на спектр^шьные и каталитические свойства люциферазы.
4. Получение мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной устойчивостью к присутствию ДМСО.
5. Получение методом направленной эволюции мутантных форм люциферазы, обладающих повьппенной термостабильностью. Изучение кинетики термоинактивации и физико-химических свойств пол}'ченных мутантов.
Первичные структуры люцифераз жуков
К настоящему времени известны более 30 последовательностей люцифераз из различных видов биолюминесцентных жуков, обитающих в США, Южной Америке, Европе и Азии [34-55]. Все люциферазы жуков состоят из одной белковой цепи (542-552 остатка), и обладают достаточно высокой степенью взаимной гомологии, составляющей не менее 48% для наиболее различающихся последовательностей. Это указывает на их общее эволюционное происхождение и функциональное сходство. Знание первичных структур делает возможным выявить консервативные участки аминокислотной последовательности, отвечающие за одинаковые функции и. свойства в люциферазах жуков. На рисунке 2 показано филогенетическое дерево для большинства известных последовательностей люцифераз жуков. Эти люциферазы по степени гомологии разделяются на три большие группы: 1) люциферазы из жуков-светляков (Lampyridae); 2) люциферазы из жуков семейств Phengodidae и Rhagophthalmidae; 3) люциферазы из жуков-щелкунов (Elateridae). Сравнение первичных последовательностей люцифераз показывает, что вторая группа по степени гомологии немного ближе к люциферазам первой группы. Филогенетические исследования эволюции биолюминесцентных жуков показывают, что у жуков-щелкунов биолюминесценция возникла независимо [56, 57] от остальных, а у первой и второй групп могла возникнуть как независимо [58], так и иметь общее происхождение [56]. Кроме того, биолюминесцентные свойства люцифераз между тремя группами несколько отличаются [18], что будет более подробно описано в Главе 2. Степень гомологии люцифераз рода Luciola со второй и третьей группами составляет 48-53 и 47-49% соответственно. Следует отметить, что последовательности люцифераз из нескольких других менее распространенных семейств биолюминесцентных жуков {Homalisidae, Telegeusidae и др.) [56, 59] до сих пор неизвестны, и эти ферменты не изучались. Среди люцифераз светляков можно выделить подгруппу ферментов, наиболее близких по гомологии к люциферазе светляков Luciola mingrelica (рис. 2): это люциферазы рода Hotaria (97-98% гомологии), Luciola italica (95% гомологии) и немного менее гомологичная люцифераза Lampyroidea maculata (93% гомологии). Следующими наиболее близкими по гомологии являются люциферазы Luciola cruciata и Luciola lateralis (80%).
Большинство остальных люцифераз светляков имеют 60-67% гомологии с люциферазами рода Luciola. Интересно отметить, что особняком стоит одна из двух люцифераз, выделенных из светляков Photuris pennsylvanica (номер Genbank - U31240) (рис. 2), гомология которой с большинством люцифераз светляков, в том числе и второй люциферазой из этого же вида (номер Genbank - D25416), составляет только 54-57%. 10 Люцифераза светляков принадлежит к суперсемейству аденилат-образующих ферментов, катализирующих аденилирование карбоксильной группы субстрата при использовании АТФ в качестве АМФ-донора [60, 61]. Она имеет заметное сходство первичной структуры с АТФ-зависимыми ацил-СоА-лигазами и нерибосомальными пептид-синтетазами [61]. Рис. 3. Структура люциферазы светляков L. cruciata в комплексе с DLSA [67]. Несмотря на то, что систематические исследования люциферазы светляков проводились с конца 50-х годов XX века, только в 1996 году была получена первая кристаллическая структура этого фермента для люциферазы P. pyralis [61-63]. Она стала и первой известной структурой аденилат-образующего фермента. Структура была получена для фермента, свободного от субстратов, а известно, что их связывание вызывает значительные конформационные перестройки [32, 64] и изменяет физико-химические свойства фермента [65]. В 1998 г. была получена структура люциферазы P. pyralis в комплексе с двумя молекулами ингибитора-бромоформа [66], которые связываются в той же полости, что и люциферин. Эта структура практически совпадала со структурой свободного фермента. В 2006 году были получены структуры люциферазы L. cruciata [67] в комплексе с Mg-АТФ, аналогом промежуточного продукта реакции аденилирования - DLSA и в комплексе с продуктами реакции - LO и АМФ. Люцифераза состоит из двух доменов, большого N-домена (1-436 остатки) и малого С-домена (443-544 остатки), соединенных подвижной петлёй (337-442 остатки). В свою очередь, в N-домене можно выделить два явно выраженных субдомена [68], А (1-190) и В (191-436). образующих между собой прочный гидрофобный контакт (рис. 3). По сравнению со свободным ферментом в комплексе происходит поворот С-домена примерно на 90 относительно N-домена, что приводит к переходу от открытой к закрытой конформации люциферазы, при которой оба домена находятся в тесном контакте. Полученные структуры позволили узнать строение активного центра фермента и однозначно определить окружение субстратов на аденилирующем этапе реакции (рис. 4). Кроме указанных на рисунке взаимодействий также следует отметить остаток D424, который образует водородную связь с 2 -ОН-группой остатка рибозы аденозина. Активный центр люциферазы образуется на границе взаимодействия N- и С-доменов люциферазы. Основная часть активного центра, области связывания субстратов находятся во втором субдомене N-домена, но для эффективного протекания реакции необходим и ряд остатков С-домена [69, 70]. Консервативный остаток К531 играет ключевую роль в катализе, обеспечивая правильную ориентацию и взаимодействие карбоксильной группы люциферина с АТФ и стабилизирует переходное состояние [69]. Тем не менее, полученные структуры комплексов люциферазы не позволили выявить ряд остатков активного центра, например, отвечающие за связывание иона Mg2+ на первом этапе реакции.
Наиболее полное представление о том, какие остатки входят в состав активного центра и каковы их функции, можно получить лишь сравнивая первичные и третичные структуры ферментов, выполняющих сходную функцию, что позволяет определить роль остатков, консервативных среди всего семейства аденилат-образующих ферментов. В частности, сравнение структуры люциферазы со структурами ацил-СоА-синтетаз [71, 72], 9-І- показывает что за связывание иона Mg отвечают консервативные остатки S200, S345 и Е346. До получения структур комплексов люциферазы работы по определению активного центра фермента проводили с помощью гомологичного моделирования на основе структур других аденилат-образующих ферментов. В 1997 году была получена кристаллическая структура фенилаланин-аденилирующей субъединицы грамицидин-S-синтетазы (PheA) из Bacillus brevis в комплексе с ее субстратами - АМФ и L-фенилаланином [73]. N-концевая субъединица грамицидин-8-синтетазы (также относящейся к классу аденилат-образующих ферментов), состоящая из 556 аминокислотных остатков (16% гомологии с люциферазой светляков), имеет третичную структуру, аналогичную структуре люциферазы. Полипептидная цепь свернута в два домена, каждый из которых имеет топологию, сходную с соответствующим доменом люциферазы, свободной от лигандов. Основное отличие от свободной люциферазы состоит в том, что С-концевой домен грамицидин-Б-синтетазы в комплексе с субстратами повернут на 94 относительно N-концевого домена и расположен ближе на 5 А по сравнению со структурой люциферазы светляков. Это показывает, что при связывании субстратов происходит переход из открытой к закрытой конформации двух доменов фермента. Изменение в ориентации доменов при связывании субстратов играет важную роль, так как позволяет инвариантному среди аденилат-образующих ферментов остатку К531 (здесь и далее нумерация остатков по L. mingrelica) формировать водородные связи с обоими субстратами (фенилаланином и АТФ для грамицидин-8-синтетазы).
Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза
Сравнительно низкая стабильность природных люцифераз светляков часто ограничивает их применение и понижает его эффективность. При использовании в качестве гена-маркера [176, 177], в АТФ-реагентах [153], пиросеквенировании [151] и в иммуноанализе желательно, чтобы люцифераза была стабильна при 37С. В методе BART необходимо использование фермента, стабильного при температурах выше 60С [178]. Поэтому проводились многочисленные работы по повышению стабильности люцифераз светляков методами мутагенеза. Большинство известных термостабильных мутантов были найдены в результате случайного мутагенеза, так как биолюминесцентные свойства люциферазы позволяют проводить простой скрининг больших библиотек мутантов по активности. Наиболее эффективным оказался метод направленной эволюции - улучшение требуемой характеристики фермента с помощью множества последовательных циклов случайного мутагенеза [179, 180]. Для люциферазы P. penmylvanica в 1998 г. таким способом был получен мутант, у которого при 65С период полуинактивации составлял около 2 дней [28, 181]. Этот мутант представляет наиболее стабильную люциферазу светляков, известную к настоящему моменту. Первыми полученными термостабильными мутантами были замены остатка Т217 на L,I,V у люциферазы L. cruciata на, которые приводили к увеличению к увеличению термостабильности в 7-8 раз при 50С [182]. В случае люциферазы L. lateralis наиболее термостабильным был мутант с заменой A217L [183]. Время его полуинактивации при 50С увеличилось в 18 раз, причем после инкубации в течение часа сохранялось более 70% активности. В люциферазе из светляков P. pyralis аналогичная замена A217L приводила к увеличению стабильности в 3-5 раз [184]. Стабилизирующий эффект этих мутаций объясняли усилением внутренней гидрофобной упаковки белка. Так же методом случайного мутагенеза для люциферазы P. pyralis бьша найдена замена Е356К, в 5 раз увеличивавшая стабильность [25]. Замена Е356 на все возможные аминокислоты показала, что наибольшей термостабильностью характеризуются мутанты, в которых Е356 был заменен на Lys и Arg, несущие положительный заряд.
После получения структуры люциферазы, стало возможным проводить модификацию стабильности с помощью анализа структуры и направленного изменения выбранных остатков. В 2006 г. с помощью нескольких замен поверхностных остатков F16R, L37Q, V183K, I234K и F465R [27] была получена люциферазы с низкой рН-чувствительностыо и в 6 раз большей стабильностью при 43С. Комбинирование пяти других полученных случайным мутагенезом мутаций (Т216А, A217L, I234A, F297L, Е356К) повысило период полуинактивации люциферазы P. pyralis в 44 раза при 37С [168]. Объединение практически всех известных термостабильных точечных мутантов (12 замен) позволило получить вариант люциферазы P. pyralis, время полуинактивации которого составляло 15 мин при 55С [185], в то время как исходный фермент инактивирует при этих условиях в течение секунд. Для этого мутанта бьша также характерна и более высокая активность при низких значения рН [185]. Следует отметить, что аналогичные замены могут оказывать различное влияние на люциферазы из разных видов светляков. В то время как замена A217L в люциферазах L. lateralis, L. cruciata и P. pyralis приводила к полностью активному термостабильному ферменту, в случае люциферазы Н. parvula в результате аналогичной замены происходило очень сильное снижение активности, до 0,1% исходной [140]. Замена E356R значительно стабилизировала люциферазу P. pyralis, а в случае Н. parvula заметной стабилизации не происходило. В то же время двойная замена E356R + V368A в 10 раз увеличивала стабильность люциферазы Н. parvula при 45С, но аналогичная замена V368A не повышала стабильность люциферазы P. pyralis, как фермента дикого типа, так и мутанта E356R [140]. На люциферазе P. pyralis была показана важная роль С-концевого участка, содержащего 12 аминокислот, для активности [186, 187] и стабильности [188] фермента.
При удалении 7 и менее аминокислот активность люциферазы не изменялась, тогда как удаление 8-12 аминокислотных остатков вызывало падение активности фермента с 50 до 0,1%. Удаление от 3 до 10 аминокислотных остатков с расположенного вдали от активного центра N-конца также вызывало потерю активности люциферазы до 1% вследствие низкой стабильности таких ферментов [189]. Как показали мутации нескольких консервативных остатков N-конца, они важны для стабилизации структуры люциферазы [189]. Люциферазы заметно отличаются между собой по содержанию остатков цистеина. Люцифераза P. pyralis содержит четыре таких остатка, L. mingrelica - восемь. Все эти остатки свободные. У жуков-щелкунов 13 остатков цистеина, и, судя по кристаллической структуре, полученной для люциферазы светляков, две пары остатков цистеина у жуков-щелкунов (С82+С129 и С316+С340) в принципе могут участвовать в образовании внутренних дисульфидных мостиков. Окисление остатков цистеина может приводить к инактивации фермента, поэтому в ряде работ было изучено влияние этих остатков на стабильность люциферазы. Для люциферазы L. mingrelica было показано, что окисление SH-групп не является лимитирующей стадией процесса инактивации фермента в растворе [190]. В люциферазе L. mingrelica три консервативных остатка С82, С260, С393 были заменены на аланин [191]. Первые две мутации не оказали влияния на стабильность фермента, а у третьего мутанта константа инактивации была в два раза ниже. Замена поверхностного остатка C146S заметно уменьшала окислительную инактивацию, что увеличивало стабильность фермента при 37С в 1,5-4,7 раза в зависимости от условий [192]. В случае внутренних остатков, введение цистеина зачастую приводило к заметному повышению термостабильности, например, при заменах Т216С [193] и А217С [182]. Таким образом, наличие цистеина в некоторых позициях может приводить к окислительной инактивации люциферазы, в первую очередь это касается поверхностных.
Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом случайного мутагенеза
Участок гена, заключенный между сайтами рестрикции Nhel и BamHI (680 bp), кодирует 1-225 аминокислотные остатки люциферазы. Проводили случайный мутагенез этого участка методом ПЦР пониженной точности (error-prone PCR) [217]. Поскольку частота замен нуклеотидов в этом методе контролируется концентрацией Мп2+, то была проведена оптимизация его концентрации, чтобы поддерживать желаемый уровень мутаций. В качестве прямого и обратного праймеров использовали fNhel и гВатШ (табл. 1) соответственно. Реакционная смесь (50 мкл) содержала 10 мМ Tris-HCl (рН 8.3 при 25С), 50 мМ КС1, 7 мМ MgCl2, 0,2 мМ МпС12, 0,2 мМ dATP, 0,2 мМ dGTP, 1 мМ-dCTP, 1 мМ dTTP, 20 пмоль каждого праймера, 2 фмоль плазмиды pLR3, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию проводили при следующих условиях: 95С, 1 мин; затем 25 циклов, состоящих из 1 мин при 94С, 1 мин при 53С, 1 мин при 72С; затем 10 мин при 72С. Продукт ПЦР очищали с помощью электрофореза в 1% агарозе с последующим выделением из геля с помощью набора QIAEXII. Затем полученный фрагмент обрабатывали рестриктазами Nhel и BamHI, очищали от низкомолекулярных продуктов рестрикции с помощью электрофореза, выделяли из геля и лигировали в расщепленную по этим же сайтам плазмиду pLR3, получая смесь плазмид, содержащих мутантные гены люциферазы. Трансформировали продукт лигирования в компетентные клетки Е. coli XLlblue, рассеивали клетки на чашки Петри со средой LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. Продукт лигирования, полученный после случайного мутагенеза, трансформировали в клетки Е. coli XLlblue, которые выращивали в течение ночи при 37С на чашках со средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, далее в течение нескольких часов чашки инкубировали при комнатной температуре. После этого проводилась регистрация биолюминесценции колоний in vivo [218]: чашки заливали раствором 0,5 мМ 0 в 0,1 М Na-цитратном буфере (рП 5.0), в темноте встряхивали чашку и затем фотографировали светящиеся колонии. Для правильной цветопередачи использовали настройку «облачность» для баланса белого в фотоаппарате. Подобным образом можно проводить анализ до 3-4 тысяч колоний на 90 мм чашке. Наиболее интересные по цвету и яркости колонии переносили на две чашки Петри со средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.
Для сравнения на эти же чашки переносили несколько колоний WT-люциферазы. Клетки выращивали в течение ночи при 37С и далее снова проводили сравнение их биолюминесценции. Для наиболее интересных из этих мутантов выращивали небольшой объем клеточной культуры и получали клеточный лизат, который использовали для регистрации спеткров биолюминесценции при рН 8 и рН 6. Сравнение этих спектров позволяло выявить наименее рН-чувствительные мутанты. 4.6.3. Получение лизатов клеток для оценки спектральных свойств мутантов и их устойчивости кДМСО В 5 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, растили культуру клеток XLlblue, несущих плазмиду pLR3 с исследуемой мутацией, в бакпечатках при 37С в течение 16 ч, до насыщения. Затем вносили 100 мкл этой культуры в 4 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, растили при 22С в течение 1,5-2 суток. Центрифугированием осаждали 3 мл культуры в 1,5 мл микропробирку, замораживали осадок на -70С. Для получения лизата размораживали осадок в снегу, добавляли 450 мкл буфера для лизиса (0,1 М Na-фосфатный буфер, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1% неонол, 0,5 % Тритон Х-100, рН 8.0) и 50 мкл раствора 10 мг/мл лизоцима. Ресуспендировали осадок пипеткой до гомогенности. Оставляли на 1,5-2 часа в снегу, изредка перемешивая переворачиванием пробирки. Осаждали клеточные стенки центрифугированием при 14 тыс. об/мин в течение 2 мин, ставили обратно в лед. 4.6.4. Скрининг для отбора мутантов с повышенной устойчивостью кДМСО Для первичного скрининга клонов по активности в присутствии ДМСО применяли схему, основанную на использовании лизиса реплик библиотеки клеточных колоннії на мембранных фильтрах (рис. 12), которая была составлена на основе методик, описанных в работах [202, 219, 220]. Продукт лигирования, полученный после случайного мутагенеза, трансформировали в клетки Е. coli XLlblue, так чтобы в итоге получалось 1-3 тысячи колоний на 90 мм чашку Петри, инкубировали чашки в течение ночи при 37С. Когда диаметр колоний достигал 0,5 мм, колонии переносили на стерильные нейлоновые мембраны Hybond-N («Amersham», США), которые помещали на чашки со средой LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. Подращивали исходные колонии и реплики на мембранах около 1 часа при 37С, затем 2-4 часа при комнатной температуре. После этого помещали чашки с мембранами в холодильник на 8С. Мембраны с клетками последовательно помещали на фильтровальную бумагу (на дне чашек Петри), пропитанную следующими растворами: а) раствор для пермеабилизации клеточных стенок (50 мМ Трис-НС1, 5 мМ ЭДТА, рН 7.7, 1 мг/мл лизоцим) в течение 1 часа при комнатной температуре; б) лизирующий раствор (10 мМ Трис-НС1, 13 мМ Na2S04, 1 мМ ЭДТА, рН 7.7, 1% Тритон Х-100) в течение 1 ч, 4-8С.
Обработанные таким образом мембраны помещали на фильтровальную бумагу, пропитанную раствором 50 мМ Трис-ацетат, 0,5 мМ 1Л\2, 2 мМ АТФ, 10 мМ MgSC 4, 2 мМ ЭДТА, рН 7.8, 35-40% ДМСО. Перед перенесением мембраны на фильтровальную бумагу с каждым новым раствором она сначала помещалась на специальную бумагу, впитывающую практически весь раствор из мембраны. Далее в темном помещении производилось фотографирование светящихся колоний. После этого колонии обычно переносили на бумагу, впитывающую раствор с ДМСО, а потом на фильтровальную бумагу, пропитанную раствором 50 мМ Трис-ацетат, 0,5 мМ LH2, 2 мМ АТФ, 10 мМ MgS04, 2 мМ ЭДТА, рН 7.8. После этого снова производилось фотографирование биолюминесценции. Это позволяло оценить соотношение яркости колоний в отсутствие ДМСО. Наиболее яркие колонии, выявленные после скрининга по анализу фотографий, отбирали для вторичного скрининга. С помощью данной методики можно производить скрининг по устойчивости к ДМСО 1000-3000 колоний на чашку, наиболее удобно - 1500-2000. Для отобранных мутантов проводили вторичный скрининг по активности in vivo и устойчивости к ДМСО in vitro. Мутанты, отобранные после первичного скрининга, переносили на две чашки Петри. Для сравнения на эти же чашки переносили несколько колоний WT-люциферазы. Для одной из чашек проводилась регистрация биолюминесценции in vivo. Для колоний мутантов, имеющих яркость свечения WT, получали лизат клеток, содержащий люциферазу, разбавляли его в 100 раз в буфере для измерения активности, затем ещё в 6 раз в том же буфере и выдерживали 20 мин в снегу для установления равновесия. Затем определяли остаточную активность люциферазы при 30% ДМСО. Мутанты, проявляющие наиболее высокую устойчивость, отбирали для следующего цикла мутагенеза и выделения в чистом виде. В экспериментах по повышению термостабильности люциферазы проводили случайный мутагенез участков Nhel-BgHI (1-1180 bp) и Xhol-Bglll (395-1180 bp) в гене люциферазы. Состав реакционной смеси был аналогичен описанному выше для мутагенеза участка Nhel-BamHI за исключением концентрации Мп2+, которая подбиралась для достижения необходимой частоты мутаций. Условия ПЦР также не изменялись за исключением праймеров и времени элонгации при отжиге праймеров.
Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза
Среди первых 225 аминокислотных остатков лгоцифераз светляков в литературе описаны только три мутации, влияющие на спектр биолюминесценции: F16R, V182K, которые немного уменьшали рН-чувствительность спектра [27], и замены R220 [77, 126], входящего в состав активного центра. Данный участок преимущественно составляет первый субдомен люциферазы (1-190 остатки) и 35 остатков из второго субдомена, основная часть которых (194-210 остатки) формирует высококонсервативную петлю, участвующую в связывании АТФ. Для выяснения роли остатков первого субдомена в определении спектра биолюминесценции люциферазы был проведен случайный мутагенез этого участка в люциферазе светляков Luciola mingrelica и получен ряд мутантных ферментов со спектрами биолюминесценции, отличающимися от таковых для WT-люциферазы. В частности, были получены мутанты, спектры биолюминесценции которых оказались малочувствительными к изменению рН. При случайном мутагенезе оптимальной является работа с библиотеками мутантов, имеющих около одной замены аминокислотных остатков на мутируемом участке, что соответствует 2-3 заменам нуклеотидов. При более высоких частотах мутагенеза доля активных клонов резко падает, а количество возможных вариантов превышает возможности скрининга [179]. Для некоторых субтилизинов такая частота мутагенеза соответствует получению 50-60% активных клонов [217, 238] (т.е. обладающих 10% исходной активности). Ввиду значительно меньшей стабильности люциферазы для неё эта доля может быть ниже [239]. Случайный мутагенез проводили методом ПЦР пониженной точности (error prone PCR). В этом методе частота мутагенеза контролируется изменением концентрации Мп2+ в реакционной смеси. Мы проводили мутагенез участка длиной 680 Ьр. По литературным данным [238, 240] частота 2-3 замены на участок в этом случае может достигаться при использовании 0,2 мМ Мп+, однако результаты могут заметно различаться в зависимости от свойств гена, используемых реагентов и протокола.
Была проведена оценка числа активных клонов при различных концентрациях Мп2+: при 0,5 мМ наблюдалось примерно 35% активных клонов из 2000, при 0,3 мМ - около 40%, при 0,2 мМ - около 48%. Для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация 0,2 мМ Мп2+. 3.1. Отбор мутантов с измененным спектром биолюминесценции In vitro WT-люцифераза генерирует желто-зеленое свечение в рН-оптимуме активности (рис. 28а). Но у колоний Е. coli, экспрессирующих WT-люциферазу, в условиях in vivo наблюдалось желто-оранжевое свечение (рис. 286). По-видимому, это вызвано пониженным значением внутриклеточного рК при используемых условиях выращивания клеток, что приводит к увеличению доли «красной» компоненты в спектре биолюминесценции люциферазы. Аналогичный эффект наблюдали для люциферазы светляков P. pyralis: цвет биолюминесценции в клетках Е. coli изменялся от зеленого до красного в зависимости от состава культуральной среды [241]. При скрининге колоний по цвету биолюминесценции мы обнаружили две группы мутантов. Часть колоний были зеленоватого цвета в отличие от желтых колоний WT-люциферазы. Зеленый цвет колоний объяснялся меньшей рН-чувствительностью спектра биолюминесценции этих мутантов. На рисунке 286 показано свечение колоний двух таких найденных мутантов: у мутанта Y35N цвет свечения in vivo совпадает с наблюдаемым in vitro, у мутанта F16L наблюдается зелено-желтое свечение, свидетельствующее о промежуточной рН-чувствительности. Другая группа колоний проявляла оранжевое и оранжево-красное свечение, что свидетельствует о преобладании в их спектре красной компоненты. В ходе первичного скрининга проанализировали около 3000 колоний, полученных случайным мутагенезом WT-люциферазы. Также проанализировали около 3000 колоний, полученных на основе мутанта МТ8. Этот мутант имел спектральные свойства, аналогичные WT-люциферазе, но проявлял более высокую устойчивость к ДМСО (см. ниже раздел 4). В ходе скрининга отобрали примерно 50 колоний мутантов, которые отличались по цвету биолюминесценции от WT, и при этом сохраняли высокую яркость свечения. На рисунке 29 показан пример скрининга чашки с -700 колониями. Максимальное количество колоний, для которых можно проводить скрининг на одной чашке лимитируется возможностью получения индивидуальных колоний при рассеве, обычно удобно проводить скрининг 2-3 тысяч колоний. В ходе вторичного скрининга сравнивали цвет и яркость биолюминесценции колоний с этими мутантами в одинаковых условиях роста. Для 31 мутанта, наиболее интересных с точки зрения цвета и яркости, были получены лизаты клеток. Спектры биолюминесценции лизатов были получены при рН 7.8 и 6.0 для предварительной оценки формы спектров в рН-оптимуме активности и рН-чувствительности мутантов.
Для дальнейшего изучения были отобраны 7 мутантов: четыре мутанта с почти рН-нечувствительным спектром биолюминесценции: МТ1, МТЗ, МТ4, МТ6; один мутант с промежуточной рН-чувствительностью (МТ2); один «оранжевый» мутант (МТ5) и более стабильный мутант МТ8. Соответствующие замены остатков были определены с помощью секвенирования (табл. 10). Мутанты МТ5 и МТ6 были получены на основе мутанта МТ8, остальные - на основе WT-люциферазы. На рисунке 30 показана биолюминесценция колоний Е. coli, экспрессирующих отобранные мутанты. Пять мутантов с пониженной рН-чувствительностью (МТ1-МТ4, МТб) и мутант МТ8 переклонировали из плазмиды pLR3 в pETL4 по сайтам рестрикции Nhel и ВатШ. Хотя яркость и цвет биолюминесценции колоний мутанта МТ1 были одинаковы с мутантами МТЗ, МТ4 (рис. 30), при экспрессии гена мутанта МТ1 в жидкой культуре уровень биолюминесценции клеток была крайне низким, поэтому его дальнейшее выделение и изучение не проводилось. Остальные мутантные и WT-люцифераза были наработаны и очищены (N-Hise-luc). Степень чистоты полученных препаратов была 90% . по данным SDS-электрофореза. Для выделенных ферментов были изучены каталитические свойства, термостабильность при 42С и получены спектры биолюминесценции при различных условиях. Результаты приведены таблице 11. Удельная активность полученных мутантов составляла 20-130% от удельной активности WT-люциферазы. Повышенная удельная активность мутанта МТ8, вероятно, объясняется его большей термостабильностью. Для всех мутантных ферментов сохранялась колоколообразная зависимость активности от рН с максимумом активности при рН 7.8-8.0, как и для WT-фермента. Процесс термоинактивации при 42С мутантов описывается простой экспонентой, поэтому термостабильность люциферазы характеризовали временем полуинактивации (?\п) (табл. 11). Термостабильность мутанта МТ8, содержащего замену S118C, была почти в два раза выше, чем у WT-люциферазы. Этот остаток находится внутри белковой глобулы, окружение его в основном гидрофобное, но он также образует водородную связь с остатком N199, и рядом находится молекула воды. По-видимому, замена гидрофильного внутреннего остатка Ser на гидрофобный Cys улучшает внутреннюю гидрофобную упаковку белка и таким образом повышает термостабильность молекулы. Термостабильность мутанта МТ2 не отличалась от таковой для исходной люциферазы, а другие мутанты были менее стабильны, чем фермент дикого типа. Понижение термостабильности мутантов МТЗ, МТ4 с заменами Y35N, Y35H также коррелирует с гидрофобностью: стабильность падает при-замене внутреннего гидрофобного остатка Туг на полярные остатки His или Asn.
