Введение к работе
Актуальность. В настоящее время люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo. Для расширения возможностей биолюминесцентного микроанализа возникла потребность в люциферазах, катализирующих эмиссию света в различной области видимого спектра. Химическая схема биолюминесцентной реакции и структура излучателя (оксилюциферина - OL) идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых, при этом максимумы спектров биолюминесценции варьируются в интервале 540-620 нм, что зависит от свойств микроокружения излучателя, локализованного в активном центре фермента. В связи с этим, изучение физико-химических свойств активного центра имеет важное фундаментальное и практическое значение.
Несмотря на то, что известна кристаллическая структура молекулы люциферазы светляков и строение ее активного центра в отсутствие и в присутствии субстратов и продуктов, нет полной и однозначной информации о влиянии микроокружения в активном центре на спектры испускания OL. Наиболее удобными и информативными для исследования люциферин-люциферазной системы светляков являются флуоресцентные методы, так как субстрат -люциферин (LH2) и продукт (OL) обладают флуоресцентными свойствами. Однако OL нестабилен в водных растворах, поэтому в качестве модели излучателя актуальным является использование его аналогов: диметилоксилюциферина (DMOL) и монометилоксилюциферина (MMOL).
Известно, что окончательное формирование активного центра, а, следовательно, и микроокружения излучателя, происходит только после присоединения обоих субстратов (LH2 и АТР) в результате конформационных изменений с образованием «закрытой» структуры, однако роль каждого субстрата в этом процессе не известна. Таким образом, актуальным является выяснение роли каждого субстрата в изменении конформации люциферазы при формировании ее активного центра.
К конформационным изменениям в белках весьма чувствительна флуоресценция остатков Тгр и Туг. Флуоресценция единственного остатка Тгр люциферазы Luciola mingrelica успешно использовалась в качестве маркера при
изучении взаимодействия люциферазы с люциферином и его аналогами.
Флуоресценция 19 остатков Туг люциферазы до настоящего времени не
исследована. Однако, преобладающее число остатков Туг, согласно литературным
данным, позволяет предположить существенный вклад тирозиновой
составляющей в собственную флуоресценцию люциферазы. В связи с этим, перспективным является использование флуоресценции остатков Туг и Тгр люциферазы в качестве маркеров фермент-субстратных взаимодействий и сопровождающих их структурных изменений.
Цели и задачи исследования: Цель работы - исследовать взаимодействие люциферазы с субстратами и их аналогами, с помощью флуоресцентных маркеров - диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина, а также собственных флуорофоров белка - остатков тирозина и триптофана.
В соответствии с целью, основными задачами исследования являются:
Изучить спектральные свойства и стабильность DMOL и MMOL, показать возможность их использования в качестве флуоресцентных маркеров.
Сравнить спектральные свойства DMOL и MMOL в буферном растворе, в комплексе с рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазами светляков L. mingrelica.
^ Определить возможность использования флуоресценции остатков Туг люциферазы светляков L. mingrelica в качестве маркера фермент-субстратных взаимодействий.
> Изучить влияние каждого субстрата на сродство люциферазы ко второму
субстрату методом флуоресцентного титрования.
Научная новизна. Показана возможность использования DMOL и MMOL в качестве флуоресцентных маркеров при изучении физико-химических свойств активного центра люцифераз светляков на основании подробного изучения их стабильности, спектральных свойств в растворителях и в комплексе с рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазами светляков L. mingrelica. Объяснено появление желто-зеленой флуоресценции (Хет=500нм) в щелочных растворах LH2, OL и их аналогов за счет образования сходных по строению продуктов разложения. Обнаружено, что в комплексе с люциферазой микроокружение DMOL обладает меньшей ориентационной поляризуемостью,
увеличивается кажущееся значение рК фенольной и гидрокситиазольной групп MMOL. Показано, что для люциферазы светляков Luciola mingrelica характерна флуоресценция не только единственного Тгр, но и остатков Туг (кет = 308 нм), которые использованы в качестве флуоресцентных маркеров при исследовании фермент-субстратных взаимодействий. Обнаружены два центра тушения молекулой АТР флуоресценции остатков Туг, по-видимому, соответствующих аллостерическому и активному центрам люциферазы. Показано, что связывание одного из субстратов затрудняет последующее присоединение другого субстрата.
Практическая значимость работы. Показана возможность использования DMOL и MMOL, а также собственных флуорофоров белка (Туг, Тгр) в качестве флуоресцентных маркеров при изучении физико-химических свойств активного центра люциферазы и фермент-субстратных взаимодействий.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных конференциях: 12-м и 13-м международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кембридж Великобритания, 2002 и Токио Япония, 2004), международной конференции «Биокатализ-2002» (Москва, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 101 ссылку. Работа изложена на 129 страницах, содержит 34 рисунка и 9 таблиц.
