Содержание к диссертации
Введение
1. Влияние структуры РНК на термодинамику и кинетику её взаимодействия с олигонуклеотидами 11
1.1. Введение 11
1.2. Методы исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК 12
1.3. Термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с РНК 16
1 3.1. Влияние структуры РНК на взаимодействие с комплементарными олигонуклеотидами 16
1.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с тРНК 24
1.4. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с РНК 29
1.5. Теоретические подходы расчета сродства олигонуклеотидов к структурированным участкам РНК 38
1.6. Сравнение активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных системах и культуре клеток in vitro с рассчитанными параметрами сродства к РНК-мишеням 41
2. Взаимодействие олигонуклеотидов с РНК: кинетические термодинамические и структурные аспекты 48
2.1. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с дрожжевой фенилаланиновой тРНК 48
2.1.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов. 48
2.1.2. Равновесная гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНК 50
2.1.3. Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с тРНК 61
2.2. Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с 171 -звенным фрагментом 23S рРНК, содержащем а-сарциновую петлю 69
2.2.1. Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов 69
2.2.2. Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК 72
2.2.3. Обсуждение данных по взаимодействию олигонуклеотидов с фрагментом ECAS171 РНК 78
2.3. Взаимодействия антисмысловых олигонуклеотидов с мРНК гена MDR 1 человека 82
2.3.1. Идентификация в структуре 5'-концевого фрагмента MDR 1 мРНК сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов 82
2.3.2. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с фрагментом MDR 1 РНК 91
2.3.3. Применение бис-пиренильных производных олигонуклеотидов для детекции ДНК в растворе 109
2.4. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с РНК 111
2.4.1. Гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКР|,е 111
2.4.2. Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с методов остановленной струи 119
2.4.3. Определение параметров Еа, АН и AS процесса гибридизации олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК. Механизм гибридизации. 128
2.5. Сильно-связывающиеся аналоги олигонуклеотидов (SB-ON) - путь увеличения эффективности гибридизации олигонуклеотидов с РНК 133
2.5.1. Сравнение взаимодействия SB-ONs с TPHKPhe из дрожжей с немодифицированными олигонуклеотидами 133
2.5.2. Гибридизация SB-ONs с тРНК*5116 в присутствии ионов магния 139
2.5.3. Определение минимального размера SB олигонуклеотида, способного связываться с тРНК6 140
3. Взаимодействие олигонуклеотидов с рнк in vitro в культуре клеток 145
3.1. Обращение р-гликопротеин опосредованной множественной лекарственной устойчивости (PGY/MDR1) с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и рибозимов 145
3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с MDR1 мРНК in vitro в культуре клеток 169
3.2.1. Выбор модели 169
3.2.2. Производные олигонуклеотидов, использованные для ингибирования экспрессии MDR 1 мРНК в клетках линии КВ-8-5 171
3.2.3. Метод тестирования внутриклеточной активности олигонуклеотидов 172
3.2.4. Ингибирование экспрессии MDR 1 мРНК в клетках КВ-8-5 антисмысловыми олигонуклеотидами 174
3.3. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов in vitro и их активности в культуре клеток 179
4. Взаимодействие рнк с химическими рибонуклеазами 181
4.1. Расщепление РНК конъюгатами 1,4.-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола 181
4.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз 181
4.1.2. РНК модели и схема эксперимента 182
4.1.3. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз 183
4.1.3.1. Специфичность расщепления РНК соединениями ABL3Cm 183
4.1.3.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и эффективность ее расщепления соединениями ABL3Cm 189
4.1.3.3. Влияние концентрации искусственных рибонуклеаз на скорость расщепления РНК 191
4.1.3.4. Кинетика расщепления РНК химическими рибонуклеазами ABL3Cm 194
4.1.4. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК соединениями ABL3Cm 202
4.1.4.1. Влияние природы буфера на эффективность расщепления РНК 202
4.1.4.2. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК соединениями ABL3Cm 204
4.1.5. Механизм расщепления рнк под действием химических рибонуклеаз 205
4.1.5.1. Определение продуктов, образующихся в месте расщепления РНК соединениями ABL3Cm 205
4.1.5.2. Влияние рН на скорость расщепления РНК соединениями ABL3Cm 208
4.1.5.3. Определение сродства соединений ABL3Cm к РНК 209
4.1.5.4. Доказательство каталитического характера расщепления РНК под действием соединений ABL3Cm 210
4.2. Применение искусственных рибонуклеаз для исследований структуры РНК в растворе 212
4.2.1. Пробинг вторичной структуры митихондриальных тРНК*"1" дикого Tnna(Kwt) и содержащей замену (А9->С) (Krw) 212
4.2.2. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа 216
4.3. Расщепление РНК с помощью конъюгатов пептида [LeuArg]4-Gly-NH2 и олигонукпеотидов со случайной последовательностью 223
4.3.1. Дизайн олигонуклеотид-пептидных конъюгатов и РНК-мишени 223
4.3.2. Эффективность и специфичность расщепления РНК олигонуклеотид- пептидными конъюгатами 224
4.3.3. Контроль специфичности расщепления РНК 234
4.3.4. Исследование возможности взаимодействия между РНК и олигонуклеотидом в составе конъюгата 235
4.3.5. Определение кинетических параметров расщепления РНК конъюгатами рер-Л, рер-7 и рер-16 237
4.3.6. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК 245
4.3.7. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления 247
4.3.8. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 248
4.3.9. Природа специфичности к последовательности РНК олигонуклеотид- пептидных конъюгатов 253
4.3.10. Влияние структуры конъюгатов на эффективность расщепления РНК 255
5. Направленная модификация или расщепление РНК с помощью реакционноспособных конъюгатов олигонуклеотидов 258
5.1. Сайт-направленная модификация лидерной области thrS мРНК с помощью алкилирующих производных антисмысловых олигонуклеотидов 258
5.2. Сайт-направленная модификация фрагмента MDR1 мРНК конъюгатами антисмысловых олигонуклеотидов с блеомицином, фталоцианином и перфторарилазидом 267
5.2.1. РНК-мишень и конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов 267
5.2.2. Исследование специфичности связывания олигонуклеотидов и конъюгатов с РНК190 270
5.2.3. Реакции фрагмента MDR1/PGY1 м РНК и ДНК с конъюгатами олигонуклеотидов 271
5.2.4. Обсуждение результатов 277
5.3. Направленное расщепление РНК конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом 280
5.3.1. Исследование взаимодействия конъюгата рер-1 А с тРНК^з 281
5.3.2. Рибонуклеазная активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 285
5.3.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению РНК олигонуклеотид-пептидным конъюгатом 290
5.4. Направленное расщепление РНК с помощью конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями 293
5.4.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов и выбор РНК-мишени 294
5.4.2. Направленное расщепление тРНК" конъюгатами олигонуклеотидов, содержащими моно- и бис-имидазольные конструкции, полученными методом постсинтетической модификации 295
5.4.3. Направленное расщепление тРНК"1* конъюгатами олигонуклеотидов, несущими дендримерные имидазолсодержащие конструкции 304
5.4.4. Заключение 324
6. Экспериментальная часть 327
Выводы 361
- Методы исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК
- Сравнение активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных системах и культуре клеток in vitro с рассчитанными параметрами сродства к РНК-мишеням
- Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с 171 -звенным фрагментом 23S рРНК, содержащем а-сарциновую петлю
- Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с методов остановленной струи
Введение к работе
ВВЕДЕНИЕ
Молекулы РНК выполняют множество функций, участвуя в переносе генетической информации, биокаталитических реакциях в ходе процессинга мРНК, трансляции, а также в регуляции экспрессии генов [1, 2, 3, 4]. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК. В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о существовании неизвестных ранее регуляторных клеточных процессов и систем взаимодействия клеток, в которых ключевую роль играет РНК [5, 6, 7, 8]. В связи с важной биологической ролью определенных РНК, актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК для регуляции биологических процессов в клетках в исследовательских целях и с целью создания терапевтических препаратов для инактивации геномов инфекционных агентов и подавления экспрессии генов, ответственных за развитие различных патологических состояний.
Эффективным способом регуляции количества определенных РНК в клетке может служить их избирательное расщепление с помощью специфических агентов, распознающих определенные нукпеотидные последовательности. Прямым подходом к созданию таких искусственных сверхспецифичных рибонуклеаз является конструирование конъюгатов олигонуклеотидов, образующих комплементарные комплексы с определенными нуклеотидными последовательностями РНК, с молекулами, расщепляющими фосфодиэфирные связи [9,10].
К настоящему времени наиболее обещающие результаты в области направленного воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты были получены при использовании аналогов антисмысловых олигонуклеотидов, которые образуют комплексы с комплементарными последовательностями РНК [11, 12]. Идентификация оптимальных последовательностей-мишеней для олигонуклеотидов является одной из основных проблем направленного воздействия на РНК [13].
Укладка РНК в сложную пространственную структуру, стабилизированную внутримолекулярными взаимодействиями между петлями, а также взаимодействиями с ионами двухвалентных металлов и белками, является основным фактором, препятствующим связыванию олигонуклеотидов с этими биополимерами. В физиологических условиях в составе природных РНК открытые, неструктурированные участки практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нуклеотидных последовательностей [14, 15]. Наиболее распространенными элементами вторичной структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные
Введение
W нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли, взаимодействия
между которыми, сопровождающиеся образованием псевдоузлов, определяют формирование биологически активной трехмерной структуры РНК [16, 17]. Шпилечные структуры являются сайтами узнавания для регуляторных белков в процессе транскрипции и трансляции. Взаимодействие между определенными шпильками РНК является ключевым этапом при узнавании РНК природными антисмысловыми РНК [18], а также в процессе димеризации ретровирусных РНК, приводящем к
^ формированию биологически активного диплоидного генома ретровирусов [19, 20].
Характерной чертой этих взаимодействий является перестройка структур шпилек в процессе взаимодействия [21, 22]. Механизм взаимодействия различных шпилек определяется размерами и последовательностями петли шпильки и структурой ее стебля. Последовательность петли и положение участка связывания оказывают большое влияние на эффективность взаимодействия с ней комплементарного олигонуклеотида [23].
Исследование процесса гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in
Л vitro необходимо для выявления факторов, контролирующих эффективность этого
процесса, и установления параметров, определяющих активность антисмысловых олигонуклеотидов в клетках. Прогресс в этой области осложнен рядом методических трудностей работы с высокомолекулярными РНК и требует разработки точных и нетрудоемких экспериментальных методов определения количественных характеристик гибридизации олигонуклеотидов с природными РНК in vitro. Для выявления оптимальных сайтов-мишеней для антисмысловых олигонуклеотидов и выявления факторов, определяющих их эффективность, необходимо сравнение гибридизации олигонуклеотидов с РНК in vitro с их биологической активностью.
Проблема создания низкомолекулярных катализаторов, способных расщеплять
|р РНК в физиологических условиях с высокой эффективностью, представляет
самостоятельный интерес. Такие соединения могут быть применены для исследования структуры РНК и РНК-белковых комплексов, а также в качестве катализаторов разрушения РНК в ходе биотехнологических процессов. Известно значительное число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК. К ним относятся комплексы некоторых металлов [24, 25, 26], органические соединения, содержащие низкоосновные аминогруппы [27] и остатки имидазола [28, 29, 30], а также конструкции на основе олиго- и полипептидов [31, 32]. Однако, в физиологических условиях эти вещества расщепляют РНК с низкой эффективностью.
До сих пор не удалось установить механизмы, определяющие специфичность
Щ расщепления РНК олигонуклеотидными конъюгатами разной природы. По
Введение
невыясненным причинам некоторые каталитические конструкции проявляют выраженное предпочтение к фосфодиэфирным связям, находящимся в определенных последовательностях [33, 34]. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоспецифичных соединений, способных расщеплять РНК с высокой эффективностью в физиологических условиях.
Целью настоящей работы являлось комплексное решение фундаментальной проблемы направленного воздействия на природные высокомолекулярные РНК с помощью низкомолекулярных соединений - катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей и конъюгатов олигонуклеотидов, специфически расщепляющих или модифицирующих РНК.
В ходе исследования решались следующие задачи:
-исследование закономерностей и механизма гибридизации олигонуклеотидов с природными высокомолекулярными РНК: дрожжевой тРНК"16, 171-звенным фрагментом 23S рРНК Е. coli, 678-звенным б'-концеввм фрагментом MDR1 мРНК;
-выявление в структуре MDR 1 мРНК участков, доступных для взаимодействия с олигонуклеотидами; сопоставление данных об эффективности гибридизации олигонуклеотидов с мРНК MDR 1 in vitro и активности этих антисмысловых олигонуклеотидов в культуре клеток;
-исследование расщепления РНК под действием низкомолекулярных соединений, способных катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК; изучение влияния структуры конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК и возможности применения таких соединений для пробинга структуры РНК в растворе;
-изучение закономерностей протекания реакции направленной
модификации/расщепления РНК под действием конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов различной природы; выяснение закономерностей протекания реакции и выявление факторов, определяющих эффективность модификации или расщепления РНК в комплексе с конъюгатом.
Методы исследования взаимодействия олигонуклеотидов с РНК
Равновесный диализ был одним из первых методов измерения параметров гибридизации олигонуклеотидов с РНК [71, 72]. РНК и олигонуклеотид помещаются по разные стороны мембраны, проницаемой для олигонуклеотида и непроницаемой для РНК (вследствие различий в размерах этих молекул). Термодинамический потенциал диффузии составляет сумму потенциалов градиента концентрации и связывания олигонуклеотида с РНК-мишенью. Диффузия олигонуклеотида из одной ячейки в другую контролируется с помощью детекции оптической плотности или радиоактивности (в случае радиоактивно меченного олигонуклеотида). По достижению равновесного состояния, исходя из изменения содержания взаимодействующих Щ компонентов в камерах, содержащих олигонуклеотид и РНК, можно рассчитать равновесную константу связывания олигонуклеотида с РНК. Этот достаточно простой и достоверный подход не нашел, однако, широкого применения, главным образом, вследствие длительности эксперимента, связанной с необходимостью достижения равновесия, и ограничений по длине олигонуклеотида, определяемых проницаемостью мембраны. Простым и распространенным, но не количественным методом оценки способности олигонуклеотидов взаимодействовать с РНК, является гибридизация олигонуклеотидов с РНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозной мембране [73, 74]. Необратимая сорбция молекул РНК на нитроцеллюлозной мембране % осуществляется с помощью облучения УФ светом. Радиоактивно меченый олигонуклеотид инкубируется определенное время с мембраной, содержащей иммобилизованную РНК. Затем, после удаления не связавшегося олигонуклеотида с помощью процедуры отмывки, эффективность гибридизации оценивают по радиоактивности мембраны, которая пропорциональна количеству олигонуклеотида, связывавшегося с РНК. Однако, данный подход не гарантирует сохранение пространственной структуры РНК в условиях сорбции и гибридизации. В последние годы широкое распространение получили подходы, основанные на изменении интенсивности флуоресценции метки (меток), присоединенной к олигонуклеотиду, происходящей вследствие комплексообразования с РНК-мишенью. Щ Возможно несколько вариантов использования флуоресцентных методов для изучения взаимодействия РНК с олигонуклеотидами.
В случае одной метки, например, на олигонуклеотиде, можно детектировать либо тушение флуоресценции (75, 76, 77], либо изменение вращательной диффузии (флуоресцентно-корреляционный анализ [78, 79, 80]. При наличии двух разных меток можно следить как за изменением флуоресценции (пара флуорофор-тушитель), так и за переносом энергии [70, 81, 82] (пара донор-акцептор), происходящих из-за изменения взаимного пространственного расположения меток вследствие комплексообразования. Эти методы, особенно флуоресцентно-корреляционный анализ [78, 79, 80], позволяют исследовать быстрые процессы, протекающие при гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК. Метод задержки в геле [23, 83, 84] удобен не только для изучения эффективности гибридизации олигонуклеотидов с РНК, но также позволяет установить стехиометрию комплексообразования и выявить комплексы различного типа. После гибридизации олигонуклеотидов с РНК анализ проб проводят с помощью электрофореза в нативном ПААГ. Метод основан на различии электрофоретической подвижности свободной РНК и РНК, связанной с олигонуклеотидом, а также на влиянии структуры и стехиометрии комплексов олигонуклеотид(ы)-РНК на их подвижность в геле. Анализ гибридизации олигонуклеотидов с РНК методом задержки в геле проводят, используя радиоактивно меченые или олигонуклеотид, или РНК-мишень, что позволяет более разносторонне исследовать процесс гибридизации. Однако, при использовании данного подхода наибольшие систематические искажения данных могут возникнуть при вхождении проб в гель вследствие внесения некоторых искажений в условия взаимодействия компонентов. Интересным подходом для измерения равновесных констант связывания ф является метод сайт-направленной модификации нуклеиновой кислоты-мишени реакционно-способными производными олигонуклеотидов [85, 86, 87, 88, 89, 90, 91]. Впервые этот метод определения равновесных констант был сформулирован в работах [85, 86] и получил свое дальнейшее развитие для сайт-направленной модификации структурированных ДНК [87, 88] и РНК [89, 90, 91]. Этот подход, в случае алкилирующих производных, можно использовать только для изучения стационарных состояний системы олигонуклеотид - РНК, так как время полупревращения алкилирующей части реагента много больше времени образования комплекса между нуклеиновыми кислотами. РНК инкубируют с реакционно-способным производным комплементарного ей олигонуклеотида; в комплексе олигонуклеотид«РНК происходит Щ ковалентная сшивка молекул вследствие реакции алкилирования. Зависимость w предельных по времени значений степени модификации РНК от концентрации реакционно-способного производного олигонуклеотида позволяет рассчитать равновесную константу гибридизации. Данный метод предполагает использование радиоактивно меченых или РНК-мишени, или производного олигонуклеотида.
Метод гибридизации на «микрочипах» [39, 92, 93, 94, 95, 96] является одним из перспективных подходов, позволяющих одновременно проанализировать связывание широкого набора олигонуклеотидов разной длины с одной РНК- мишенью. 4г Возможно использование различных твердофазных носителей для иммобилизации олигонуклеотидов, например, стекла [39, 92. 96] или полиакриламидного геля [93]. По своему исполнению этот метод похож на метод гибридизации на фильтрах: радиоактивно меченую РНК инкубируют с олигонуклеотидным «микрочипом», затем, после удаления несвязавшейся РНК, по количеству радиоактивной метки определяют эффективность гибридизации того или иного олигонуклеотида. Этот метод за счет возможности одновременного анализа большого набора олигонуклеотидов получил в последнее время широкое применение. Гибридизация на микрочипах позволяет ф использовать флуоресцентно меченую РНК и проводить одновременный анализ кривых термической денатурации комплексов олигонуклеотид РНК. Следует отметить, что при гибридизации на «микрочипах» некоторые искажения в эффективность связывания РНК с олигонуклеотидами могут быть внесены за счет того, что гибридизация происходит в гетерофазной системе, в частности, за счет стерических факторов, связанных с ориентацией олигонуклеотида относительно матрицы [92, 95]. Для поиска участков РНК, доступных для связывания с олигонуклеотидами, широко применяются комбинаторные подходы, основанные на использовании библиотек олигонуклеотидов [97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108]. После гибридизации библиотеки олигонуклеотидов с РНК-мишенью проводят либо разделение свободных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов, связавшихся с РНК, с помощью гель-электрофореза [98, 108], либо идентификацию сайтов связывания олигонуклеотидов путем расщепления РНК в комплексе с олигонуклеотидами с помощью РНКазы Н [100, 101, 102, 103]. Этот подход позволяет в одном эксперименте определить участки, благоприятные для связывания олигонуклеотидов, даже в высокомолекулярных природных РНК. Существуют различные типы используемых библиотек олигонуклеотидов: во-первых, набор олигонуклеотидов заданной длины с полностью или частично случайной последовательностью [97, 100, 102, 105]; во-вторых, частичный статистический гидролизат комплементарной ДНК или РНК с некоторым распределением олигонукпеотидов по длине [98, 99]; в-третьих, библиотеки ф модифицированных олигонуклеотидов [107, 108] Косвенные данные по связыванию олигонукпеотидов с РНК можно получить из результатов по ингибированию активности РНК в различных бесклеточных тест-системах (аминоацилирования, трансляции) [109, 110]. Например, в работе [109] фракцию суммарной тРНК Е. coli отжигали с соответствующим олигонуклеотидом и обрабатывали комплекс РНКазой Н. Затем тестировали акцепторную активность тРНК.
Сравнение активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных системах и культуре клеток in vitro с рассчитанными параметрами сродства к РНК-мишеням
В данном разделе будут рассмотрены работы, в которых были предприняты попытки проанализировать активности антисмысловых олигонуклеотидов в бесклеточных тест-системах и культурах клеток in vitro в зависимости от стабильности образуемых комплексов с мРНК-мишенью [190, 200, 201]. Для оценки стабильности комплексов олигонуклеотид-мРНК в приближении двухкомпонентной системы (олигонуклеотид и РНК-мишень) необходимо учитывать как стабильность пространственной структуры РНК в сайте гибридизации, так и стабильность образуемого гетеродуплекса. В работе [200] авторы для оценки стабильности комплекса олигонуклеотид-мРНК предложили три индекса: Sscore, Dscore и Cscore, где Sscore представляет собой энергию вторичной структуры в сайте гибридизации олигонуклеотида, Dscore является стабильностью образуемого гетеродуплекса, конкурентный индекс Cscore = Sscore - Dscore. Структура мРНК-мишеней была получена с помощью компьютерного моделирования. Экспериментальные данные по активности олигонуклеотидов в бесклеточной системе трансляции (лизата ретикулоцитов кролика) были взяты из работ [202, 203, 204] по подавлению трансляции мРНК дигидрофолат редуктазы (ДГФР) человека и р-глобиновой мРНК кролика с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Индексы корреляции активности олигонуклеотидов с предложенными индексами приведены в таблице 6. Видно, что в случае подавления трансляции мРНК ДГФР наблюдаются хорошие корреляции как с Dscore, так и с Cscore индексами. Данные подавления трансляции р-глобиновой мРНК в системе лизата ретикулоцитов кролика, полученные в работе [203], не коррелировали ни с одним из индексов. Из данных этой работы следовало, что наибольшей ингибирующей активностью обладают олигонуклеотиды, направленные в район кзпа или стартового кодона, по сравнению с олигонуклеотидами, направленными в другие районы мРНК. Для экспериментальных данных, полученных с использованием бесклеточной системы трансляции на проростках пшеницы [204], была обнаружена корреляция индекса Dscore с ингибирующей активностью олигонуклеотидов, комплементарных р-глобиновой мРНК кролика. Такие различия в активности антисмысловых олигонуклеотидов связаны, очевидно, с различными механизмами их действия.
Так, в системе из проростков пшеницы, где активность РНКазы Н высока, связывание олигонуклеотида независимо от области приводит к деградации мРНК в составе гетеродуплексах за счет гидролиза РНКазой Н. Формирование более стабильных гетеродугшексов приводит к большей чувствительности к РНКазе Н и, соответственно, к большей ингибирующей активности олигонуклеотидов. Напротив, в системе лизата ретикулоцитов кролика активность РНКазы Н очень низка по сравнению с бесклеточной белок-синтезирующей из проростков пшеницы. Таким образом, в системе ретикулоцитов кролика олигонуклеотиды, скорее всего, действуют по РНКаза Н-независимому механизму, физически блокируя трансляцию [205]. Ингибирование трансляции мРНК с помощью антисмысловых олигонуклеотидов изучалось в различных культивируемых линиях клеток: мРНК с-тус в клетках HL-60 [206] и мРНК ICAM-1 в клетках HUVEC и А549 [207]. В работе [206] в качестве мишени для антисмысловых олигонуклеотидов был выбран район между 5 кэпом и десятым кодоном мРНК с-тус. Предполагалось, что олигонуклеотиды могут связываться с комплементарными последовательностями, содержащимися как в мРНК, так и в ее предшественнике гяРНК. При анализе индексов с учетом сплайсированной и несплайсированной форм транскриптов только индекс Dscore обладал значимой корреляцией с активностью олигонуклеотидов (таблице 7). Коэффициент детерминации при использовании в расчетах несплайсированной формы транскрипта с-тус оказался немного выше (R2 = 0,497, Р 0,02) по сравнению со сплайсированной формой мРНК (R2 = 0,437, Р 0,05). Авторы полагают, что такое различие обусловлено наличием дополнительного сайта связывания для одного из олигонуклеотидов в случае гяРНК. В работе [204, 208] были использованы фосфоротиоатные аналоги олигонуклеотидов для подавления цитокин-индуцированной экспрессии гена ICAM-1 в линиях клеток человека HUVEC и А549. Сайты комплементации 10-ти тестированных олигонуклеотидов были распределены по всей длине мРНК. В качестве параметра активности олигонуклеотидов был использован процент ингибирования при 0,06 мкМ концентрации олигонуклеотида для клеток HUVEC и при 0,8 мкМ концентрации для клеток А549. Для всех 10-ти олигонуклеотидов в обеих клеточных линиях индекс Dscore хорошо коррелировал с активностью олигонуклеотидов (R2 = 0,658 (Р 0,005) для HUVEC; R2 = 0,489 (Р 0,02) для А549), в то время как с индексами Sscore и Cscore не наблюдалось значимых корреляций в обеих клеточных линиях. Активности фосфоротиоатных аналогов антисмысловых олигонуклеотидов в подавлении экспрессии гена MDR1 [103], определенные с помощью родаминового Щ теста [209], были проанализированы в работе [190]. Участки связывания для 20 из 22 олигонуклеотидов в структуре мРНК гена mdr-1 были выбраны на основании высокой эффективности гидролиза комплексов с помощью РНКазы Н. Вторичная структура первых 800 нуклеотидов мРНК была предсказана по методу [210]. Эффективность связывания олигонуклеотида рассчитывалась двумя способами: просто как стабильность гетеродуплекса, и с учетом разворачивания вторичной структуры РНК в сайте связывания олигонуклеотида. Оказалось, что эффективность олигонуклеотидов в и подавлении экспрессии гена MDR1 коррелирует со стабильностью гетеродуплексов с коэффициентом корреляции 0,91, то есть параметром, не учитывающим вторичную структуру РНК.
При учете вторичной структуры РНК значимых корреляций с антисмысловой активностью олигонуклеотидов не наблюдалось. Интересный подход для анализа влияния вторичной структуры был применен в работе [201]. Авторами генно-инженерным путем были получены мРНК с различной вторичной структурой около сайта гибридизации олигонуклеотида. Сайт связывания олигонуклеотида ISIS 5132, обладающего ингибирующей активностью по отношению к гену киназы c-raf человека, был клонирован в 5-UTR гена люциферазы репортерной плазмиды pGL3-Control. Последовательность, непосредственно примыкающую к сайту комплементации олигонуклеотида ISIS 5132, изменяли с целью получения различных локальных вторичных структур мРНК (Рис. 11), затрагивающих данный участок. Был получен набор мРНК, различающихся стабильностью вторичной структуры в участке связывания олигонуклеотида, который включал все структуры от самой стабильной шпильки с 20-звенным стеблем и сверхстабильной UUCG петлей (S20) до S0, в которой сайт связывания олигонуклеотида не оказывался вовлеченным в какую-либо вторичную структуру. мРНК S20-10-5, S20-10-3, S10-L4 и S10-L14 обладали промежуточной стабильностью локальных вторичных структур мРНК в области участка Л связывания олигонуклеотида. Как и можно было ожидать, наибольшую активность олигонуклеотид проявлял в случае S0 мРНК (IC50 60 нМ), в то время как наблюдалось лишь слабое ингибирование S20 мРНК даже при концентрациях олигонуклеотида 300-400 нМ. Для остальных мРНК наблюдалась средняя активность олигонуклеотида ISIS 5132 с 1С50 300-400 нМ. Стабильность комплексов олигонуклеотид-мРНК была оценена как сумма энергии, которую необходимо затратить на разворачивание вторичной структуры РНК в сайте связывания олигонуклеотида, и энергии образования гетеродуплекса между олигонуклеотидом и комплементарной открытой цепью РНК. Предсказанное значение AG для связывания олигонуклеотида ISIS 5132 с S0 мРНК мишенью составляет -22,1 ккал/моль, для связывания с S20 мишенью +6,1 ккал/моль. ik Значения энергий связывания с промежуточными по стабильности структуры РНК в came связывания мРНК составляли от -13,4 до -10,1 ккал/моль, что хорошо соответствует средней активности олигонуклеотида при использовании этих мРНК. В целом, эффективность действия олигонуклеотидов качественно, но не количественно, соответствовала значениям AG формирования комплекса, оцененным как стабильность гетеродуплекса с учетом локального разворачивания структуры РНК в участке связывания олигонуклеотида.
Исследование взаимодействия олигонуклеотидов с 171 -звенным фрагментом 23S рРНК, содержащем а-сарциновую петлю
Рибосомные РНК, наряду с транспортными РНК и РНК некоторых рибозимов, представляют собой молекулы с хорошо изученными пространственной структурой и функциями в биологических процессах, что обусловливает их удобство и перспективность в использовании в качестве мишеней для антисмысловых агентов. В частности, 23S и 28S рРНК содержат участок а-сарциновой петли, который представляется перспективной мишенью для разработки антисмысловых олигонуклеотидов, обладающих селективным антибактериальным или антимикотическим действием. Последовательность а-сарциновой петли находится в домене VIA 23S рРНК и представляет собой самый длинный (12 нт) консервативный участок рРНК [227, 228, 229]. Целостность а-сарциновой петли необходима для функционирования бактериальной рибосомы: гидролиз только одной фосфодиэфирной связи G2661-A2662 (нумерация согласно последовательности рРНК Е. coif) токсином а-сарцином из Aspergillus giganteus [230] или апуринизация в положении А2660 под действием рицина [231] приводят к блокированию элонгации синтеза полипептидной цепи и гибели клеток. Структура этого участка 23S рРНК достаточно хорошо изучена методами химического и ферментативного пробинга [232]. Кроме того, с помощью ЯМР установлена детальная структура 29-звенного фрагмента 28S рРНК [233], и с помощью рентгеноструктурного анализа изучена структура 27-звенного фрагмент 23S рРНК Е. coli, включающего в себя а-сарциновую петлю [234]. Согласно структурным данным, участок. а-сарциновой петли свернут в достаточно компактную структуру с образование шпильки с петлей GAGA, которая относится к GNRA семейству петель из 4-х оснований (N - любое, R - пуриновое основание), характеризующемуся повышенной стабильностью [235]. Шпильки GNRA семейства, наряду со UNCG шпильками, встречаются в природных РНК с крайне высокой частотой. Например, в рРНК 70% 4-х звенных петель принадлежит именно к этим двум классам [236]. Помимо нуклеации фолдинга РНК (инициирования сворачивания линейных форм РНК в пространственно-структурированные формы РНК) [237, 238, 239], 4-хзвенные петли GNRA часто участвуют в третичных взаимодействиях [240, 241, 242] и специфическом связывании белков [243]. Область а-сарциновой петли, как в целом и вся молекула 23S рРНК, высоко структурирована, и выбор участка связывания для комплементарного олигонуклеотида представляет собой интересную задачу.
Для выбора участка а-сарциновой петли, оптимального для связывания с олигонуклеотидами, проанализировали гибридизацию семи 15-звенных олигодезоксирибонуклеотидов с 171-звенным фрагментом 23S рРНК, содержащем участок а-сарциновой петли. 171-звенный фрагмента 2625-2795 23S рРНК (далее по тексту ECAS171PHK) получали с помощью реакции транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы фага Т7. В качестве матрицы был использован продукт ПЦР, полученный при помощи праймеров, один из которых содержал промотор Т7 РНК-полимеразы (см. Экспериментальную часть). Ввиду того, что вторичная структура изолированной последовательности домена VIA 23S рРНК может отличаться от структуры соответствующего участка в интактной 23S рРНК, были проведены эксперименты по пробингу структуры 171-звенного фрагмента 23S рРНК - ECAS171 РНК. Вторичная структура 171-звенного фрагмента ECAS171 23S рРНК Є coli была охарактеризована с помощью энзиматического пробинга РНКазами Т1, Т2, CL3, ONE, V1. Для этого 5 -[32Р]-меченный ECAS171 РНК-транскрипт инкубировали с соответствующей РНКазой, с последующим анализом продуктов гидролиза с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Результаты пробинга структуры ECAS171 РНК приведены на рис. 21 А-В. Вторичная структура ECAS171 совпадает со структурой VI домена 23S рРНК, определенной ранее с помощью химических и ферментативных зондов [232]. На рис. 22 показаны сайты связывания семи 15-звенных олигонуклеотидов комплементарных участку (2638-2682), длинной в 45 нуклеотидов включающему в себя район а-сарциновой петли. Участки связывания олигонуклеотидов представляют собой эквидистантный прогон с шагом в 5 нуклеотидов, то есть каждый последующий участок можно получить смещением предыдущего на пять нуклеотидов. Кроме того, сайты Гибридизацию выбранных олигонуклеотидов S1-S7 с ECAS171 РНК исследовали в физиологических условиях (рН 7,5, 0,3 М KCI, 37С в присутствии и отсутствие ионов магния) с помощью метода задержки в геле и футпринтинга РНКазой Н. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов S1-S7 в отсутствие ионов магния показано на рис. 23. Можно было ожидать, что олигонуклеотиды S1-S7, являясь 15-мерами, будут образовывать с ECAS171 РНК комплексы со сходной элекгрофоретическои подвижностью и будут отличаться только по степени связывания с РНК. Однако, олигонуклеотиды S1 - S7 гибридизовались с РНК по-разному. Связывания олигонуклеотидов S1 и S2, комплементарных району а-сарциновой петли с 5 стороны, не было зарегистрировано методом задержки в геле. Олигонукпеотид S3 образует один комплекс с РНК, в случае олигонуклеотидов S4 - S5 кроме основного комплекса, с электрофоретической подвижностью сходной с комплексом ECAS171 S3, образуется несколько минорных комплексов с меньшей электрофоретической подвижностью. Олигонуклеотиды S6 и S7 образуют с ECAS171 РНК один основной комплекс с аномально низкой электрофоретической подвижностью, а вклад дополнительных минорных комплексов незначителен.
Можно было ожидать, что изменение условий гибридизации повлияет на эффективности и характер гибридизации олигонуклеотидов. Однако, отжиг (гибридизация с предварительной термической денатурацией) РНК с олигонуклеотидами, добавление ионов магния и использование буфера связывания с низкой ионной силой (50 мМ какодилат-HCI, рН 7.2) принципиально не повлияло на соотношение эффективностей гибридизации олигонуклеотидов. После отжига олигонуклеотидов с ECAS171 РНК наблюдалось образование таких же комплексов и с такой же эффективностью, что и полученных путем инкубации олигонуклеотидов с РНК в равновесных условиях. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что после инкубации в течение 1 часа при 37С достигаются равновесные значения степеней связывания. Ни в одних условиях не было зарегистрировано образования комплекса РНК с олигонуклеотидами S1 или S2, и всегда наблюдалась гибридизация олигонуклеотидов S3 - S7. Стоит отметить, что при использовании буфера с низкой ионной силой не наблюдалось образование минорных комплексов с низкой электрофоретической подвижностью для олигонуклеотидов S4 и S5. Кроме того, при L\ гибридизации в буфере с низкой ионной силой, для олигонуклеотидов S6 - S7 наблюдается образование, кроме комплексов с низкой электрофоретической подвижностью, комплексов, характеризующихся такой же электрофоретической подвижностью, что и комплексы олигонуклеотидов S4 и S5 с ECAS171 РНК. Пониженная электрофоретическая подвижность основных комплексов, образуемых олигонуклеотидами S6 и S7, а также появление полосы с более высокой электрофоретической подвижностью, может свидетельствовать о том, что в данных условиях происходит образование агрегированных (двойных) комплексов. Аналогично, образование таких комплексов наблюдалось при взаимодействия олигонуклеотидов 1А и 1D с дрожжевой TPHKPhe (см. раздел 2.1). Первая молекула олигонуклеотида гибридизовалась в "правильном" комплементарном сайте, при этом происходило разворачивание структуры РНК. Вторая молекула олигонуклеотида связывалась с образованием несовершенного гетеродуплекса с одноцепочечным участком РНК, образовавшемся вблизи сайта связывания олигонуклеотида. В случае ECAS171 РНК, при гибридизации олигонуклеотидов S6 и S7 в "правильном" сайте потенциально могут образоваться достаточно протяженные одноцепочечные участки длинной в 19 и 24 нуклеотида, соответственно. При добавлении ионов магния происходит падение степеней связывания для олигонуклеотидов S3 и S7, что связано, видимо, со стабилизацией пространственной структуры РНК. Вероятно, олигонуклеотиды S3 и S7 оказались более чувствительны к присутствию ионов магния из-за относительно низких эффективностей связывания. Кроме того, в присутствии ионов магния заметно увеличивается число комплексов, характеризующихся низкой электофоретической подвижностью, особенно для олигонуклеотидов S5 - S7, что связано со стабилизацией РНК/ДНК гетеродуплексов ионами магния.
Исследование механизма гибридизации олигонуклеотида 1D с методов остановленной струи
Для детального исследования механизма взаимодействия олигонуклеотида 1D с тРНК" и, особенно, формирования метастабильного комплекса, в настоящей работе был использован метод остановленной струи ("stopped-flow"). Метод остановленной струи широко используется для изучения кинетики быстропротекающих (секунды или даже миллисекунды) процессов, в том числе и в биохимии [269]. Детекция протекания реакции может осуществляться различными способами: по изменению оптической плотности, спектров кругового дихроизма, флуоресценции или поляризации флуоресценции. Максимальная чувствительность обеспечивается при регистрации протекания процесса методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) [270, 271]. На одной из взаимодействующих молекул находится флуоресцентная группа, а на другой - акцептор энергии, который вызывает гашение флуоресценции при сближении донора и акцептора. При использовании эффективных гасителей флуоресценции, последняя может уменьшаться в сотни и даже тысячи раз, обеспечивая гораздо большую чувствительность, чем какой-либо другой метод детекции [272]. В качестве донора обычно используют флуоресцеин или его производные, а в качестве акцептора -производные родамина или DABCYL. Поскольку при гибридизации олигонуклеотидов с тРНК, оптическая плотность раствора изменяется в пределах десяти процентов, детекцию в этом эксперименте проводили по методу FRET. 2.4.2.1. Дизайн конструкций для экспериментов по методу остановленной струи Для получения надёжных результатов с помощью метода остановленной струи требуется использование больших количеств исходных веществ (более 100 ед. Агво тРНК и олигонуклеотида). В связи с этим вместо природной тРНК6, был использован транскрипт тРНК . К З -концевому остатоку рибозы тРНК -транскрипта была присоединена флуоресцентная метка (М-(флуоресцеинил-б)-тиокарбамоил этилендиамин) с помощью метода, описанного в работе [273].
Химические реакции, использованные для введения флуоресцеина на З -конец тРНК , показаны на рис. 49. Этот прибор позволяет измерять кинетику быстрых процессов, имеющих характеристическое время 1 миллисекунды ("мёртвое время " прибора), регистрируя поляризацию/анизотропию флуоресценции, оптическую плотность и круговой дихроизм на длинах волн от 218 до 650 нм. За процессом гибридизации олигонуклеотида 1D и TPHK6 следили по изменению суммарной флуоресценции, так как этот метод позволяет получать прямые данные о кинетике комплексообразования и имеет ВЫСОКУЮ ЧуВСТВИТеЛЬНОСТЬ (Авх=491 НМ, Автіадіоп бЗО нм). Для получения экспериментальных данных были выбраны 2 временных интервала: 0-0.5 секунд и 0-1000 секунд. Измерение флуоресценции в первом интервале обеспечивает регистрацию быстрых стадий комплексообразования, а во втором - медленных процессов, данные о которых были получены в независимых экспериментах с помощью метода задержки в геле. Измерения проводились при температуре 20 С. Каждый интервал содержал по 2000 точек измерения флуоресценции. Концентрация РНК была постоянной и равнялась 3-Ю 7 М, концентрация олигонуклеотида менялась от 1.5-10"6 до 10"4 М. Следует отметить, что концентрация олигонуклеотида во всех экспериментах была значительно выше концентрации РНК, что упрощает расчёты. Порции растворов РНК и олигонуклеотида объёмом по 50 мкл с необходимой концентрацией компонентов «выстреливались» из шприцев 1 и 2 и смешивались в реакторе, где происходило измерение флуоресценции. Для получения достоверных данных проводили усреднение данных 8-ми экспериментальных кривых для каждой концентрации олигонуклеотида. Усреднение первичных экспериментальных данных по нескольким кривым для одной концентрации олигонуклеотида проводили в программе Excel 2000, а расчёты по оптимизации различных параметров и минимизации среднеквадратичного отклонения - в программе Origin 6.1. Типичные кривые изменения флуоресценции от времени от начала взаимодействия приведены на рис. 51. Визуальный анализ зависимостей флуоресценции от времени показывает, что каждая кривая имеет 2 характеристических времени: -0,1 секунды и 100-400 секунд (Рис. 52). На рис. 53 приведены зависимости эффективных констант скорости изменения флуоресценции от концентрации олигонуклеотида 1D.
Экспоненциальному падению флуоресценции на участке до 2-х секунд соответствует к-, , а ещё более сильному падению флуоресценции на участке 1000 секунд соответствует эффективная константа скорости к2 . Эффективные константы вычислялись методом оптимизации параметра (к) уравнения (4), использованного для описания зависимости экспериментальных значений флуоресценции (F) от времени (t) для двух участков экспериментальной кривой - 0..0.5 с и 0.5..1000 с. F(t) = a + be h +ct (4), где к - эффективная константа скорости изменения флуоресценции; t - время; а, Ь и с - независимые коэффициенты. Поскольку значения эффективных констант для этих двух участков кривой отличаются минимум на три порядка, в дальнейшем эти участки можно обрабатывать независимо друг от друга. Как видно из рис. 53а, значение к/ не зависит от концентрации олигонуклеотида 1D. В то же время без добавления олигонуклеотида не происходило изменения флуоресценции. Это указывает на то, что наблюдаемое изменение флуоресценции вызывается внутримолекулярной перегруппировкой пространственной структуры тРНК. Эта структурная перестройка должна вызываться образованием нестабильного промежуточного комплекса тРНК с олигонуклеотидом, протекающая за время 30 мс (Рис. 51). Поскольку до 30 мс флуоресценция не изменяется, акцептор находится вдали от полностью комплементарного участка. Последующее очень небольшое (менее чем 5 %) гашение флуоресценции означает, что акцептор (и олигонуклеотид) всё ещё находится вдали от целевого участка. Значение второй эффективной константы скорости гашения флуоресценции к2\ (Рис. 536), имеет сложную концентрационную зависимость, близкую к гиперболе. Первым этапом является взаимодействие между основаниями олигонуклеотида 1D и основаниями в TYC петле с образованием нестабильного комплекса TGGTGCGA/ACCUdGC (подчеркнута последовательность олигонуклеотида, курсивом вьщелен мисматч). Это взаимодействие происходит «далеко» от расположения флуоресцентного красителя и не сопровождается заметным изменением флуоресценции. Образование комплекса олигонуклеотида с последовательностью в TFC петле вызывает частичное подплавление аминоакцепторного стебля и, возможно, ТРС-стебля тРНК, делая структуру этих стеблей, находящихся в коаксиальном стэкинге друг с другом, более подвижной, "дышащей". Этот процесс также не сопровождается заметным изменением флуоресценции, однако требует уже заметного времени (до 0.5 с). Вслед за этим начинается формирование "правильного" промежуточного комплекса между второй молекулой олигонуклеотида и ставшим более доступным одноцепочечным участком на З -конце тРНК (3АССАС5), формирование этого метастабильного комплекса инициирует начало внутримолекулярной перегруппировки, приводящей к формированию полноразмерного гетеродуплекса тРНК«Ю путем последовательного вытеснение из взаимодействия цепи тРНК, комплементарной участку связывания олигонуклеотида. Этот процесс протекает медленно, сопровождается значительным изменением флуоресценции, что свидетельствует о сближенном расположении 3 -конца тРНК, несущего флуоресцеин, 5 -конца олигонуклеотида, несущего остаток дабцила. Характеристические времена для этой последней стадии взаимодействия хорошо коррелируют с аналогичными величина, полученными с помощью метода задержки в геле и методом пробинга структуры РНК в процессе гибридизации с олигонуклеотидом.
