Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Закономерности расщепления рнк искусственными рибонуклеазами 9
1.1. Введение 9
1.2. Механизм расщепления фосфодиэфирных связей в РНК 10
1.3. Чувствительность фосфодиэфирных связей в рнк к гидролизу 15
1.3.1. Факторы, способствующие индукции спонтанного расщепления фосфодиэфирных связей в РНК 17
1.3.2. Гидролиз олигорибонуклеотидов: влияние последовательности и длины 20
1.3.2.1. Влияние структуры РНК на стабильность фосфодиэфирных связей в коротких синтетических олигонуклеотидах 20
1.3.2.2. Влияние оснований, фланкирующих фосфодиэфирную связь, на ее стабильность 21
1.3.2.3. Стабильность фосфодиэфирных связей в синтетических химерных олигонуклеотидах 24
1.3.3. Влияние функциональных групп гетероциклических оснований на чувствительность фосфодиэфирной связи к расщеплению 28
1.3.4. Стабильность биологически значимых молекул РНК 30
1.3.5. Заключение: Факторы, определяющие чувствительность фосфодиэфирных связей к расщеплению 33
1.4. Расщепление рнк искусственными рибонуклеазами на основе пептидов 34
1.4.1. Природные пептиды, обладающие рибонуклеазной акивностью 36
1.4.2. Синтетически полипептиды, проявляющие рибонуклеазную активность 38
1.4.3. Конъюгаты пептидов с молекулами, обладающими сродством к структуре РНК 40
1.4.3.1. Конъюгаты ферментов и олигонуклеотидов 41
1.4.3.2. Конъюгаты коротких пептидов и интеркаляторов 43
1.4.3.3. Олигонуклеотид-пептидные конъюгаты, обладающие рибонуклеазной активностью 45
1.5. Заключение 49
ГЛАВА 2. Катализаторы расщепления рнк пептидилолигонуклеотиды и органические соединения, включающие основные аминокислоты 50
2.1. Изучение механизма расщепления рнк искусственными рибонуклеазами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (ablkcm) и лизина (nlm), несущими остатки имидазола 50
2.1.1. Анализ доменной структуры химических рибонуклеаз на основе конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана 50
2.1.2. Сравнение рибонуклеазной активности модельных и базовых рибонуклеаз 52
2.1.3. Механизм расщепления РНК искусственными рибонуклеазами ABLkCm и nLm 56
2.2. Расщепление рнк с помощью олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 60
2.2.1. Направленное расщепление рнк конъюгатами олигонуклеотидов с пептидом 60
2.2.1.1. Исследование взаимодействия конъюгата pejo-16 с тРН^з 62
2.2.1.2. Рибонуклеазная активность пептид-олигонуклеотидных
конъюгатов 68
2.2.1.3. Обсуждение результатов по направленному расщеплению
РНК олигонуклеотид-пептидным конъюгатом 73
2.2.2. Расщепление рнк с помощью конъюгатов пептида [argleu]4-gly-nh2 и олигонуклеотидов со случайной последовательностью 75
2.2.2.1. Дизайн олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 75
2.2.2.2. РНК субстраты 76
2.2.2.3. Определение уровня рибонуклеазной активности и специфичности расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 76
2.2.2.3.1. Расщепление синтетического олигорибонуклеотида олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4 и рер-7 78
2.2.2.3.2. Расщепление in vitro транскрипта тРН^з человека олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 79
2.2.2.3.3. Определение специфичности расщепления HIV-1 РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 82
конъюгатами рер-4 и рер-7 86
2.2.2.3.5. Влияние структуры РНК на специфичность гидролиза 87
2.2.2.4. Контроли специфичности 91
2.2.2.5. Исследование возможности комплементарных взаимодействий между РНК и олигонуклеотидами в составе конъюгатов 91
2.2.2.6. Определение кинетических параметров расщепления РНК
олигонуклеотид-пептидными конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 94
2.2.2.6.1. Концентрационные зависимости расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 95
2.2.2.6.2. Кинетика расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 97
2.2.2.6.2.1. Анализ кинетики расщепления олигорибонуклеотида 5'-UUCAUGUAAA-3' 97
2.2.2.6.2.2. Анализ кинетики расщепления природных РНК-субстратов 100
2.2.2.6.3. Определение сродства олигонуклеотид-пептидных конъюгатов к РНК 106
2.2.2.7. Влияние длины и последовательности олигонуклеотидной части конъюгатов на эффективность и специфичность расщепления РНК 107
2.2.2.8. Влияние длины пептидного остатка в составе конъюгатов на эффективность и специфичность гидролиза 109
2.2.2.9. Влияние условий реакции на эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 110
2.2.2.9.1. Влияние ионов магния на специфичность и эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 110
2.2.2.9.2. Влияние ионов одновалентных металлов на рибонуклеазную активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 113
2.2.2.9.3. Влияние температуры на эффективность расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами 118
2.2.2.9.4. Влияние денатурирующих агентов на рибонуклеазную активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 119
2.2.2.9.5. Влияние ионных и неионных детергентов на рибонуклеазную активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 120
2.2.2.10. Механизм расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами по GpX- и РугА-последовательностям 121
2.2.2.10.1. Природа специфичности олигонуклеотид-пептидных конъюгатов к последовательности 121
2.2.2.10.2. Влияние структуры конъюгатов на эффективность расщепления РНК 123
Заключение 124
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 126
3.1. Материалы 126
3.1.1. Реактивы и препараты 126
3.1.2. Плазмиды 127
3.1.3. Буферы и растворы, использованные в работе 128 3.2. МЕТОДЫ 129 3.2.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 129 3.2.2.Электрофорез в агарозном геле 129
3.2.3. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях 129
3.2.4. Приготовление растворов искусственных рибонуклеаз серии ABLkCm 129
3.2.5. Линеаризация плазмид pHtk(wt), pHIV и dYF90 130
3.2.6. Получение in vitro транскриптов РНК HIV-1 (фрагмент длиной 96 нуклеотидов), TPHKLys3 человека и тРНКРҐІе из дрожжей 130
3.2.7. Введение [32Р]-метки поЗ'-ОН группе тРНК 131
3.2.8. Введение [32Р]-метки в 5'-концевое положение РНК 131
3.2.9. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях 132
3.2.10. Расщепление РНК с помощью химических рибонуклеаз серии ABLkCm 132
3.2.11. Расщепление динуклеозидмонофосфата СрА искусственными рибонуклеазами серии ABLkCm, 2L2 и РНКазой А 133
3.2.12. Расщепление РНК с помощью олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 133
3.2.13. Исследование связывания in vitro транскрипта TPHKLys3 с конъюгатом рер-16 и олигонуклеотидом 16 134
3.2.14. Пробинг структуры тРНК1у53в присутствии олигонуклеотида 16 или олигонуклеотид-пептидных конъюгатов рер-4 и рер-7 с помощью РНКазы Т1 134
3.2.15. Пробинг структуры TPHKLVS3B комплексе с олигонуклеотидом 16 с помощью РНКазы Н 134
3.2.16. Исследование влияния концентрации солей на гидролитическую активность олигонуклеотид-пептидных конъюгатов 135
3.2.17. Исследование влияния температуры на гидролитическую активность олигонуклеотид-пептидного конъюгата 135
3.2.18. Определение Км и Vmax 135
3.2.19. Определение оборотов реакции 136
Выводы 137
Список литературы 139
- Механизм расщепления фосфодиэфирных связей в РНК
- Расщепление рнк искусственными рибонуклеазами на основе пептидов
- Расщепление рнк с помощью олигонуклеотид-пептидных конъюгатов
- Концентрационные зависимости расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами
Введение к работе
ВВЕДЕНИЕ
Молекулы РНК в клетке выполняют множество функций, участвуя в переносе генетической информации, биокаталитических реакциях в ходе процессинга и трансляции и регуляции экспрессии генов [1-4]. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК. В последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о существовании неизвестных ранее регуляторных клеточных процессов и систем взаимодействия клеток, в которых ключевую роль играет РНК. Таким образом, в связи с важной биологической ролью определенных РНК, крайне актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК с целью инактивации вирусных геномов и регуляции биологических процессов в клетке в терапевтических целях.
Эффективным способом регуляции количества определенных РНК в клетке может служить их избирательное расщепление с помощью специфических агентов, распознающих определенные нуклеотидные последовательности. Прямым подходом к созданию таких искусственных сверхспецифичных рибонуклеаз является конструирование конъюгатов молекул, образующих комплексы с определенными нуклеотидными последовательностями или структурами РНК, с молекулами, расщепляющими фосфодиэфирные связи.
Помимо создания реагентов для направленного расщепления РНК особый интерес представляет создание низкомолекулярных химических рибонуклеаз, способных расщеплять РНК с высокой эффективностью и специфично к последовательности (к определенным мотивам в РНК). Такие соединения представляют интерес в качестве инструментов для исследования структуры изолированной РНК и РНК в комплексе с белками, могут быть использованы в качестве катализаторов разрушения РНК в ходе биотехнологических процессов. Недостаток традиционно используемых для этой цели природных рибонуклеаз заключается в их способности разворачивать структуру РНК, что неизбежно искажает результаты экспериментов. Кроме того, природные ферменты недостаточно стабильны и работают в узком диапазоне условий, что осложняет их применение в производстве [5].
Исследование химических рибонуклеаз с различной специфичностью позволяет получить детальные знания о механизме расщепления РНК по фосфодиэфирным связям в различных последовательностях. Скрининг таких соединений позволяет выявить эффективные катализаторы расщепления фосфодиэфирных связей и использовать их в качестве каталитического домена в конъюгатах для избирательного расщепления РНК.
Введение В последние годы было создано большое число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в физиологических условиях. В их число входят комплексы некоторых металлов [6-8], органические соединения, содержащие низкоосновные аминосоединения [9] и остатки имидазола [10-13], а также конструкции на основе олиго- и полипептидов [14, 15]. В качестве конструкций, образующих комплексы с определенными участками РНК, используют олигонуклеотиды и их аналоги.
Несмотря на интенсивные исследования, ведущиеся с целью создания химических рибонуклеаз, до настоящего времени не удалось получить эффективных конструкций для расщепления РНК, обладающих активностью, близкой к активности природных катализаторов. До настоящего времени не установлены механизмы, обеспечивающие специфичность расщепления РНК конъюгатами разной природы: по невыясненным причинам различные каталитические конструкции проявляют выраженное предпочтение к фосфодиэфирным связям, находящимся в различных последовательностях. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоспецифичных искусственных рибонуклеаз, способных расщеплять молекулы РНК с высокой эффективностью.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение расщепления РНК несколькими видами искусственных рибонуклеаз. В ходе исследования решались следующие задачи:
Исследование механизма расщепления фосфодиэфирных связей в РНК искусственными рибонуклеазами - конъюгатами имидазола с катионными структурами на основе 1.4-диазабицикло[2.2.2]октана и на основе остатков лизина.
Исследование расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами на основе пептида, состоящего из чередующихся остатков аргинина и лейцина, с целью изучения возможности получения конъюгатов со специфичностью, отличной от специфичности РНКазы А.
Литературный обзор
Механизм расщепления фосфодиэфирных связей в РНК
Известно несколько возможных механизмов расщепления фосфодиэфирных связи в нуклеиновых кислотах. Расщепление ДНК может протекать по механизму окислительного повреждения [25-27], по механизму фотоокисления [28, 29]; под действием радикалов, генерируемых различными реагентами (ендиинами [30], природными и синтетическими антибиотиками [31], а также под действием алкилирующих реагентов, которые в результате модификации гетероциклических оснований приводят к выщеплению оснований по механизму Д-элиминации и дальнейшему разрушению ДНК [32, 33]. В отличие от ДНК, РНК проявляет значительно большую устойчивость к окислительному расщеплению, например, под действием металлонезависимых природных и синтетических антибиотиков, способных генерировать гидроксильные радикалы [34-36], поскольку гликозидная связь в рибонуклеотидах обладает большей стабильностью по сравнению с дезоксирибонуклеотидами. В отличие от ДНК, расщепление РНК протекает по гидролитическому механизму. Наличие в структуре РНК 2 -гидроксильных групп создает возможность расщепления фосфодиэфирных связей по механизму внутримолекулярной трансэтерификации. Расщепление РНК по этому механизму широко распространено в природе, например в реакциях, катализируемых природными рибонуклеазами и рибозимами. Доказано, что по этому же механизму происходит спонтанное расщепление фосфодиэфирных связей под действием слабых индукторов (спермина, поливинилпиролидона) [37], а также расщепление искусственными конструкциями на основе имидазола [17], остатков полизаряженных пептидов (лизина [14]) и т. д. Механизм внутримолекулярной трансэтерификации включает несколько стадий. На первой стадии 2 -гидроксильная группа рибозы атакует фосфатную группу, в Литературный обзор результате чего происходит образование промежуточного пентакоординированного состояния межнуклеотидного атома фосфора (рис. 1 (а) [38-40]). В нейтральных и кислых условиях дальнейшее превращение интермедиата может происходить двумя путями. В первом случае (рис. 1(a)), в результате расщепления экзоциклической связи Р-0 происходит образование 2 ,3 -циклофосфата и высвобождение 5 -нуклеозида.
В качестве альтернативного пути может происходить псевдовращение связи вокруг атома фосфора, после чего эндоциклическая связь З -О-Р претерпевает расщепление с образованием 2 ,5 -изомера исходного нуклеозида. Перенос уходящей группы является скорость-лимитирующей стадией некатализируемого (спонтанного) расщепления, которое происходит значительно медленнее, чем перенос фосфатной группы в отсутствие катализатора [39, 40]. В щелочных условиях происходит депротонирование атакующего нуклеофила с последующим образованием пятивалентного переходного состояния фосфора (рис. 1 (б)). Образующийся интермедиат имеет слишком короткое время существования, для того чтобы претерпеть реакцию псевдовращения, поэтому не происходит переноса фосфатной группы в случае реакции, катализируемой основаниями, и реакция заканчивается образованием 2 ,3 -циклофосфата. В настоящее время накоплен большой материал по гидролизу РНК металлами и искусственными конструкциями, содержащими ионы различных металлов: Zn2+ [41], моноимидазольные конъюгаты с ионами Zn2+ в качестве кофактора [42, 43], Ni2+, Са2+, Со2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Pb2+, Al3\ Ln3+, макроциклические комплексы Еи3+ [44, 45], тексафириновые комплексы с кофактором Dy3+ [46, 47]. Некоторые из металлокомплексов [42-47] способны вызывать расщепление связей в РНК в условиях, близких к физиологическим. На рис. 2 представлено расщепление фосфодиэфирных связей в РНК с участием ионов металлов. Выступая в качестве кислоты Льюиса, ионы металлов могут участвовать в каталитическом процессе, непосредственно взаимодействуя с кислородом фосфатной группы (рис. 2, а) [48], с нуклеофилом (например, с гидроксильной группой) (рис. 2, б) [49], или с кислородами уходящей группы (рис. 2, в). Ионы металлов также могут принимать участие в катализе опосредовано: координировать молекулу воды и выступать в роли внутримолекулярного общего кислотного катализатора (рис. 2, г), Литературный обзор или координировать гидроксид-анион и выступать в роли внутримолекурного общего основного катализатора (рис. 2, д и е) [50, 51]. Вероятно, гидролитическое расщепление РНК под действием различных ионов металлов может осуществляться по тому или иному механизму, или их сочетанию. Предложены две основные модели участия ионов металлов в гидролизе фосфодиэфирной связи. Согласно модели (1) (рис. 2, (1)), в каталитической реакции принимают участие ион металла и координированный с ним ион гидроксила [52-55].
Модель (2) (рис. 2, (2)) основывается на механизме, принятом для природных ферментов, таких как щелочная фосфатаза и ДНК-полимераза I [56, 57], и предполагает участие двух ионов металла, один из которых координирует гидроксильную группу, а второй активирует атом кислорода уходящей группы. Расщепление фосфодиэфирной связи, катализируемое ионами металлов, имеет сходство с расщеплением в присутствии оснований, поскольку так же, как и в случае катализа основаниями, под действием ионов металлов не происходит ускорения переноса фосфатной группы и реакция заканчивается на стадии образования циклофосфата [58]. Исходя из некоторых закономерностей расщепления фосфодиэфирных связей в РНК под действием ионов металлов (увеличение скорости расщепления с возрастанием рН [59-62], зависимость скорости от ионной силы комплекса метал/субстрат [63, 64]) предполагается, что ионы металлов действуют в составе комплекса с субстратом как основные катализаторы (рис. 2, а). Кроме гидролитического расщепления фосфодиэфирных связей в РНК известен также механизм разрыва связей под действием реагентов, способных генерировать активные частицы (например, гидроксильные радикалы). К таким реагентам относятся комплексы металлов с переменной валентностью: EDTA-Fe(ll и бромацетамидобензил-EDTA-Fe(ll) (FeBABE) [65-70], фенантролин-Си(Н) и его производные [71, 72]. Предполагается, что окислительное расщепление РНК происходит таким же путем, как и ДНК. На первом этапе расщепление такими комплексами индуцируется в присутствии восстанавливающих реагентов, таких как МРА (меркаптопропионовая кислота) или аскорбиновая кислота, которые вызывают образование пероксида водорода. В результате запускается каскад реакций, приводящий к удалению атома водорода с С1 или С4 положения остатка рибозы или дезоксирибозы [26, 73, 74]. На втором этапе образовавшийся пероксид водорода окисляет атом меди в случае комплексов фенантролИн-Си(И) или железа в случае EDTA-Fe(ll), в результате чего генерируются активные частицы (Си - Си-охо частицы, Fe - гидроксильные радикалы). Эти активные
Расщепление рнк искусственными рибонуклеазами на основе пептидов
Таким образом, чувствительность фосфодиэфирных связей в РНК к расщеплению определяется многими факторами: функциональными группами гетероциклических оснований, входящих в состав нуклеозида, фланкирующего связь; нуклеотидами, прилегающими к фосфодиэфирной связи с 3 - и 5 -конца; расположением связи во вторичной структуре РНК; стэкинг-взаимодействиями оснований вблизи связи и на расстоянии от нее. Сильные стэкинг-взаимодействия оснований замедляют расщепление находящейся между ними фосфодиэфирной связи путем затруднения атаки 2 -гидроксильной группы рибозы, атома фосфора и ухода атома кислорода с последующим переходом в линейную конформацию, что существенно для эффективной переэтерификации. Экспериментальные доказательства важности стэкинг-взаимодействий, как фактора, определяющего реакционную способность фосфодиэфирных связей, противоречивы: не было обнаружено корреляции между величиной констант скорости гидролиза динуклеозид монофосфатов, катализируемого основаниями [87, 117], и эффективностью стэкинг-взаимодействий, предсказанной с помощью молекулярного моделирования [131]. Возможно, более важным, чем стэкинг-взаимодействия между соседними основаниями, являются стэкинг-взаимодействия в удаленных участках молекулы и их влияние на общую структуру олигонуклеотида [84, 89]. Сеть водородных связей вблизи расщепляемой фосфодиэфирной связи может ускорять реакцию расщепления тремя возможными способами: (1) путем акцептирования протона с 2 -гидроксильной группы; (2) путем передачи протона на отрицательно заряженную фосфодиэфирную группу; (3) путем передачи протона на 5 -оксианион. Так, например, водородная связь между молекулы воды, усиливает электрофильность атома фосфора [81]. В одноцепочечных участках нужная ориентация функциональных групп может быть достигнута за счет локальной подвижности фосфодизфирных связей в РНК [111, 132].
Повышенную подвижность фосфодиэфирной связи в Pyr-А мотиве можно объяснить ограниченными стэкинг-взаимодействиями между пиримидиновыми и пуриновыми основаниями, если пиримидин прилегает с 5 -стороны. Однако такая чувствительность связи к гидролизу определяется не только эффективным стэкингом оснований - скорость гидролиза U-A в 30 раз выше, чем U-G, хотя обе пары оснований характеризуются примерно одинаковыми значениями энергии стэкинг-взаимодействий [133]. Экспериментальные данные позволяют предположить образование водородной связи (прямой или с участием молекулы воды) кислородами у атома фосфора, вследствие чего значительно повышается его электрофильность, что облегчает реакцию трансэтерификации (нуклеофильную атаку соседней 2 -ОН группы рибозы) [134]. Другими словами, повышенная чувствительность связей С-А и U-A к гидролитическому расщеплению определяется, по-видимому, большей подвижностью фосфодиэфирной связи в данных мотивах и повышенной электрофильностью атома фосфора. Рибонуклеазы являются природными катализаторами расщепления фосфодизфирных связей в РНК. Структура всех природных РНКаз включает два типа активных центров: центр связывания субстрата и каталитический центр, осуществляющий связывание фосфатной группы и гидролиз фосфодиэфирной связи. В таблице 2 представлены основные группы природных рибонуклеаз и показано, какие аминокислоты участвуют в связывании субстрата в субстрат-связывающем центре и катализируют гидролиз в каталитическом центре. Все природные РНКазы содержат в каталитически активном центре один или два остатка гистидина, один из которых выступает на первой стадии гидролиза в качестве акцептора протона с 2-гидроксильной группы рибозы, а второй является донором протона на второй стадии реакции. Специфичность природных рибонуклеаз определяется организацией субстрат-связывающих центров. Все природные РНКазы делятся на три группы по молекулярному весу, аминокислотной последовательности и специфичности действия: семейство РНКазы А [135] (специфичность расщепления 5 -PyrlA-3 ), семейство РНКазы Т1 [136] (специфичность расщепления 5 -GplX-3 ), семейство РНКазы Т2 [146] (неспецифические рибонуклеазы). Кроме природных рибонуклеаз некоторые клеточные пептиды, функционально не являющиеся рибонуклеазами, способны расщеплять фосфодиэфирные связи в РНК. Особый интерес представляет изучение гидролитической активности природных и синтетических пептидов и полипептидов, а также их конъюгатов с различными РНК-связывающими доменами. Большое число известных на настоящий момент искусственных рибонуклеаз сконструировано на основе остатков аминокислот, встречающихся в каталитических центрах природных РНКаз: имидазола (аналог His в РНКазе А), гуанидиниевая группировка (аналог Arg в РНКазе Т1). Как правило, искусственные рибонуклеазы обладают специфичностью РНКазы А: расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям в последовательностях 5 -Руг-А-3 . Специфичность другого типа была показана только для нескольких синтетических конструкций, содержащих ионы аммония, конъюгированные с антрахиноном [22]. Известны некоторые синтетические пептиды и полипептиды, способные проявлять ферментативную активность.
Ранее были описаны пептиды и полипептиды со слабой эстеразной [146-149] и гликозидазнои активностью [150]. Рибонуклеазная активность была обнаружена у 70-звенного синтетического полипептида, аналога нуклеазы S [151], а также у 34-звенного полипептида, который содержал участки последовательности нуклеазы S [152]. Работ, посвященных изучению гидролитических свойств пептидов и их конъюгатов, немного, однако они представляют определенный интерес в плане поиска общих закономерностей и требований для создания искусственных рибонуклеаз с разной специфичностью. Некоторые природные относительно небольшие по размеру пептиды, которые функционально не являются рибонуклеазами, способны расщеплять фосфодиэфирные связи в РНК. Рибонуклеазная активность была обнаружена у двух относительно коротких пептидов, относящихся к белкам семейства цинковых пальцев [153-155]. Эти пептиды проявляют рибонуклеазную активность только в отсутствие ионов цинка. Один из них представлял собой 30-звенный пептид (ZFY-6), структура которого соответствует одиночному цинковому пальцу ZFY-белка человека, выполняющему в клетке роль фактора транскрипции [154]. Пептид ZFY-6 способен формировать независимую структуру цинкового пальца путём тетраэдрической Литературный обзор координации иона цинка SH-группами цистеина и остатками имидазола гистидина [156, 157]. Структура пептида, обладающая рибонуклеазной активностью, представляет собой гомодимер, образующийся посредством внутримолекулярного S-S мостика [154]. Пептид ZFY-6 расщепляет одноцепочечные РНК специфично к последовательности подобно рибонуклеазам семейства РНКазы А: в результате расщепления образуются продукты, содержащие З -фосфат и 5 -гидроксильную группу [158, 159]. Инактивация рибонуклеазной функции пептида в присутствие ионов цинка, координирование которых осуществляется с помощью остатков цистеина и гистидина, позволила
Расщепление рнк с помощью олигонуклеотид-пептидных конъюгатов
В последние годы ведется интенсивный поиск реагентов неферментативной природы, способных эффективно катализировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК. Статистическое расщепление РНК может происходить либо по окислительно-восстановительному механизму, либо по механизму внутримолекулярной переэтерификации (см. литобзор). Реагенты, катализирующие реакцию переэтерификации, представляются более перспективными в качестве искусственных рибонуклеаз вследствие их меньшей токсичности и большей избирательности действия (не повреждают ДНК, белки и другие биополимеры). Среди соединений, способных катализировать расщепление РНК, особое место занимают природные и синтетические олигопептиды и их аналоги. Подробно эти пептиды рассмотрены в разделе 1.2 (литературный обзор). В работе [14] впервые было показано, что расщепление фосфодиэфирных связей в РНК может происходить под действием олигопептидов, состоящих из чередующихся остатков основных и гидрофобных аминокислот. Присоединение короткого пептида [LeuArg]2 к б -концевому фосфату 6-звенного олигодезоксирибонуклеотида привело к получению конъюгата, способного направленно расщеплять РНК [173].
Цель данного исследования заключалась в изучении свойств искусственных рибонуклеаз - конъюгатов олигонуклеотидов и пептида [ArgLeu]4-Gly-NH2, состоящего из чередующихся остатков основных и гидрофобных аминокислот. Скрининг пептидов различного строения выявил простые структуры, способные расщеплять РНК: пептиды с чередующимися гидрофобными и основными аминокислотными остатками [LeuArg]n-Gly-NH2 [14, 15], присоединение которых к 5 -концевому фосфату б-звенного олигонуклеотида привело к получению конъюгата, обладающего способностью расщеплять РНК [173]. В настоящей работе пептид [LeuArg]n-Gly-NH2 был присоединен через остаток диэтиленгликоля по 5 -концу 16-звенного дезоксирибоолигонуклеотида 5 -CCCTGGACCCTCAGAT-3 , комплементарного области 38-53 in vitro транскрипта TPHKLy53 человека. Конъюгат рер-16 был синтезирован и предоставлен для исследований к.х.н. н.с. Пышным Д.В. (ЛХНК НИБХ СО РАН). Структура конъюгата представлена на рис. 17. Гексадекадезоксирибонуклеотид p(DEG)-CCCTGGACCCTCAGAT (16), содержащий фосфатную группировку, введенную по остатку диэтиленгликоля (DEG), присоединенного к 5 -концу олигонуклеотида, был синтезирован по стандартному протоколу [190]. Конъюгат c KOHeL,Gly(ArgLeu)3-Arg-LeuN"KOHeu-p-DEG-5 CCCGG-ACC-CTC-AGA3 был получен по методу, описанному ранее в работе [191]. Присоединение пептида к олигонуклеотиду проводили путем образования фосфамидной связи между фосфомоноэфирным фосфатным остатком диэтиленгликолевого фрагмента и а-аминогруппой N-концевого остатка лейцина в структуре Результаты и обсуждение олигонуклеотид-пептидных конъюгатов, содержащих остатки аргинина [190]. Предполагалось, что олигонуклеотид в конъюгате c"KDHeuNH2-Gly(ArgLeu)3-Arg-LeuN"KOHeu-p-DEG-5 CCCTGGACCCTCAGAT3 (рер-16) доставляет пептид к связи С56-А57, располагающейся в ТФС петле TPHKLys3, по которой теоретически должно осуществляться сайт-направленное расщепление. В качестве модельной РНК в работе использовали in vitro транскрипт TPHKLys3 человека (далее по тексту TPHKLys3) (Рис. 18), природный аналог которого выступает в качестве праймера для обратной транскриптазы вируса HIV-1 (вирус иммунодефицита человека первого типа) на ключевой стадии размножения вируса. При связывании 3 -конца TPHKLys3 с участком связывания праймера (PBS) геномной РНК вируса HIV-1 образуется псевдоузел, третичная структура которого узнается вирусной обратной транскриптазои. В работе [192] было показано, что нарушение третичной структуры этого псевдоузла приводит к блокированию обратной транскрипции геномной РНК вируса.
Для синтеза конъюгата использовали олигонуклеотид 16, комплементарный последовательности 38-53 TPHKLys3, который, связываясь с РНК, должен был доставлять пептид [LeuArg]4Gly к связи С5е-А57 расположенной в ТФС петле молекулы (Рис. 18). Мы исследовали связывание TPHKLys3 с конъюгатом рер-16 и с олигонуклеотидом 16 методом задержки в геле (рис. 19). Для этого TPHKLys3 инкубировали в стандартном буфере (см. главу 3), в присутствии или в отсутствие 5 мМ MgCI2. Оказалось, что при связывании TPHKLys3 как с олигонуклеотидом 16 (рис. 19, А), так и с конъюгатом рер-16 (рис. 19, Б) происходит образование нескольких типов комплексов, характеризующихся разной электрофоретической подвижностью в 10 % нативном полиакриламидном геле. Мы предполагаем, что в комплексе 1 тРНК была связана с одной молекулой олигонуклеотида 16 или конъюгата рер-16, а в комплексе 2 тРНК связывала, по крайней мере, две молекулы олигонуклеотида или конъюгата. Кооперативное связывание двух молекул олигонуклеотида с РНК с одновременным образованием совершенного и несовершенного гетеродуплексов наблюдалось ранее для тРНКРГ1е из дрожжей и для фрагмента 23S рРНК, содержащего а-сарциновую петлю [193]. При эквимолярных концентрациях тРНК и олигонуклеотида 16 (0.5 JJM) В отсутствие ионов магния эффективность комплексообразования достигает 100%. Однако, при этом происходит образование сразу нескольких типов комплексов. В присутствии ионов магния полное связывание олигонуклеотида 16 происходит при его концентрации 5
Концентрационные зависимости расщепления РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами
Олигонуклеотид-пептидные конъюгаты, исследуемые в настоящей работе, представляют собой молекулы, катализирующие расщепление фосфодиэфирных связей в РНК. Конъюгат, как и любой катализатор, взаимодействуя с РНК и ускоряя расщепление фосфодиэфирных связей, не расходуется в реакции. Изучение каталитических свойств конъюгатов можно проводить либо в режиме однооборотной реакции ([pep-ON]»[S0], где S0 - концентрация РНК мишени), либо в условиях многооборотной реакции, когда [рер-ON]«[S0]. В первом случае удобно определять константы скорости расщепления отдельных фосфодиэфирных связей и изучать специфичность расщепления. Во втором случае появляется возможность определить эффективность (обороты реакции) катализа, Результаты и обсуждение определить сродство катализатора к РНК-мишени и чувствительность отдельных фосфодиэфирных связей к расщеплению. Зависимости эффективности расщепления модельных РНК олигонуклеотид-пептидными конъюгатами от их концентрации изучали в условиях однооборотной реакции, то есть в условиях избытка конъюгатов по отношению к РНК-субстрату ([рер-ON]»[S0]), при 37С в буфере, содержащем 0.1 мг/мл суммарной тРНК Є coli в качестве носителя, что соответствует концентрации РНК по фосфатным группам 3-Ю"4 М. Меченую [32Р] по 3 - концу РНК (TPHKLys3, TPHKPhe, транскрипт тРНКРЬе) или по 5 - концу (рибоолигонуклеотид, HIV-1 РНК) РНК инкубировали в этом растворе в присутствии 1-100 /JM одного из конъюгатов рер-4, рер-7 и рер-16 в течение различного времени. На рис. 33 (а) приведена зависимость эффективности расщепления HIV-1 РНК от концентрации конъюгатов рер-4, рер-7 и рер-16. Видно, что концентрационные зависимости для конъюгатов рер-4, рер-7 и рер-16 имеют одинаковый вид кривых с насыщением; кривые выходят на плато при одинаковой концентрации конъюгатов (3-Ю"5 М) и различаются только величиной Платовых значений степеней расщепления. Концентрационные зависимости выходят на плато при концентрации каждого из конъюгатов 3-Ю"5 М, и дальнейшее увеличение концентрации конъюгатов не приводит к увеличению скорости расщепления РНК. Максимальная степень расщепления HIV-1 РНК составляет 61%, 66% и 48,5% для конъюгатов рер-4, рер-7 и рер-16, соответственно (данные приведены для концентрации конъюгатов 5-Ю"5 М и времени инкубации 8 ч). Такой вид концентрационной зависимости - кривая с насыщением - характерен для реакций, протекающих в составе комплексов.
Однако, как было показано, конъюгаты не образуют стабильных комплементарных комплексов с РНК. Таким образом, полученные данные указывают на то, что реакция расщепления протекает в составе комплекса РНК«конъюгат, который имеет природу, отличную от природы комплекса, реализуемого посредством комплементационных взаимодействий. Аналогичные концентрационные зависимости были получены при расщеплении in vitro транскрипта тРНК1уз3 конъюгатами рер-4 и рер-7 (рис. 33, б). И в этом случае плато достигается при концентрации конъюгатом 3x10"5 М. Конъюгаты различаются между собой длиной и последовательностью олигонуклеотидного адреса, но содержат одинаковый пептид. По-видимому, одинаковый вид зависимостей степени расщепления от концентрации конъюгатов определяется либо только структурой самого пептида, либо структурой олигонуклеотид-пептидного конъюгата. Различие в эффективности расщепления РНК разными конъюгатами, возможно, связано с различной последовательностью олигонуклеотидов в конъюгатах. Кинетику расщепления различных РНК конъюгатами рер-4, рер-7 и рер-16 изучали в условиях однооборотной реакции. Степень расщепления по каждой конкретной фосфодиэфирной связи определяли как отношение радиоактивности в полосе, соответствующей расщеплению по данной фосфодиэфирной связи, к суммарной радиоактивности, нанесенной на дорожку. Анализ кинетики расщепления олигорибонуклеотида 54JUCAUGUAAA-3 показал, что конъюгаты рер-4 и рер-7 расщепляют в рибоолигонуклеотиде три фосфодиэфирные связи С3-А4, G6-U7 и U7-A8. На рис. 34 представлены кинетические зависимости расщепления рибоолигонуклеотида UUCAUGUAAA конъюгатами рер-4 и рер-7 по каждому сайту отдельно и суммарная кинетика расщепления, которая представляет собой суперпозицию кинетических кривых по отдельным участкам расщепления. Видно, что при концентрации 1 рЫ\ конъюгат рер-4 расщепляет фосфодиэфирные связи С-А и U-А с большей эффективностью, чем G-U: степень расщепления составляет 14.3%, 6.5% и 3.8% за 24 ч, соответственно. При увеличении концентрации конъюгата рер-4 до 5 рМ эффективность расщепления рибонуклеотида по связи G-U возрастает до 35,7%, в то время как по двум другим гидролизуемым связям С-А и U-A уменьшается до 10,7% и 3,8% за 24 ч. Конъюгат рер-7 расщепляет фосфодиэфирную связь G-U с большей эффективностью при концентрациях 1 и 5 рМ: степень расщепления составляет 14,8% и 53,12% за 24 ч, соответственно. В то же время эффективность расщепления по СрА и UpA последовательностям конъюгатом рер-7 при концентрации 1 дМ составляет 3.9% и 4.7%, соответственно, а при повышении концентрации до 5 рМ возрастает до 20% и 6%, соответственно. GpU выше, чем конъюгата рер-4. Однако так как при повышении концентрации конъюгата рер-4 кЭф РугА последовательностей падает примерно настолько, насколько повышается кЭф GpU последовательности, можно предположить, что фосфодиэфирная связь GpU становится более доступной для связывания, и, соответственно, для расщепления конъюгатом рер-4. кривые расщепления природных РНК - тРНКР1е из дрожжей (природной тРНК и in vitro транскрипта), in vitro транскрипта TPHKLys3 И фрагмента HIV-1 РНК - конъюгатами рер-4 и рер-7 приведены на рис. 35 (а, б, в и г, соответственно). Для конъюгата рер-16 приведены кинетические данные только по расщеплению РНК HIV-1.
Отчетливо видно, что независимо от типа РНК-субстрата расщепление РНК конъюгатом рер-7 всегда протекает с большой скоростью, чем конъюгатами рер-4 или рер-16, а реакция расщепления всех РНК конъюгатами рер-4 и рер-7 представлена двухфазной кинетикой. Общая степень расщепления РНК конъюгатом рер-4 за 24 ч составляет для тРНКр,1е и транскрипта тРНКРЬе -17 и 18%, соответственно, а для TPHKLys3 33%, тогда как общая степень расщепления этих РНК конъюгатом рер-7 составляет 48%, 43% и 77%, соответственно. При концентрации конъюгатов 10 иЬА кривые имеют выраженный двухфазный характер с быстрой фазой до 3 ч. Причем двухфазный характер кривых более выражен для конъюгата рер-7 (рис. 35, а, б, в, д). При повышении концентрации конъюгатов до 50 рМ двухфазный характер кривых становится менее Результаты и обсуждение выраженным, и исчезает при концентрации конъюгатов 100 рМ. В последнем случае кинетические кривые имеют вид обычной экспоненциальной зависимости (рис. 35, г). Сложный характер кинетических кривых объясняется тем, что каждая кривая представляет собой суперпозицию кинетических кривых расщепления по каждой отдельной фосфодиэфирнои связи, причем накопление продуктов расщепления по каждой отдельной фосфодиэфирнои связи описывается независимой кинетической кривой. Следует учитывать, что параллельно с реакцией расщепления РНК происходит реорганизация вторичной структуры РНК и изменение доступности сайтов, подвергающихся расщеплению, как в целевой молекуле, так и в составе более коротких фрагментов. Исследование кинетики расщепления рибоолигонуклеотида конъюгатами рер-4 и рер-7 позволило определить эффективные константы расщепления для трех типов фосфодиэфирных связей С-А, U-A и G-U, присутствующих в рибоолигонуклеотиде. Представлялось интересным определить эффективные константы расщепления фосфодиэфирных связей в более длинной и структурированной молекуле - in vitro транскрипте РНК HIV-1. Анализ кинетики расщепления РНК HIV-1 по каждому участку проводили, используя кинетическую схему параллельно-последовательных реакций. В РНК HIV-1 гидролизу конъюгатами рер-4 и рер-16 подвергаются 15 фосфодиэфирных связей, тогда как конъюгат рер-7 расщепляет РНК HIV-1 по 21 участку (рис. 35, д, е). Кинетика расщепления H1V-1 РНК будет описываться следующими схемами и системами уравнений:
![Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола](/i/i/4301/324197.png "Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола Белоглазова Наталья Геннадьевна")
