Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Неферментативное образование фосфодиэфирной связи между фрагментами рнк (реакция лигирования) (обзор литературы) 8
1.1 Введение 8
1.2 Конденсирующие агенты - карбодиимиды и бромциан 9
1.3 Активированные производные фосфата 24
1.3.1 Лигирование фосфоримидазолидных производных нуклеиновых кислот 25
1.3.2 Лигирование 2',3'-циклофосфат-содержащих нуклеиновых кислот 33
1.3.3 Лигирование 5'-трифосфат-содержащих нуклеиновых кислот 35
1.4 Рибозимы 37
1.5 Заключение 43
Глава 2. Неферментативная рекомбинация молекул рнк в реакциях расщепления / лигирования (результаты и обсуждение) 45
2.1 Исследование матрично-направленной реакции лигирования олигонуклеотидов, несущих 2',3'-циклофосфат 45
2.1.1 Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов 45
2.1.2 Зависимость эффективности реакции лигирования от рн буфера и присутствия ионов магния 47
2.1.3 Кинетика реакции неферментативного лигирования и выбора длительности инкубации для исследования реакции 50
2.1.4 Зависимость выхода продукта лигирования от температуры 53
2.1.5 Зависимость эффективности реакции лигирования от рн и присутствия ионов металлов 55
2.1.6 Влияние этилового спирта и хлорида натрия на эффективность образования продукта лигирования 59
2.1.7 Заключение 60
2.2 Анализ образующейся фосфодиэфирной связи 60
2.2.1 Обоснование метода 60
2.2.2 Анализ образующейся связи методами ферментативного и щелочного гидролиза 61
2.3 Исследование матрично-направленной комбинированной реакции расщепления/лигирования химерного днк/рнк олигонуклеотида. 65
2.3.1 Выбор модели 65
2.4 Рекомбинация молекул рнк через сопряженные акты расщепления/лигирования в присутствии комплементарной матрицы 67
2.4.1 Выбор модели 67
2.4.2 Влияние ионов металлов на эффективность протекания реакции расщепления/лигирования 70
2.4.3 Влияние температуры на эффективность образования продуктов лигирования 72
2.4.4 Скорость накопления продукта лигирования 74
2.4.5 Влияние соотношения концентраций олигонуклеотидов на эффективность образования продукта лигирования 76
2.4.6 Анализ образующейся связи методом ферментативного гидролиза 77
2.5 Значение полученных результатов 79
Глава 3. Материалы и методы 84
3.1 Введение [32р]-метки по 5'-концу олигонуклеотида 86
3.2 Гидролиз фосфодиэфирной связи гидроксидом натрия 87
3.3 Получение олигонуклеотидов с 2',3'-циклофосфатом на з'-конце 87
3.4 Гидролиз г'.з'-циклофосфата 87
3.5 Получение двуцепочечного комплекса олигонуклеотидов 88
3.6 Изучение влияния рн на эффективность образования продуктов лигирования 88
3.7 Изучение эффективности образования продуктов лигирования в присутствии ионов металлов 89
3.8 Выделение продуктов лигирования 90
3.9 Ферментативное расщепление продуктов лигирования рибонуклеазой т1 91
3.10 Расщепление продукта лигирования при рн 9.0 в присутствии ионов мд2+ 91
3.11 Дефосфорилирирование олигонуклеотидов щелочной фосфатазой 91
3.12 Ферментативное лигирование олигонуклеотидов с помощью днк-лигазы 92
Выводы 93
Список литературы
- Лигирование фосфоримидазолидных производных нуклеиновых кислот
- Зависимость эффективности реакции лигирования от рн буфера и присутствия ионов магния
- Рекомбинация молекул рнк через сопряженные акты расщепления/лигирования в присутствии комплементарной матрицы
- Гидролиз фосфодиэфирной связи гидроксидом натрия
Введение к работе
Ключевым этапом возникновения жизни является период, на котором молекулы РНК, возникшие в ходу пребиотического синтеза, существовали в формате пространственно обособленных молекулярных ансамблей, способных к самовоспроизведению и эволюции, что в итоге привело к формированию молекулярно-генетических и биохимических основ современной организации жизни [1]. Одним из вопросов, связанных с развитием мира РНК, является следующий: в результате каких реакций в пребиотическом мире, в отсутствие белковых ферментов, происходило усложнение молекул РНК и увеличение их размера? Самовоспроизведение имеющихся молекул подразумевает существование процессов репликации (полимеризации), а эволюция - наличие процессов генерации изменчивости молекул РНК (рекомбинации).
Возможным вариантом процесса, который может приводить к увеличению разнообразия и удлинению молекул РНК, является неферментативная рекомбинация, протекающая с участием 2 ,3 -циклофосфата [2]. Расщепление РНК приводит к образованию фрагментов, несущих на З -конце 2 ,3 -циклофосфат, который может взаимодействовать с 5 -ОН группами других фрагментов РНК.
Принципиальная возможность реакции лигирования олигонуклеотидов с участием вышеупомянутых групп была показана в работах [3-5]. Хотя в использованных условиях лигирование олигонуклеотидов протекало с низкой эффективностью, можно предположить, что простейшие вещества, присутствовавшие в «пребиотическом бульоне» и способные ускорять реакции трансэтерификации (например, ионы металлов), могут также повышать и эффективность реакций лигирования РНК.
Целью настоящей работы является изучение реакции неферментативного лигирования фрагментов РНК, которая могла бы иметь место в пребиотических условиях.
В ходе исследования решались следующие задачи:
1) изучение эффективности протекания реакции неферментативного лигирования между олигонуклеотидами, у которых концевые г .З -циклофосфат и 5 -гидроксильная группа сближены в дуплексе за счет образования комплекса с комплементарной матрицей. Исследование влияния рН буфера, температуры среды и различных концентраций двухвалентных ионов металлов, как возможных катализаторов превращения;
2) изучение комбинированной реакции расщепления/лигирования в комплексе частично-комплементарных олигонуклеотидов. Выяснение особенностей протекания реакции, а именно: влияния на эффективность образования продуктов лигирования двухвалентных ионов металлов, рН буфера и температуры среды, скорости реакции.
3) Выделение продуктов лигирования и определение типов изомеров фосфодиэфирной связи.
Лигирование фосфоримидазолидных производных нуклеиновых кислот
Фосфоримидазолиды использовали для проведения реакции химического лигирования в составе дуплекса (матрично-зависимое лигирование) и для реакции в растворе (безматричная конденсация). Поскольку, к теме обзора в большей степени относится матрично-опосредованное лигирование, то работы второй группы будут рассмотрены менее подробно.
Первая статья вышла в 1968 году и описывала полимеризацию ImpA на ро1у(11)-матрице [65], через год авторы описали систему, состоящую из ImpG и poly(C) [66]. В обоих случаях, реакция протекала в условиях образования триплекса (тройной спирали) с образованием продуктов лигирования, среди которых основными были димеры и тримеры, (р!М)2 и (pN)3.
В следующей работе определяли зависимость эффективности безматричной конденсации и природы образуемой связи (2 ,5 - или 3 ,5 -) от типа используемых ионов двухвалентных металлов [67]. Конденсация ImpA в присутствии Мд2+ приводила к появлению лишь 0.5% рА3 р5А связей. В присутствии ионов РЬ2+ и Zn2+, несмотря на то, что выход продуктов конденсации составлял 35 - 55% и 10 -20%, соответственно, соотношение продуктов с 2 ,5 и 3 ,5 -фосфодиэфирными связями (в дальнейшем используется обозначение 273 ) было не меньше 10, а выход 3 ,5 -димера не превышал 3%. В присутствии Zn2+ из ImpU образовывались продукты лигирования (выход 11%), в которых выход 3 ,5 -димера составлял лишь 1.4%.
Затем была предпринята попытка использовать активированные димеры нуклеотидов на матрицах со смешанной последовательностью [68]. Авторы исследовали конденсацию следующих: ImpU, ImpT, ImpC, ImpA, ImpG, ImpUpG и ImpCpA, на разнообразных олигонуклеотидах в качестве матриц. При этом в случае ImpU и ImpT присутствие матрицы не оказывало влияния на эффективность образования продуктов лигирования, а для ImpC наблюдается лишь незначительное увеличение выхода продуктов лигирования на соответствующих матрицах. ImpA, ImpG, а также ImpUpG и ImpCpA, участвовали в матрично-зависимой полимеризации с более высокой эффективностью. Полярность образуемой связи при этом сильно зависела от природы субстрата -содержание 3 ,5 -связей составляло от 10 до 70 %.
Интересные результаты были получены в работе [69], в которой авторы исследовали реакцию конденсации фосфоримидазолидов изомерных аденозиндинуклеотидов на polyU матрице. Они обнаружили, что 3 ,5 -динуклеотиды, такие как А3р5А и рА3р5А, являются лучшими акцепторами фосфата, тогда как lmpA2p5A лучший донор, чем ІтрА3р5А. Так, в реакции между А2 р5А и ІтрА3 р5А выход составил всего 4%, тогда как, в реакции между А3р5А с lmpA2p5A он достигал 86%, при этом были получены продукты, состоящие из пяти и более молекул субстрата. Выход продуктов реакции, содержащих 3 ,5 -связи, составлял от 1 до 45% от общего количества продуктов лигирования.
В работе [70] авторы для полимеризации ImpApC, ImpCpA, ImpGpU и ImpUpG использовали в качестве матрицы полимеры (UG)n и (СА)Л. Было показано, что с наибольшей эффективностью протекает реакция полимеризации ImpGpU и ImpUpG на poly(CA), с меньшей эффективностью образуются продукты олигомеризации ImpCpA на poly(UG), а для системы ImpApC и poly(UC) полимеризация протекала едва заметно [70]. Это были первые работы, в которых была показана возможность матрично-направленного лигирования олигомеров и влияние последовательности олигомеров на эффективность синтеза.
В присутствии ионов РЬ2+ полимеризация ImpA на poly(U) протекает с общим выходов продуктов лигирования (вплоть до пентааденилатов) 35%, при этом процент 3 ,5 -связей составляет 75%, тогда как в отсутствие ионов металла содержание таких связей было лишь 10% [71, 72].
Полимеризация ImpG на роїуС-матрице также протекала с большей эффективностью в присутствии ионов свинца и цинка. Максимальная длина полученных олигомеров достигала 40 звеньев, при этом в присутствии ионов свинца образовывались преимущественно 2 ,5 -связи, а в присутствии ионов цинка - 3 ,5 [73].
Было показано, что при полимеризации ImpGpG на роІу(С)-матрице в 1-метилимидазольном буфере олигомеры длиной до 20 звеньев образуются даже в отсутствие ионов металлов. Добавление РЬ2+ значительно увеличивало вход более длинных олигомеров. В присутствии ионов Zn2+ значительно повышается выход продуктов конденсации 3 ,5 -димера, причем образуются преимущественно 3 ,5 -связи, но не было зарегистрировано образования более длинных продуктов из 2 ,5 -димеров [74].
В 1981 году в коллективе ЗА Шабаровой впервые было проведено химическое лигирование З -фосфоримидазолидных производных олигонуклеотидов. Фосфориимидазолид олигонуклеотида d(5TGGCCAAGCTp3), способного к образованию конкатемерной двуцепочечной структуры и уже использовавшегося ранее в исследовании реакции лигирования под действием карбодиимида [16], получали в реакции действием карбодиимида в растворе имидазола. Получившееся З -фосфоримидазольное производное олигонуклеотида инкубировали в N-метилимидазольном буфере [75]. Суммарный выход продуктов лигирования, содержащих от 2 до 7 фрагментов исходного олигонуклеотида, достигал 80-90%. Авторы подчеркивали важную роль именно N-метилимидазола, поскольку другие третичные амины не проявляли каталитического эффекта. По предположению авторов, помимо основной роли основания, увеличивающего нуклеофильность 5 -ОН группы, N-метилимидазол с большей легкостью трансаминирует протонированную форму фосфоримидазолида, образуя более активное производное. Исследование лигирования З -фосфоримидазолидов не получило развития, поскольку образование таких производных в пребиотических условиях событие гораздо менее вероятное, чем 5 -фосфоримидазолидов, которые образуются с 15% выходом даже при медленном высыхании раствора, содержащего имидазол и нуклеозидмонофосфат [76].
Зависимость эффективности реакции лигирования от рн буфера и присутствия ионов магния
Для исследования реакции неферментативного матрично-зависимого лигирования олигонуклеотидов в составе комплементарного комплекса была предложена модельная система, состоящая из трех олигонуклеотидов, в которой 2 ,3 -циклофосфат одного и б -гидроксильная группа второго олигонуклеотида сближены за счёт образования комплекса с комплементарной матрицей (Рис. 14, А). Для того, чтобы избежать увеличения степени расщепления фосфодиэфирных связей внутри олигонуклеотидов в условиях ускорения реакции трансэтерификации, олигонуклеотиды I и II состояли полностью из дезоксирибозвеньев, а олигонуклеотид Ш-гОр содержал на З -конце рибозвено, несущее г .З -циклофосфат. В качестве З -фрагмента использовали как олигонуклеотид равной с Ш-гС р длины (II), так и более короткий олигонуклеотид (Ию).
Для получения олигонуклеотида с 2 ,3 -циклофосфатом 5 -[32Р]-меченный олигонуклеотид Ш-г(СрА), содержащий 2 рибозвена на З -конце, инкубировали в присутствии 0.1 М гидроксидом натрия, что приводило к количественному расщеплению фосфодиэфирной связи между З -концевыми рибонуклеотидными звеньями с образованием на конце З (или 2 )-фосфата (олигонуклеотид Ш-гСр).
Инкубация олигонуклеотида Ш-гСр с 1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимидом (EDAC), приводила к олигонуклеотиду, несущему 2 ,3 -циклофосфат (Ш-гС р) (Рис. 14, Б). Степень превращения олигонуклеотида Ш-гСр в Ш-гОр, то есть выход реакции циклизации, оценивали по соотношению интенсивностей полос Ш-гСр и 1П-гС р после разделения реакционной смеси электрофорезом в 15%-ном дПААГ. Выход реакции циклизации был количественным (более 99%). Образование 2 ,3 -циклофосфата доказывали обработкой олигонуклеотида Ш-гОр 0.01 М раствором HCI, что приводило к гидролизу циклофосфата с образованием олигонуклеотида с 2 - или З -фосфатом, характеризующегося электрофоретической подвижностью в денатурирующем 20%-ном ПААГ отличной от олигонуклеотида Ш-гС р (первичные данные не приведены).
Для образования двуцепочечного комплекса 1/(11+Ш-гС р) олигонуклеотиды нагревали в соответствующем буфере до 50С, после чего медленно охлаждали до 10С. Эффективность образования комплекса оценивали по соотношению интенсивности полос после разделения реакционной смеси в 15%-ном нативном ПААГ. В используемых условиях выход комплекса составлял не менее 95% (Рис. 15).
В большинстве экспериментов комплекс инкубировали при 37С, поскольку при данной температуры реакция расщепления РНК исследована наиболее детально, и при более низких температурах, поэтому можно считать, что во всех используемых условиях олигонуклеотиды находятся преимущественно в составе тройного комплекса 1/(11ю+1И-гС р).
Поскольку реакция трансэтерификации протекает по механизму нуклеофильного замещения, в котором в качестве нуклеофила выступает гидроксогруппа, то эффективность протекания реакции должна зависеть от значения рН, которое определяет нуклеофильность атома кислорода атакующей группы. Влияние рН на эффективность протекания реакции лигирования изучали, инкубируя комплекс олигонуклеотидов в буферах с рН от 6.0 до 8.8. Диапазон значений рН был выбран из соображений, что со снижением рН ниже 6 значительно повышается скорость гидролиза г .З -циклофосфата, а при значениях рН выше 9 ускоряется гидролиз связей в РНК. Указанный диапазон рН обеспечивали, используя два буфера - какодилатный (рН от 6.0 до 7.2) и Трис-HCI (рН от 7.2 до 8.8), которые имеют перекрывающееся значение рН 7.2, что позволяет сравнивать два буфера различной природы. На основании предварительных экспериментов были выбраны условия инкубации (37С, 72 ч), при которых в реакционной смеси обнаруживались олигонуклеотиды большей длины - продукты лигирования.
Как видно из диаграммы (Рис. 16, светлые столбцы) эффективность лигирования возрастает с ростом значений рН. Наблюдаемая зависимость соответствует предположению, что увеличение рН вызывает ускорение реакции неферментативного лигирования за счет увеличения нуклеофильности атакующей 5 -гидроксильной группы, что соответствует механизму основного катализа. Значения выходов, полученные при рН 7.2 в какодилатном и Трис-НСІ буферах, различались не более, чем на 0.3%, что свидетельствует об отсутствии значительного влияния смены буфера на эффективность реакции лигирования; в дальнейшем приводится только среднее значение.
Рекомбинация молекул рнк через сопряженные акты расщепления/лигирования в присутствии комплементарной матрицы
Известно, что фосфодиэфирные связи в участках рибонуклеиновых кислот с несовершенной вторичной структурой (выступающие нуклеотиды, петли и др.) имеют гораздо более низкую стабильность и легче вступают в реакцию трансэтерификации, чем рибосвязи, вовлеченные в образование двойной спирали [149].
Представим ситуацию, когда содержащий г .З -циклофосфат фрагмент N p, образующийся в результате расщепления фосфодиэфирной связи NpNi, вступит в реакцию лигирования не с 5 -гидроксильной группой Ni-oro нуклеотида отщепленного фрагмента, а с 5 -гидроксильной группой другого фрагмента, оказавшегося поблизости. В этом случае, взаимодействие будет приводить к образованию продукта лигирования с новой последовательностью [2].
Мы предположили, что аналогичные реакции могут протекать в комплексе частично комплементарных олигонуклеотидов. Возможный сценарий включает
1) образование частично-комплементарными олигонуклеотидами комплексов, состоящих из двуцепочечных участков и «нависающих» одноцепочечных фрагментов;
2) расщепление фосфодиэфирных связей в одноцепочечных участках и, как результат, образование концевого 2 ,3 -циклофосфата на последнем нуклеотиде, оставшемся в составе двуцепочечной спирали;
3) взаимодействие 2 ,3 -циклофосфата с 5 -гидроксильной группой соседнего фрагмента с образованием новой фосфодиэфирной связи. Таким образом, в результате двух последовательных неферментативных реакций из нескольких частично комплементарных молекул РНК может образоваться новая молекула РНК (Рис. 26).
Для исследования возможности протекания такой реакции мы использовали 16-звенный химерный ДНК-РНК олигонуклеотид, IN-rGpA, содержащий два рибонуклеотида rGrA на З -конце. Гибридизация его с комплементарной ДНК-матрицей lg и олигодезоксирибонуклеотидом Ию приводит к образованию тройного комплекса с выступающим рибозвеном (гА), не участвующим в образовании комплементарных взаимодействий. Отщепление рибоаденилата приведет к образованию Ш-гО р,содержащему 2 ,3 -циклофосфат, который, как мы показали, может вступать в реакцию лигирования с 5 -гидроксигруппой близлежащего олигонуклеотида. Таким образом, последовательность актов расщепления и лигирования, приводящая к образованию молекулы с новой последовательностью, является простейшей моделью неферментативной рекомбинации молекул РНК. Поскольку обе реакции - расщепление и лигирования, являются реакциями трансэтерификации, то можно предположить, что ионы металлов может катализировать обе реакции.
Согласно литературным данным, из опробованных нами металлов, наибольшую каталитическую активность в расщеплении РНК имеет ион свинца РЬ2+ [139, 150, 151]. Мы показали каталитическое действие ионов свинца на реакцию неферментативного матрично-зависимого лигирования олигонуклеотидов HI-rG p и II в комплексе с олигонуклеотидом-матрицей lg.
Инкубация реакционной смеси, содержащей тройной комплекс в присутствии различных концентраций ионов свинца РЬ2+ при рН 7.2, в течение 96 ч при 37С приводило к образованию продуктов лигирования. На диаграмме представлены выходы продукта лигирования (Рис. 27).
Диапазон максимальной эффективности лигирования находится в пределах концентраций ионов свинца от 1 до 10 мМ, а максимальный выход продукта лигирования составил около 6%. Выходы продукта лигирования в реакциях лигирования и расщепления/лигирования имеют сравнимые значения (Рис. 21, А и Рис. 27), что может свидетельствовать о лёгкости протекания первой стадии расщепления и образования 2 ,3 -циклофосфата. Полученные данные демонстрируют принципиальную возможность протекания комбинированной реакции расщепления/лигирования в присутствии ионов металлов в роли катализаторов, а следовательно, и возможность неферментативной рекомбинации молекул РНК.
Для исследования сопряженной реакции расщепления/лигирования РНК была выбрана модельная система, состоящая из двух частично комплементарных олигонуклеотидов Lig и Tern. Последовательности олигонуклеотидов были выбраны таким образом, что З -часть олигонуклеотида Tern комплементарна 5 -области олигонуклеотида Lig, а З -часть Lig - 5 -области Tern. Гибридизация этих олигонуклеотидов может приводить к образованию комплексов различной длины, при этом тетрааденилатные фрагменты олигонуклеотида Lig не участвуют в комплексообразовании, а образуют нависающие концы (Рис. 28, А).
Гидролиз фосфодиэфирной связи гидроксидом натрия
а) К 1 нмоль олигонуклеотида в 5.5 мкл воды добавляли 1 мкл буфера для кинирования, 0.1 мКю [у-32Р]-АТР (удельная активность 3000 Кю/ммоль) в 3 мкл и 0.5 мкл (5 ед.акт.) Т4-полинуклеотидкиназы. Реакционную смесь объемом 10 мкл инкубировали 1 час при 37С.
б) Для количественного фосфорилирования олигонуклеотида II реакцию проводили в модифицированных условиях. К 1 нмоль олигонуклеотида II в 20.5 мкл воды добавляли 5 мкл 10 мМ АТР, содержащего 0.1 мКю [у-32Р]-АТР (удельная активность 3000 Кю/ммоль), 3 мкл буфера для кинирования и 1.5 мкл (15 ед. акт.) Т4-полинуклеотидкиназы. Реакционную смесь объемом 30 мкл инкубировали в течение 12 часов при 4С, после чего добавляли еще 1 мкл (10 ед. акт.) фермента и инкубировали 1 час при 37С.
В обоих случаях, по завершении инкубации, к реакционной смеси добавляли 5 мкл буфера Б и наносили на 20%-ный ПААГ (соотношение N,N -метиленбисакриламид / акриламид = 1 : 39), содержащий 8 М мочевину (далее дПААГ). Электрофорез проводили при Е = 40 В/см в течении 2 часов в буфере ТВЕх1. После окончания электрофореза положение олигонуклеотида в геле определяли экспонированием на рентгеновскую пленку в течение 3 минут. Полоску геля, содержащую меченый олигонуклеотид, помещали в ячейку для электроэлюции, заполненную буфером ТВЕхО.1, олигонуклеотид элюировали на ДЭАЭ-бумагу при 100 В в течение 20 минут. Продукт элюировали с бумаги 2 М водным раствором LiCI04, после чего к элюату добавляли 5 объемов ацетона и олигонуклеотид осаждали центрифугированием (5 мин, 14000 об./мин) (далее центрифугирование в стандартных условиях) Осадок промывали ацетоном, растворяли в 10 мкл буфера Г и хранили при -20С.
Для расщепления фосфодиэфирной связи между рибозвеньями в химерном ДНК/РНК олигонуклеотиде реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 1 нмоль олигонуклеотида и 0.1 М NaOH, инкубировали при 90С в течение 15 мин. Затем объем реакционной смеси доводили водой до 50 мкл и продукты реакции осаждали добавлением 5 мкл З М ацетата натрия рН 5.2 и 150 мкл 96%-ного этилового спирта. Осадок нуклеиновых кислот отделяли центрифугированием в стандартных условиях, дважды промывали 80%-ным этанолом, растворяли в 10 мкл буфера Г и хранили при -20С.
Олигонуклеотид, несущий 2 ,3 -циклофосфат, получали путем инкубации олигонуклеотида с концевым З -фосфатом в 40 мкл раствора, содержащего 50 мМ этил-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (далее EDAC) в буфере MES, в течение 1 ч при 37С, как описано в [7]. По окончании реакции к реакционной смеси добавляли 60 мкл воды, 10 мкл 3 М AcONa рН 5.2 и 300 мкл 96%-ного этилового спирта. Осадок олигонуклеотида отделяли центрифугированием при 14000 об./мин в течение 10 мин, дважды промывали 85%-ным этиловым спиртом и высушивали, после чего растворяли в буфере Г и хранили при -20С.
Олигонуклеотид, несущий 2 ,3 -циклофосфат, инкубировали в 30 мкл 0.01 М раствора HCI при 37С в течение 15 мин [7]. После окончания инкубации к реакционной смеси добавляли 30 мкл 0.01 М NaOH и осаждали олигонуклеотид добавлением 300 мкл 2% LiCI04 в ацетоне с последующим центрифугированием в стандартных условиях. Осадок промывали 300 мкл ацетона, растворяли в 5 мкл буфера Б и наносили на 20%-ный ПААГ, содержащий 8 М мочевину.
В исследовании для различных экспериментов использовали 50 мМ какодилатный, имидазольный, Трис-HCI и бисТрис-HCI буферы. Гибридизацию олигонуклеотидов проводили в реакционной смеси объемом 30 мкл, содержащей каждый из олигонуклеотидов в концентрации от 10 до 30 мкМ, 50 мМ буфер и 200 мМ NaCI. Смесь нагревали до 45С и затем медленно (0.3С/мин) охлаждали до 10С. Комплекс хранили при температуре 4С. В случае олигонуклеотида, содержащего 2 ,3 -циклофосфат, комплекс вносили в реакционную смесь не позднее, чем через 6 часов после его получения.
а) Зависимость эффективности реакции неферментативного лигирования от рН изучали, используя эквимолярный комплекс олигонуклеотидов 1/(11+[32Р]-Ш гОр). Стандартную реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 20-40 пкмоль комплекса олигонуклеотидов ( 50 000 имп./мин по Черенкову), инкубировали в соответствующем буфере в выбранных условиях. В качестве буферов использовали 50 мМ какодилат натрия рН 6.0, 6.4, 6.8, 7.2 и 50 мМ Трис-НСІ рН 7.2, 7.8, 8.4, 8.8, в параллельной серии экспериментов буферы содержали также 5 мМ MgCI2. Время инкубации в нескольких независимых экспериментах изменяли от 3 до 5 суток при температурах 25 или 37 С. рН буфера, его концентрация, температура и время инкубации указаны в подписях к соответствующим рисункам. После завершения инкубации к реакционной смеси добавляли 30 мкл воды, 5 мкл З М AcONa рН 5.2, 150 мкл 96%-ного этилового спирта, выдерживали раствор 12 часов при -20С и затем осаждали центрифугированием в стандартных условиях.
б) Зависимость от рН эффективности образования продуктов лигирования в сопряженной реакции неферментативного расщепления/лигирования изучали, используя комплекс олигонуклеотидов (5 -[32P]-l_ig+l_ig)/Tem. Стандартную реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 60 пкмоль комплекса олигонуклеотидов ( 50 000 имп./мин по Черенкову), инкубировали в 25 мМ буфере бисТрис-пропан-НСІ рН 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 в присутствии 5 мМ МдСЬ в течение 3 суток при 37С.
