Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Классическая аффинная модификация 9
1.2. Фотоаффинная модификация 12
1.3. Каталитически компетентное мечение 21
1.4. Каталитически компетентное мечение инициирующего комплекса РНК-полимеразы Escherichia coli 24
1.5. Каталитически компетентное мечение ДНК-полимераз 26
1.6. Фотомодификация с переносом энергии 29
1.7. Фотосенсибилизированная модификация белков—переносчиков лекарств 32
1.8. Бинарная система фотоаффинных реагентов 35
1.9. Бинарная система фотоаффинных реагентов для селективной модификации ДНК-полимераз 37
2. Экспериментальная часть 40
2.1. Материалы 40
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Введение [32Р]-метки в 5 -конец олигонуклеотида 42
2.2.2. Подготовка ДНК-дуплекса к синтезу ДНК, катализируемому ДНК-полимеразами 42
2.2.3. Электрофорез по Леммли 42
2.2.4. Количественная обработка гелей 43
2.2.5. Выделение рекомбинантнойДНК-полимеразы Tte 43
2.2.6. Синтез ДНК, катализируемыйДНК-полимеразой fi илиДНК-полимеразой Tte 43
2.2.7. Определение кинетических параметров 44
2.2.8. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPA 44
2.2.9. Фотоаффинная модификация ДНК-полимераз 44
2.2.10. Условия УФ-облучения 45
2.2.11. Оценка эффективности и селективности модификации ДНК-полимераз 45
2.2.12. Выделение ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота 46
2.2.13. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами ядерного экстракта 46
2.2.14. Фотоаффинная модификация белков ядерного (клеточного) экстракта 46
2.2.15. Иммуноанолиз антителами против белков репарации 47
3. Результаты и их обсуждение 48
3.1. Высокоселективная фотоаффинная модификация ДНК-полимераз 48
3.1.1. Структуры и фотохимические характеристики аналогов dNTP 51
3.1.2. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В35 53
3.1.3. Влияние природных dNTP на фотосенсибилизированную модификаїїшо ДНК-полимеразы Tte 57
3.1.4. Селективная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPA 57
3.1.5. Селективная модификация ДНК-полимеразы а-праймазы 60
3.2. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов 64
3.2.1. Субстратные свойства FAB-4-ddUTP 66
3.2.2. Влияние структуры матрицы на эффективность модификации ДНК-полимеразы Р 68
3.2.3. Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность модификации ДНК-полимеразы J3 70
3.2.4. Фотоаффинное мечение ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях 10-кратного избытка реакционноспособного праймера 72
3.3. Идентификация белков в ядерном экстракте методом фотоаффинной модификации с использованием различных фотореагентов 74
3.3.1. Структуры ДНК и фотореагентов, использованных в работе 76
3.3.2. Синтез фотореакционноспособных интермедиатов репарации оснований 77
3.3.3. Фотомодификация белков ядерного экстракта 81
3.4. Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте 87
3.4.1. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта с использованием различных ДНК-структур 88
3.4.2. Сравнение набора продуктов модификации в клеточном и ядерном экстрактах 91
3.4.3. Относительная селективность и эффективность модификации ДНК-полимеразы fie ядерном экстракте 91
Выводы 96
- Фотоаффинная модификация
- Фотосенсибилизированная модификация белков—переносчиков лекарств
- Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов
- Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте
Введение к работе
Важнейшим направлением биохимии и молекулярной биологии является изучение ансамблей белков, а не только их отдельно взятых компонентов. В последнее время появилось представление о протеомах, обеспечивающих жизненно важные функции клеток и целых организмов, и возникло специальное направление их исследования. Например, протеомными ансамблями являются комплексы белков, обеспечивающие репликацию и репарацию ДНК. Центральную роль в осуществлении обоих процессов играют матричные ферменты - ДНК-полимеразы. В клетках высших эукариот основную роль в репликации и репарации ДНК играют ДНК-полимеразы а, 5, є и ДНК-полимераза р. В последние годы у эукариот открыты новые ДНК-полимеразы X, ц и і, что делает особенно актуальным идентификацию ДНК-полимераз в ансамблях репликации и репарации. ДНК-полимеразы осуществляют специализированные функции в тесном взаимодействии с множеством других ферментов и факторов, таких как репликативный белок A (RPA), репликативный фактор С (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза-1 (АРЕ1), ДНК-гликозилазы, ДНК-лигазы, поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1 (PARP-1) и другие белковые факторы. Проблема состоит в понимании механизма действия и координации этих ферментов и факторов в процессах репликации и репарации ДНК. Несмотря на значительные усилия, направленные на изучение репликации и репарации ДНК эукариот, детальный механизм белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий, а также их динамика до сих пор остаются невыясненными.
Как известно, рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс и другие физические методы исследования наиболее информативны и эффективны для изучения отдельных белков и некоторых простых комплексов. Например, метод рентгеноструктурного анализа (РСА) предоставляет наиболее детальную информацию о структуре отдельных биополимеров и их комплексов с лигандами. Однако этот метод обладает существенными недостатками: во-первых, он пока малопригоден для изучения сложных многокомпонентных комплексов из-за трудностей получения кристаллов таких структур. Кроме того, РСА не дает представления о динамике взаимодействия компонентов комплекса. И, наконец, всегда остается сомнение, применимы ли данные, полученные для кристаллов, к комплексам в растворе и, тем более, in vivo.
Методом сайт-направленного мутагенеза можно получать информацию о функции конкретной аминокислоты или же о значении фрагментов полипептидной цепи в функционировании белка. В то же время мутантные формы белков могут иметь изменённую третичную структуру и, как следствие, измененные функции по сравнению с природными, что создает проблему в интерпретации полученных результатов. Кроме того, применение данного подхода пока ограничено при изучении многокомпонентных структур и процессов in vivo.
На протяжении многих лет метод аффинной модификации широко используется для изучения молекулярной организации белковых комплексов, таких как системы репликации и репарации ДНК, а также транскрипции и трансляции. Метод основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание их ферментом. Этот подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером с последующим ковалентным присоединением аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр или находящимся в непосредственной близости от него. Эффективность этого подхода проявляется в наибольшей степени при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур.
Для успешного применения аффинной модификации в изучении многокомпонентных систем в том числе для идентификации определенных белков в клеточных и ядерных экстрактах необходимо повышение селективности и эффективности данного метода. Одним из путей решения этой задачи является фотосенсибилизированная модификация, основанная на использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов. Особый интерес представляет создание и применение новых реагентов для повышения селективности и эффективности модификации ДНК-полимераз и других белков, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНК, в многокомпонентных системах, таких как клеточные и ядерные экстракты. Усовершенствование этого подхода, безусловно, актуально для получения достаточных количеств меченых белков с целью их последующей идентификации.
Целью данной работы являлось совершенствование метода высокоселективной и эффективной модификации ДНК-полимераз, основанного на использовании фотохимической сенсибилизации, в реконструированных системах на примере ДНК-полимеразы р, ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии факторов репликации ДНК, а также идентификации ДНК-полимераз этим методом в клеточных и ядерных экстрактах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: повышение селективности модификации различных ДНК-полимераз в присутствии других ДНК-связывающих белков; подбор оптимальных структур реагентов и сенсибилизаторов для создания новых, наиболее эффективных пар фотореагент - сенсибилизатор; увеличение эффективности модификации ДНК-полимераз в условиях избытка реагента; фотосенсибилизированная модификация каталитических субъединиц ДНК-полимераз в многокомпонентных системах, таких как ДНК-полимераза а-праймаза, клеточный экстракт фибробластов мыши и ядерный экстракт семенников крупного рогатого скота.
Фотоаффинная модификация
Фотоаффинное мечение белков — удобная и широко применяемая разновидность метода аффинной модификации. Удобство его применения связано с тем, что фотореагенты до облучения светом инертны и можно осуществить фотоприсоединение после формирования правильного комплекса белок лиганд (фермент«субстрат). Это упрощает в большинстве случаев интерпретацию полученных данных. Процессы, происходящие в репликативном комплексе, характеризуются высокой динамичностью. События происходят в миллисекундном диапазоне, и одним из немногих способов изучения таких быстро протекающих изменений областей контакта фермента, матрицы и продукта является применение быстрого фотохимического мечения фермента фотоактивными аналогами субстрата или праймера, которое можно осуществить за миллисекунды, используя импульсное облучение. Фотоактивируемые группы позволяют не только определить взаимное расположение отдельных субъединиц всех участников репликации относительно ДНК и друг друга, но и исследовать динамику функционирования таких систем. Для этого уже создана основательная химическая база в виде фотоактивных аналогов dNTP и методов введения фотоактивных нуклеотидных остатков в определенные участки ДНК. В случае фотореагентов, содержащих арилазидогруппы, существует возможность вариации длины линкера и типа арилазидогруппы, что способствует повышению эффективности и селективности модификации биополимера. К настоящему времени синтезирован широкий набор аналогов dNTP, несущих фотореакционноспособную арилазидогруппу, присоединенную через линкер к азотистому основанию. Такие аналоги являются эффективными субстратами ДНК-полимераз [11-13], и они могут быть использованы для ферментативного синтеза фотореакционноспособных ДНК-субстратов либо интермедиатов процессов метаболизма ДНК, в частности репликации и репарации ДНК. Введение при синтезе фотореакционноспособных остатков dNMP в структуры ДНК было эффективно использовано для изучения механизма их взаимодействия с факторами репликации: репликативным белком A (RPA) и репликативным фактором С (RFC) [12, 14-20]. На основании полученных результатов были сделаны выводы о роли отдельных субъединиц этих факторов в их взаимодействии с ДНК. Репликативный белок А играет важную роль в процессах репликации, репарации и рекомбинации, его главной функцией является связывание одноцепочечной ДНК [21]. RPA состоит из трех субъединиц с молекулярными массами 70 (р70), 32 (р32) и 14 (р14) кДа. Известно, что большая субъединица р70 несет основную ДНК-связывающую активность, в то время как роль малых субъединиц интенсивно исследуется.
Показано, что RPA стимулирует активность ДНК-полимераз а, 5 и є [22-24]. Для анализа взаимодействия репликативного белка А человека с праймер матричными системами, моделирующими структуры ДНК в репликативной вилке, были использованы дуплексы с 5 -выступающими одноцепочечными концами матрицы длиной 4, 9, 13, 14, 19 и 31 н.о. Остаток уридин-5 -монофосфата, содержащий фотореакционноспособную 2-нитро-5-азидобензоильную группу (NAB-dUMP), вводился в З -конец праймера с помощью ДНК-полимераз. Последующее УФ-облучение приводило к ковалентному присоединению праймера преимущественно к р32- либо р70-субъединице RPA в зависимости от длины одноцепочечного участка матрицы и концентрации белка [14-16]. Субъединица с молекулярной массой 14 кДа не подвергалась модификации, что свидетельствует о ее удаленности от области контакта с ДНК. Было найдено, что в случае выступающего конца матрицы длиной 31 н.о. ковалентное присоединение фотореакционноспособного праймера происходит только к р32, а при длине 19 н.о. дополнительно наблюдается сшивка субъединицы р70, но эффективность этой сшивки в 15 раз ниже, чем с р32. В то же время использование выступающего конца матрицы длиной 9 н.о. приводит к модификации только р70 [14-16]. Таким образом, показано, что конформация RPA зависит от длины выступающего одноцепочечного участка матрицы [14]. В случае, когда выступающий конец матрицы достаточно длинный (19 нуклеотидов), модификация р32 более глубока по сравнению с модификацией при использовании ДНК с коротким концом матрицы (9 нуклеотидов). По всей вероятности, р32 находится в более тесном контакте с З -концом праймера длинной матрицы. Интенсивность модификации р70 находится в обратной зависимости от длины выступающего конца матрицы, следовательно, большая субъединица располагается дальше от 3 -конца праймера, чем субъединица р32. Глобулярная компактная конформация RPA при связывании короткого одноцепочечного участка ДНК и вытянутая форма при связывании длинной ДНК были также найдены с помощью электронной микроскопии [25,26.]. На основании полученных данных была предложена модель комплекса RPA с ДНК (рис. 1.2.), согласно которой р70 взаимодействует с одноцепочечным участком матрицы. р32 находится вблизи от 3 -конца праймера, а р14 защищена от модификации большими субъединицами. При этом RPA конкурирует с ДНК-полимеразами за связывание с ДНК, поскольку добавление RPA приводит к ингибированию модификации ДНК-полимераз [15]. Однако при использовании фотоактивных аналогов dTTP с протяженными линкерами (16-19 А) ингибирование модификации ДНК-полимеразы происходит в меньшей степени [20]. Авторы объясняют этот факт формированием комплекса ДНК-полимераза p-RPA-ДНК, в котором ДНК-полимераза р располагается на расстоянии 16-19 А от З -конца праймера. Фотоаффинная модификация применялась также для выяснения способности каждой из субъединиц RPA связывать ДНК и роли р70 в расположении остальных субъединиц [17]. Субъединица р70, находясь в реакционной смеси в физиологических концентрациях (0,4 мкМ), способна эффективно сшиваться с 3 -концом фотореакционноспособного праймера, причем выход сшивки уменьшался в присутствии нативного RPA.
Сшивка субъединицы р32 с этим праймером наблюдалась в том случае, если ее концентрация была на два порядка выше по сравнению с концентрацией субъединицы р70. Кроме того, методом задержки ДНК в геле было обнаружено, что только р70 связывается с ДНК фага М13тр18. Таким образом, данные, полученные в работе [17], где использовались отдельные субъединицы RPA, подтверждают предложенную ранее модель (рис. 1.2.) [14, 16], согласно которой преимущественно тяжелая субъединица RPA связывается с одноцепочечным участком матрицы, ориентируя около З -конца праймера субъединицу р32, функция которой заключается в связывании либо З -конца праймера, либо участка матрицы вблизи З -конца праймера [17]. В то же время ДНК-связывающий домен расположен на субъединице р32. Для изучения взаимодействия RPA с ДНК был также использован дуплекс ДНК, содержащий фотоактивную группу на 5 -конце праймера и выступающий З -конец матрицы [19]. В этом случае модификации подвергалась субъединица р70. Интересно отметить, что, в отличие от З -концевого реагента, интенсивность модификации ДНК-полимеразы Р увеличивалась при добавлении RPA. На основании полученных данных также была предложена модель взаимодействия RPA с дуплексом ДНК, содержащим выступающий З -конец матрицы. Согласно этой модели, р70 связывает одноцепочечную часть матрицы и расположена вблизи 5 -конца праймера. При этом р32 и р14 удалены от 5 -конца праймера. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения о полярности связывания одноцепочечной ДНК репликативным белком А. Поскольку RPA принимает участие в репарации ДНК [21], было изучено взаимодействие RPA с ДНК, содержащей одноцепочечные бреши разной длины, -интермедиатом эксцизионной репарации нуклеотидов. Такие структуры также возникают, по-видимому, на отстающей цепи во время синтеза фрагментов Оказаки [27]. Полярность связывания RPA в брешах показана в работе [28], где с помощью метода фотоаффинной модификации изучено взаимодействие репликативного белка А и ДНК-полимеразы р с ДНК-структурами, содержащими фотореакционноспособные группы на 3 - и 5 -концах брешей различной длины. Фотореакционноспособный остаток dUMP вводили в З -конец бреши с помощью ДНК-полимеразы р в присутствии фотореакционноспособного аналога dUTP.
Фотосенсибилизированная модификация белков—переносчиков лекарств
Метод высокоселективного мечения был применен для идентификации компонентов клеточной мембраны, ответственных за связывание лекарственных препаратов при раковой терапии. Приобретаемая устойчивость опухолевых клеток к цитотоксичным лекарствам является важной клинической проблемой в раковой терапии. Эта устойчивость связана с понижением концентрации лекарственных препаратов в клетке и их последующим выведением. Поэтому действие мультилекарственных переносчиков интенсивно изучается разными методами, включая аффинную модификацию. Селективная модификация мембранных и соседних белков может быть достигнута как in vitro, так и in vivo методом фотосенсибилизации 5 -йодонафталин-1 -азидом (INA) [69]. INA очень гидрофобен и эффективно распределяется в липидном бислое различных клеточных мембран. В результате фотолиза при А,=314 нм это соединение быстро превращается в реакционноспособный нитрен, который ковалентно взаимодействует с липид-содержащими доменами белков. При длине волны выше 370 нм абсорбция INA незначительна, и фотолиз при этом не происходит. Однако в присутствии 3-аминопирена или 8-анилинонафталин-1-сульфоната и других хромофорных групп с последующим облучением при Х 310 нм было обнаружено эффективное превращение INA в реакционноспособные частицы [69-71]. Механизм возбуждения азида в ароматических соединениях все еще не установлен, этот процесс может включать либо перенос энергии, 4р либо перенос электрона [72]. Фотосенсибилизированная модификация мембран-связанных белков с использованием [l25I]INA включает следующие шаги: [125I]INA распределяется в мембране (рис. 1.6., А), которая затем облучается светом с длиной волны больше 370 нм. Поскольку в этой области поглощает только фотосенсибилизатор, происходит непрямая активация только молекул INA, расположенных на близком расстоянии от фотосенсибилизатора, другие молекулы реагента остаются неактивными (рис. 1.6., Б). В результате модифицируются белки, содержащие фотосенсибилизатор, или соседние с ним, другие белки остаются немечеными (рис. 1.6., В). Мягкие условия облучения приводят к селективной активации INA без дезактивации и/или фотоденатурации биополимеров. Модификация белка-мишени может быть осуществлена в процессе амплификации, при которой локально и в зависимости от времени усиливается радиоактивный сигнал, что позволяет обнаруживать минорные мембранные компоненты, которые не могут быть выявлены при случайной модификации [70]. Существует много способов применения этой техники для изучения мембранных белков в живых клетках, один из них — идентификация белков-переносчиков лекарств в клетках.
В результате исследований компонентов клеточной мембраны установлено, что устойчивость к лекарствам связана с экспрессией гликопротеина массой 170 кДа (Р170), который, по-видимому, действует как переносчик лекарств в клетках [73]. В рассматриваемой работе фотосенсибилизированная модификация с использованием [125I]INA в качестве липофильного фотореагента, имеющего сродство к клеточным мембранам, применялась для исследования внутриклеточных взаимодействий, происходящих между цитотоксичными лекарствами и соседними мембранными белками в клетках человеческой KB карциномы [74]. Доксорубицин, который является как хемотерапевтическим лекарством, так и хромофором, использовался в качестве фотосенсибилизатора. Клетки последовательно обрабатывались доксорубицином и [125I]INA с последующим облучением при длине волны больше 450 нм. Р170 был идентифицирован как основной продукт мечения в клетках, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, тогда как в чувствительных к лекарствам клетках многочисленные мембранные белки модифицировались неспецифически. Этот результат указывает на то, что Р170 непосредственно взаимодействует с лекарством в живых клетках, и подтверждает предложенное ранее участие Р170 в механизме устойчивости к лекарствам in vivo [75]. Эта работа демонстрирует, что метод фотосенсибилизированной модификации является инструментом для выявления специфических взаимодействий между хромофорами и белками in vivo. Следует, однако, отметить некоторые ограничения в применении данного метода. (1) Фактически, он не является классической аффинной модификацией, поскольку INA не обладает сродством к какому-либо связывающему сайту лиганда и не может рассматриваться как специфический лиганд. Белки модифицируются по случайным позициям или, скорее всего, по их гидрофобным доменам. Следовательно, может быть получено разрешение только на субъединичном уровне; картирование активных центров белков невозможно в этом случае. (2) Несмотря на высокую гидрофобность, INA может обмениваться с гидрофобными сайтами растворимых белков или прилегающими участками клеточных мембран [75]. (3) Процесс фотосенсибилизации может приводить к модификации несвязанных белков, располагающихся по соседству с фотосенсибилизатором.
Так как вслед за фотолизом INA идет процесс переноса энергии и активации [ IJINA, то реакционноспособные частицы могут диффундировать на некоторые расстояния до окончательного связывания с белком [70]. Этот последний недостаток может быть исключен при замене INA другим гидрофобным фотоактивным агентом, который после фотолиза образует только высокоактивные интермедиаты с малым временем жизни. 1.8. Бинарная система фотоаффинных реагентов Впервые бинарная система фотоаффинных реагентов (БСФР) была предложена для высокоэффективной модификации ДНК-мишеней [76], а позднее для увеличения селективности модификации ДНК-полимераз [77]. Принципиальная схема модификации белков с помощью БСФР представлена на рис. 1.7. Белок-мишень имеет 2 соседних сайта связывания двух лигандов (рис. 1.7., А) и образует комплекс с реагентом - фотоактивным и радиоактивно меченым аналогом одного из лигандов и с фотосенсибилизатором -аналогом другого лиганда, содержащим хромофорную группу (рис. 1.7., Б). В комплексе активная группа реагента находится в непосредственной близости с фотоактивной группой сенсибилизатора. После облучения светом соответствующей длины волны (ближний УФ или видимый свет) энергия изначально поглощается сенсибилизатором и затем переносится на фотореагент (возможным механизмом является также перенос электронов) (рис. 1.7., В). Возбужденный реагент активируется и пришивается к белку-мишени внутри или вблизи сайта связывания (рис. 1.7., Г). Природа фотоактивной группы и условия эксперимента не позволяют реагенту активироваться в растворе или на большом расстоянии от сенсибилизатора. В качестве фотоактивных групп используют производные ароматических арилазидов, а в качестве фотосенсибилизаторов - Следует отметить, что структура реагента и фотосенсибилизатора, и особенно длина линкера, соединяющего аффинную часть с фотоактивной группой реагента, влияет на эффективность переноса энергии [78]. Очевидно, что для проведения высокоселективной модификации белка необходимы оптимальная ориентация и соответствие реакционной способности пары реагент - сенсибилизатор для эффективной активации фотореагента от сенсибилизатора и для избежания прямой активации фотоактивной группы. Так же, как и в случае фотосенсибилизированной модификации и фотомодификации белков с переносом энергии, реагент должен образовывать высокоактивные короткоживущие интермедиаты, чтобы избежать модификации после диссоциации из комплекса реагент»белок-мишень. Другое ограничение — гидрофобность фотосенсибилизирующих групп (пирен, антрацен, перилен), приводящая к неспецифическому связыванию сенсибилизатора с гидрофобными доменами белков или липидных фракций клеток и уменьшению специфичности мечения. Надо также иметь в виду, что в общем случае активация реакционноспособных групп не означает, что они локализованы в активном центре фермента. Возможным является их расположение на расстоянии до 10 А от сенсибилизатора. 1.9. Бинарная система фотоаффинных реагентов для селективной модификации ДНК-полимераз ДНК-полимеразы катализируют синтез ДНК с присоединением dNMP к 3 -концу полинуклеотидной цепи, используя комплементарную полинуклеотидную цепь в качестве матрицы и dNTP как источник остатков dNMP. Селективная модификация ДНК-полимераз фотоактивным праймером в клеточном либо в ядерном экстрактах может осложняться присутствием значительных количеств других ДНК-связывающих белков [32].
Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов
Фотоактивируемые арилазидопроизводные нуклеиновых кислот удобны в качестве аффинных реагентов для модификации ДНК-полимераз и других белков, так как реакционноспособная группа остается инертной до облучения УФ-светом и ее фотоприсоединение к мишени можно осуществить после формирования комплекса фермент-субстрат (белок-лиганд). Однако эти производные демонстрируют, как правило, относительно низкую эффективность пришивки (зачастую 10%). Кроме того, возможно образование ряда "темновых" продуктов, которые искажают получаемую картину. Это создает затруднения при идентификации и секвенировании модифицированных пептидов с помощью метода Эдмана или MALDI масс-спектроскопии. Низкая эффективность ковалентной пришивки арилазидопроизводных нуклеиновых кислот осложняет идентификацию ДНК-полимераз и сопутствующих белков в клеточных и ядерных экстрактах [32]. Поэтому дальнейшее применение метода фотоаффинной модификации для изучения комплексов репликации и репарации ДНК, кроме повышения селективности, требует так же и увеличения эффективности ковалентной пришивки реакционноспособных производных ДНК к ДНК-полимеразам. Для этого было предложено использовать бинарную систему фотоаффинных реагентов — фотореакционноспособный праймер с арилазидогруппой на З -конце и аналог dNTP, несущий сенсибилизатор, для увеличения эффективности модификации ДНК-полимераз. Ранее было найдено, что некоторые бинарные системы фотоаффинных реагентов на основе олигонуклеотидов позволили значительно увеличить эффективность фотомодификации ДНК-мишени, в этом случае удалось достичь 98-99%-ного уровня модификации в условиях избытка реагента по отношению к мишени [120]. Как указано в предыдущем разделе, с помощью бинарной системы фотоаффинных реагентов была проведена высокоселективная модификация термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilic, ДНК-полимеразы (5 человека и ДНК-полимеразы а, в присутствии другого ДНК-связывающего белка - репликативного белка А человека.
Однако эффективность модификации с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов была ниже, чем при прямой модификации фотореакционноспособным праймером при облучении УФ-светом (X. 280 нм). В то же время, применение бинарной системы фотоаффинных реагентов создает целый ряд преимуществ по сравнению с прямым мечением белков (УФ-облучение с А 280 нм). В этом случае для модификации можно использовать более мягкий УФ-свет (Х,=365-450 нм), что позволяет избежать фотоинактивации белков и нуклеиновых кислот. При этом сводится к минимуму неспецифическая модификация. Так как при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов необходимо исключить встраивание в праймер сенсибилизирующего нуклеотидного аналога, впервые был использован терминирующий фотореакционноспособный аналог ТТР дидезокси-ряда (FAB-4-ddUTP), который останавливает дальнейшее удлинение праймера из-за отсутствия З -ОН группы на рибозе. Расстояние между реагентом и используемым сенсибилизатором также может влиять на эффективность мечения, поскольку эффективность резонансного переноса энергии уменьшается с увеличением расстояния между ними [103]. В дополнение к ранее использовавшимся реагентам и сенсибилизаторам, были исследованы новые аналоги dNTP, различающиеся длиной линкера, соединяющего пиренильную или арилазидную группы с азотистым основанием. И наконец, одним из путей повышения эффективности модификации является увеличение избытка реагента по отношению к мишени. Принципиальная схема фотосенсибилизированной модификации, иллюстрирующая основную идею, изображена на рис. 3.1. В условиях прямого мечения фотолиз реагента в растворе идет с той же скоростью, что и в комплексе с мишенью. Фотолизованный реагент, сохраняя сродство к мишени, является конкурентным ингибитором модификации фермента и, кроме того, является источником неспецифического мечения. При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов фотолиз реагента в растворе происходит значительно медленнее, чем в тройном комплексе реагент мишень«сенсибилизатор, и реагент в растворе остается интактным. Таким образом, если реакционноспособный праймер не присоединился ковалентно к ДНК-полимеразе за время жизни комплекса, то фермент может связать вторую молекулу реагента из раствора (рис. З.1., Г).
При этом суммарный выход модификации ДНК-полимеразы увеличивается и значительно уменьшается неспецифический фон. Таким образом, нами были изучены различные подходы для повышения эффективности аффинной модификации ДНК-зависимых ферментов с применением бинарной системы фотореагентов. Использование мягкого УФ-облучения исключало повреждение как ДНК, так и белков, а использование бинарных систем обеспечивало высокую селективность мечения. 3.2.1. Субстратные свойства FAB-4-ddUTP Известно, что некоторые ДНК-полимеразы способны ошибочно встраивать некомплементарные матрице нуклеотиды. При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов для модификации ДНК-полимераз необходимо, чтобы нуклеотид, содержащий сенсибилизатор, не встраивался в праймер, содержащий реакционноспособную группу. Для строгого соблюдения этого условия был синтезирован фотореакционноспособный аналог ТТР дидезокси-ряда - FAB-4-ddUTP. После встраивания остатка FAB-4-ddUMP в праймер дальнейшее удлинение последнего оказьгоалось невозможным. Структурные формулы аналогов ТТР, использованных на данном этапе работы, приведены на рис. 3.2. Применение аналога дидезокси-ряда также полезно при синтезе фотореакционного субстрата в клеточном либо в ядерном экстрактах, поскольку в них всегда присутствуют dNTP, которые могут удлинять праймер после встраивания фотореакционноспособного аналога dNMP. При этом получается спектр праймеров, содержащих фотореакционноспособную группу в разных положениях относительно 3 -конца праймера, что может привести к снижению эффективности, либо к множественной модификации. Удлинение 5 -[ Р]-меченого праймера было проведено ДНК-полимеразами J3 и Tte с использованием праймер-матричной системы II, в которой в 3 -конец праймера в соответствии со структурой матрицы должны встраиваться два остатка ТТР. Структуры олигонуклеотидов см. "Материалы и методы". Как видно из рис. 3.9., ДНК-полимераза р способна эффективно удлинять праймер как в присутствии FAB-4-ddUTP (дор. 6), так и в присутствии FAB-4-dUTP (дор. 7), тогда как ДНК-полимераза Tte менее эффективно включает аналог дидезокси ряда по сравнению с FAB-4-dUTP (дор. 2 и 5, соответственно). Величина Кт для FAB-4-ddUTP в реакции элонгации праймера, катализируемой ДНК-полимеразой р, составляет 2,2 мкМ, что близко к значению Кт для ТТР (5 мкМ), тогда как для ДНК-полимеразы Tte эти значения составляют 140 и 2 мкМ, соответственно. Таким образом, FAB-4-dUTP {Кт=%,Ъ мкМ) является лучшим субстратом для ДНК-полимеразы
Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте
Зачастую количество белков, модифицированных аффинными реагентами недостаточно для идентификации методом секвенирования или масс-спектроскопии. Поэтому любые подходы, увеличивающие селективность и эффективность модификации специфических белков, представляют значительный интерес. Одним из путей увеличения эффективности и селективности аффинной модификации является использование бинарной системы фотоаффинных реагентов. Сближенные в составе комплементарного комплекса группы фотореагента и сенсибилизатора образуют реакционноспособный центр, активируемый длинноволновым УФ-светом в условиях, когда каждая их этих групп в отдельности не является реакционноспособной, таким образом, модификации будут подвергаться только белки, которые могут связывать и фотореагент и сенсибилизатор. Такими белками в частности являются ДНК-полимеразы. Для идентификации в ядерном экстракте ДНК-полимераз, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами эксцизионной репарации оснований, и была применена бинарная система фотоаффинных реагентов. 3.4.1. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта с использованием различных ДНК-структур Поскольку ранее было показано, что наиболее эффективная модификация ДНК-полимераз происходит при использовании фотореакционноспособного праймера, содержащего 2,3,5,6-теграфтор-4-азидобензоильную группу на 3 -конце, и Pyr-6-dUTP в качестве сенсибилизатора, была использована эта пара реагентов для сенсибилизированной модификации белков в ядерном экстракте семенников крупного рогатого скота. Типичная картина модификации белков ядерного экстракта различными ДНК-структурами с использованием FAB-4-ddUTP в присутствии и отсутствие Pyr-6-dUTP при облучении УФ-светом с Х=365 нм показана на рис. 3.19., дор. 3-5. Как видно из рисунка, в условиях фотосенсибилизированной модификации с использованием ник- или флэп-содержащих ДНК-структур существенно увеличивается количество ковалентного аддукта с молекулярной массой 46 кДа (ср. дор. 7 и 5, 6 и 10, рис. 3.19.), который соответствует продукту мечения Pol р ДНК-праймером. Руг-6-dUTP, являясь специфическим лигандом ДНК-полимераз, при облучении УФ-светом с длиной волны 365 нм эффективно индуцирует ковалентное присоединение фотореакционноспособного праймера, сближенного с ним в активном центре ДНК-полимеразы.
При использовании ДНК-структуры, содержащей выступающий 5 -конец матрицы, основным продуктом модификации был белок с меньшей электрофоретической подвижностью М=60 кДа (дор. 11-15). Идентифицировать данный белок не удалось. Возможно, этот продукт соответствует ДНК-полимеразе Р в случае, когда фотореакционноспособный праймер присоединился к другим аминокислотным акцепторам Pol Р, что может изменить электрофоретическую подвижность аддукта. В отсутствие Pyr-6-dUTP или в присутствии 1 -пиренмасляной кислоты, то есть потенциального сенсибилизатора, не присоединенного к dNTP, при облучении светом с Х=365 нм интенсивность мечения была низкой (рис. Аналогичная картина модификации была получена и с использованием другого фотореагента - FAP-8-dUTP (рис. 3.16., А), с той лишь разницей, что в этом случае уровень фотосенсибилизированной модификации ДНК-полимеразы Р был выше. Надо сказать, что для сенсибилизированной модификации впервые применили FAP-группу, которая, согласно недавно полученным результатам, наиболее эффективно образует ковалентные сшивки с мишенями белковой природы при облучении УФ-светом в области 300-320 нм [13]. В связи с этим была сделана попытка усилить эффективность сенсибилизированной модификации за счет использования в качестве фотореагента аналога dNTP, содержащего 4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридильную группу (FAP-8- dUTP), а в качестве сенсибилизатора - аналог dNTP, содержащий пиренильную группу (Pyr-6-dUTP). Следует отметить, что при использовании бинарной системы фотореагентов при облучении УФ-светом с длиной волны 365 нм уровень модификации ДНК-полимеразы (3 выше, чем при "прямой" модификации (облучение УФ-светом с длиной волны 320 нм) в отсутствие Pyr-6-dUTP. В то же время уровень образования ковалентных аддуктов с другими белками экстракта снижается в случае модификации бинарной системой (ср. дор. і и 5, 6 и /0 на рис 3.19.), что говорит о селективности фотосенсибилизированной модификации.
При использовании фотореагента, содержащего FAP-группу для УФ- \jLi облучения светом с длиной волны 320 нм, наблюдается более эффективная модификация не только ДНК-полимеразы р, но и других белков по сравнению с фотореагентом, содержащим FAB-группу (ср. дор. 2 на рис. 3.16., А и дор. 6 на рис. 3.19.). Фотосенсибилизированная модификация с использованием бинарной системы фотореагентов выявляет в этом ансамбле белков в качестве основного продукта ковалентного присоединения ДНК-полимеразу р. Идентичность продукта ковалентного присоединения с молекулярной массой 46 кДа ДНК-полимеразе Р из семенников крупного рогатого скота была доказана с помощью иммунопреципитации специфическими антителами. Далее было проведено сравнение набора белков в клеточном экстракте фибробластов мыши с белками ядерного экстракта семенников крупного рогатого скота, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами BER, в присутствии и отсутствие Pyr-6-dUTP. Типичная картина модификации с использованием ДНК, содержащей синтетический апуриновый/апиримидиновый сайт в положении, комплементарном гуанину, представлена на рис. 3.20. 5 -[32Р]-меченый праймер удлиняли в присутствии FAB-dCTP, который может быть включен в ник-ДНК-структуру с помощью -активности ДНК-полимеразы (3. Дорожки / и 2 демонстрируют продукты модификации в ядерном экстракте, дорожки б и 7 в клеточном экстракте, полученные в отсутствие и в присутствии FAB-dCTP с последующим облучением УФ-светом с длиной волны 320 нм. Продукты модификации белков ядерного и клеточного экстрактов, полученные при облучении УФ-светом с длиной волны 365 нм, представлены на дор. 3, 4, 5 и 8, 9, 10, соответственно, причем дор. 3, 8 - без добавления Pyr-6-dUTP, дор. 4, 9 - в присутствии пиренмасляной кислоты, а дор. 5, 10-в присутствии Pyr-6-dUTP. Добавление Pyr-6-dUTP приводило к увеличению интенсивности модификации Pol р. Как было показано ранее [38], в клеточном экстракте были идентифицированы четыре белка с молекулярной массой, соответствующей хорошо известным белкам эксцизионной репарации оснований: поли-(АОР-рибозо)-полимераза (PARP-1), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), ДНК-полимераза Р и апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза (АРЕ). Минорное отличие в подвижности ДНК-полимеразы р ядерного экстракта от подвижности ДНК-полимеразы р, выделенной из клеточного экстракта, на 2-3 кДа (сравните дор. 5 и 10) наблюдается в результате того, что клеточный экстракт выделен из клеток, в которых была экспрессирована ДНК-полимераза р, содержащая специальный "флаг-эпитоп" (11 аминокислот), присоединенный к ее N-концевой последовательности [141].
