Содержание к диссертации
Введение
1. Олиго- и полинуклеотиды с модйшцированньзми мешоншерными ушами. получение и свойства 8
1.1. Методы получения аналогов нуклеиновых кислот с различными типами модифицированных межмономерных узлов 9
1.1.1. Фосфотриэфирные аналоги олиго- и полинуклео-тидов 10
1.1.2. Фосфонатные аналоги олигонуклеотидов 13
1.1.3. Фосфитные аналоги олигонуклеотидов 16
1.1.4. Серусодержащие аналоги олиго- и полинуклео-тидов 18
1.1.4.1.Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидов 19
1.1.4.2.Тионфосфатнне аналоги олиго- и полинуклеотидов 20
1.1.5. Фосфоамидные аналоги олиго- и полинуклеотидов 24
1.2. Комплементационные взаимодействия олиго- и полинуклеотидов с модифицированными межмономерными узлами 27
1.2.1. Неионные аналоги олигонуклеотидов 28
1.2.2. Поликатионные аналоги олигонуклеотидов 31
1.2.3. Полианионные аналоги олиго- и полинуклеотидов 31
1.3. Субстратные свойства нуклеиновых кислот с модифицированными межмономерными узлами . 33
1.3.1. Нуклеазы 34
1.3.1.1.Неспецифические нуклеазы и РНазы 34
1.3.1.2.Эядонуклеазн рестрикции 45
1.3.2. Ферменты, катализирующие синтез межнуклеотидных связей 48
1.3.2.1.ДНК-зависимая РНК-полимераза 48
1.3.2.2. ДЖ-зависимые ДЖ-полимеразы 49
1.3.2.3.Полинуклеотидфосфорилаза (ПШаза) 52
1.3.2.4.Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза 53
1.3.3. Т4г-Полинуклеотидкиназа 54
1.3.4. Т4г-ДНК-лигаза 56
1.4. Биохимические свойства нуклеиновых кислот с модифицированными межнуклеотидными узлами 57
1.4.1. Влияние аналогов на белок-синтезирующую систему и рост клеток 58
1.4.2. Интврфероногенная активность 60
2. Получение и свойства полинуклеотйдов с меж-олигомерными з^пирофосфатными связями 63
2.1. Получение и комплементационные свойства дифосфатов олигонуклеотидов 66
2.1.1. Получение 3^-дифосфатов олигонуклеотидов 67
2.1.2. Получение 3^ 5^-дифосфатов олигонуклеотидов 75
2.1.3. Комплементационные взаимодействия 3^- и 3^5-дифосфатов олигонуклеотидов 80
2.2. Получение и физико-химические свойства двутяжевых ДНК с повторяющимися 3^5-пирофосфатными межнуклеотидными узлами 88
2.2.1. Химическая матричная поликонденсация TGGCCAAGCTpp 91
2.2.2. Химическая матричная поликонденсация 3,5-ди-фосфатов нона- и декануклеотидов 99
2.2.3. Сравнение эффективности образования различных типов межнуклеотидных связей в реакциях матричной конденсации 110
2.2.4. Выяснение возможного механизма КДЙ-индуцируе-мой матричной конденсации 3і, 5^-дифосфатов оли-гонуклеотидов 113
2.2.5. Физико-химические свойства полинуклеотидов с 3^5-пирофосфатными межмономерными связями 117
2.3, Субстратные свойства полинуклеотидов с пирофосфатными межмономерными связями 122
2.3.1. Расщепление двутяжевых полинуклеотидов с пирофосфатными межмономерными связями эндо-нуклеазами рестрикции 123
2.3.2. Транскрипция полинуклеотидов с пирофосфатными межмономерными узлами 138
3. Экспериментальная часть 144
Выводы 164
- Комплементационные взаимодействия олиго- и полинуклеотидов с модифицированными межмономерными узлами
- ДЖ-зависимые ДЖ-полимеразы
- Получение и физико-химические свойства двутяжевых ДНК с повторяющимися 3^5-пирофосфатными межнуклеотидными узлами
- Физико-химические свойства полинуклеотидов с 3^5-пирофосфатными межмономерными связями
Введение к работе
Успехи химии природных соединений в развитии методов анализа первичных структур нуклеиновых кислот и белков, синтеза искусственных генов или их фрагментов, открытие большого числа новых ДНК-узнающих ферментов составили основу достижений молекулярной биологии последних лет и ее прикладной ветви - биотехнологии. Широкое применение в различных молекулярно-биоло-гических экспериментах нашли олиго- и полинуклеотиды с заданной последовательностью ыономерных звеньев. Современный уровень развития органической химии нуклеиновых кислот сделал доступными для исследователей не только синтетические фрагменты ДНК и РНК природного строения, но и различным образом модифицированные аналоги этих соединений. Получение и изучение свойств аналогов вносит существенный вклад в понимание биологических функций нуклеиновых кислот, их химических и физико-химических свойств.
В литературе описано множество способов модификации гетероциклических оснований и углеводных остатков компонентов ДНК и РНК /І/. В значительно меньшей степени разработаны методы получения олиго- и полинуклеотидов с неприродными мехшономерны-ми узлами, хотя такие соединения представляют большой интерес в качестве инструментов исследования репликации, транскрипции, трансляции и других клеточных процессов. Модификация фосфоди-эфирных связей обычно не приводит к существенным изменениям структуры и комплементаціїонных свойств олиго- и полинуклеотидов и поэтому является одним из наиболее перспективных путей к выяснению участия мешіуклеотидньїх фосфатных групп во взаимодействии с ферментами нуклеинового обмена. Однако, число известных к настоящему времени типов модификации меннономерных узлов нук- леиновых кислот невелико, а методы синтеза модифицированных оли-го- и полинуклеотидов достаточно трудоемки. В связи с этим весьма актуальным является поиск новых типов модификации мешлономер-ных узлов нуклеиновых кислот и разработка простых и эффективных методов синтеза аналогов ДНК и РНК.
В настоящей работе осуществлен синтез нового типа соединений - двутякевых ДНК, содержащих мекнуклеотидные 3-5-пирофосфат-ные связи в заданном положении полинуклеотидной цепи. Для получения протяженных модифицированных двутяжевых полинуклеотидов нами впервые использован метод химической матричной поликонденсации олигонуклеотидов. Изучение физико-химических свойств синтезированных соединений показало, что далее часто встречающиеся меннуклеотидные пирофосфатные связи практически не сникают термической устойчивости двутязкевых полинуклеотидных комплексов. Это дало возможность использовать такие соединения в качестве аналогов субстратов некоторых эндонуклеаз рестрикции, а такке РНК-полпмеразы . COlI . . Тем самым была продемонстрирована перспективность пирофосфатной модификации ДНК для изучения ДНК-связывающих ферментов. Кроме того, установлено, что в ряде случаев с помощью замены расщепляемого фосфодиэфирного узла на пи-рофосфатный можно конструировать негидролизуемые аналоги субстратов эндонуклеаз рестрикции.
Обзор литературы посвящен рассмотрению способов получения, комплементационных и субстратных свойств олиго- и полинуклеотидов с модифицированными мешлономерными фосфатными группами.
Комплементационные взаимодействия олиго- и полинуклеотидов с модифицированными межмономерными узлами
Способность к образованию комплементарных комплексов является фундаментальным свойством нуклеиновых кислот, которое обеспечивает их основную функцию - хранение и передачу генетической информации. Интерес исследователей к модифицированным по фосфатным группам олиго- и полинуклеотидам связан прежде всего с тем, что подобная модификация не затрагивает гетероциклических оснований.- Следовательно, такие соединения должны сохранять способность к комплексообразованию по принципу комплементарностй. Это позволяет использовать олиго- и полинуклеотиды с модифицированными межмономерными узлами в качестве аналогов нуклеиновых кислот. Практически все типы аналогов нашли применение в тех или иных научных исследованиях. При этом, однако, характерные особенности комплементационных взаимодействий различных типов аналогов изучены далеко не в одинаковой степени. Наиболее подробно описано образование и свойства комплементарных комплексов неионных фосфотриэфирных и алкилфосфонатных аналогов. Имеются данные о комплексообразовании поликатионных фосфотриэфирных, тио- и тионфосфатных производных. Особенности образования комплементарных комплексов другими типами модифицированных олиго- и полинуклеотидов, по-видимому, еще не изучались. I.2.I. Неионные аналоги олигонуклеотидов Особенности комплементационных взаимодействий неионных аналогов нуклеиновых кислот связаны с несколькими факторами. Наиболее существенным из них является отсутствие отрицательного заряда фосфатной группы. Электронейтральность молекулы олигонуклеотида должна приводить к уменьшению электростатического отталкивания, а следовательно к увеличению прочности комплементарного комплекса. Действительно, увеличение прочности комплексов с полидезоксирибонуклеотидами (по сравнению с комплексами аналогичных природных олигомеров) обнаружено как в случае триэфирных /34,110/, так и алкилфосфонатных олигонуклеотидов /29,33,34/» Энтальпия комплексообразования неионных аналогов на 1,4-1,6 ккал/моль пар оснований более отрицательна, чем энтальпия образования таких же комплексов природными олигонуклеотидами /4,29/.
Этим данным противоречит уменьшение прочности комплексов триэфирных производных нонатимидилата и тригуанилата с poty(dA) и potyc соответственно, описанное в работе /НО/, Комплементарные комплексы алкилфосфонатных олигонуклео-тидов с РНК также прочнее аналогичных комплексов природных прототипов /29,33,34/, данные о сравнительной устойчивости комплексов природных и триэфирных аналогов олигонуклеотидов с РНК несколько противоречивы, В одних работах отмечается большая /3,16/, а в других существенно меньшая термическая устойчивость комплементарных комплексов фосфотриэфирных аналогов /4,110/. Причиной меньшей прочности комплексов с РНК могут быть стерические препятствия, создаваемые триэфирной группировкой. Об этом свидетельствует различие температур плавления комплексов poEy (U) с d[Ap(0Me)A] и d[Ap(0Et)A] (13,2 и 12,0С соответственно) Характерной особенностью неионных аналогов является одинаковая прочность их комплексов с полинуклеотидами в растворах с низкой и высокой ионной силой /16,21,29/, Так, например, константы связывания триэфирных аналогов три- и тетра- Phe нуклеотидов с тРНК из дрожжей не меняются при десятикратном снижении ионной силы раствора. В то же время константы связывания аналогичных рибо- и дезоксирибоолигонуклео-тидов с диэфирными межнуклеотидными связями уменьшаются в 4-6 и более раз (см.табл.1). Способность неионных аналогов образовывать одинаково прочные комплексы с полинуклеотидами при низких ті высоких значениях ионной силы делает такие соединения весьма перспективными для исследования структуры и функций нуклеиновых кислот in VIVO . Значительное влияние на комплементационные свойства неионных аналогов оказывает диастереомерия. Комплекс pOuL) (dA) с синтетическим препаратом d Tp(0Et)?T , представляющим со-бой смесь диастереомеров (возможное их количество 2 ), может быть разделен на фракции, отличающиеся по термической устойчивости на Э0С /4/. Такая гетерогенность связана с множеством диастереомеров d Tp(0Et)r,T . Существенно отличается прочность комплексов R_ и Sp диастереомеров алкилфосфонатных аналогов олигонуклеотидов с ДНК и особенно с РНК /29,34,35/. Вероятной причиной различной термической устойчивости комплексов диастереомеров является различная ориентация алкильной группы. В изомере Sp алкильная группа находится в аксиальном положении и сближена с гидрофобной областью стэкинга гетероциклических ос- нований. Такая сближенность стабилизирует стэкинг и весь комплекс в целом. Экваториальная алкильная группа Rp изомера ориентирована "в сторону растворителя", что приводит к энергетически невыгодному взаимодействию ее с гидрофильными молекулами растворителя. Стэкинг-взаимодействия при этом в какой-то степени дестабилизируются, что в свою очередь сказывается на прочности комплекса /29,111/. Г. 2.2. Поликатионные аналоги олигонуклеотидов Некоторые закономерности образования комплементарных комплексов положительно заряженными аналогами олигонуклеотидов выяснены на примере аминогексилового триэфирного аналога гек-сатимидилата d {[Тр(0Х)]5Т} [где X -(CH2)6NH2] /21/. Взаимодействие такого аналога с полинуклеотидами осуществляется по принципу комплементарности. Об этом свидетельствует тот факт, что аналог образует комплекс состава 2Т:1А с роЕу (оА) и не взаимодействует с pOLLj (dT). Тем самым не наблюдается принципиально возможная неспецифическая агрегация разноименно заряженных молекул олиго- и лолинуклеотида.
В растворах с высокой ионной силой комплексы поликатион-ных аналогов олигонуклеотидов с полинуклеотидами сравнимы по термической устойчивости с комплексами соответствующих олигонуклеотидов природного строения. Отличительнойособенностью положительно заряженных аналогов олигонуклеотидов является увеличение прочности их комплексов с полинуклеотидами с уменьшением ионной силы раствора /21/. 1.2.3. Полианионные аналоги олиго- и полинуклеотидов Модификации межнуклеотидного фосфатного остатка,не приводящие к изменению заряда молекулы олиго- и полинуклеотида, существенно меньше сказываются на комплементационных взаимодействиях таких соединений. Введение тионфосфатных группировок в полирибонуклеотидную цепь никак не влияет на образование и термическую устойчивость двойной спирали. При различных концентрациях соли температуры плавления poty (pApU) и практически полностью совпадают /71/. Тем более не отличаются температуры плавления poty (pApU) и частично модифицированного pDPy[pAp(S)U] /69/. Спектры УФ-по-глощения и гипохромия всех трех полимеров также одинаковы. Данные об устойчивости комплексов тиофосфатных аналогов весьма ограничены. Комплексообразование тиоолиготимидилатов с pOuL) (А) наблюдали Нагивари и сотр. /53,54/« Взаимодействие сопровождалось нормальным гипохрошшм эффектом. Комплексы тио-олигонуклеотидов с полинуклеотидами менее устойчивы, чем комплексы природных олигонуклеотидов. Так, температура плавления комплекса pOUJ (dA)»(clT)9 найдена равной 46С, а pOLLJ (dA) (dTps)gclT - только 22C в одинаковых условиях при нуклеотидной концентрации 10 М /112/. Уменьшение прочности комплементарного комплекса модифицированного олигонуклеотида может быть вызвано удлинением межнуклеотидного узла в тиоана-логах за счет большего размера связей, образованных атомом серы. Какие-либо данные о других комплементационных взаимодействиях тиоаналогов олигонуклеотидов в литературе отсутствуют. Однако известно, что такие соединения могут служить матрицей для ДНК-полимеразы I, нормально сшиваться в двутяжевом комплексе ДЕК-лигазой, а также инициировать считывание глоби-новой мРНК кролика РНК-зависимой ДЕК-полимеразой (см. раздел 1.3). Это свидетельствует в пользу того, что прочность комплексов тиоолигонуклеотидов вполне достаточна для их использования в качестве заменителей природных олигодезоксирибонуклеотидов в молекулярно-биологических исследованиях. В литературе нет данных о специальных исследованиях ком-плементационных взаимодействий фосфоамидных аналогов нуклеиновых кислот.
ДЖ-зависимые ДЖ-полимеразы
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы из различных источников катализируют синтез межнуклеотидных связей в ДНК в направлении 5- -з в присутствии dNTP, ДНК-матрицы и затравки со свободннм З гидроксилом. ДНК-полимеразы содержат 3- -5 экзонук-леазную ("редактирующую") активность, с помощью которой в цепи затравки отщепляется иекомплементарное ошибочно включенное нуклеотидноё звено. Кроме того, в ДНК-полимеразе I из 8. COLL обнаружена 5— -3 экзонуклеазная активность, способная расщеплять двутяжевые ДВК с эчконца с образованием моно- и олигонук-леотидов /121У. Миллером и сотр. /5/ исследована репариругощая репликация Rp и S диастереомеров декадезоксирибонуклеотида d tCpCpApApGp(OEt)ApTpTpQpCi] с одной фосфотриэфирной группировкой в центральном динуклеотиде. Обнаружено, что межмо-номерный триэфирный узел в матричной цепи не является препятствием для ДНК-полимеразы I из .С0с1 , однако репликация модифицированных декануклеотидов (особенно одного из диастереомеров) протекала замедленно по сравнению с репликацией немо-дифицированного d(CCAAGATTGG). Исследована также репарирующая репликация тиофоефат-ного аналога гексадекадезоксирибонуклеотида d[CpsCpsApsTps(Cps)2(Tps)3(Qps)2APs(TP$)#] в присутствии затравки 5- P-d(pCAAATQGAAA) и ДНК-полимеразами I из Є.соїі или ДНК-полимеразы фага Т4 /125/. Б присутствии тиоаналога матрицы и ДЖ-полимеразы I из Є. СОсі за 2 часа затравка удлинялась на два нуклеотидных звена. В контрольном эксперименте репликация природного гексадекадезоксирибонуклеотида практически завершалась за I час. Таким образом, было показано,что тиофосфатные аналоги олигонуклеотидов могут служить матрицаїли для ДНК-полимеразы I, хотя и значительно менее эффективными.
В то же время ДНК-полимераза фага Т4 не катализировала присоединение нуклеотидов к 3-концу затравки. По-видимому, этот фермент обладает более строгой специфичностью к структуре матрицы, чем ДНК-полимераза I. Требования к структуре затравки для Т4-ДНК-полимеразн не столь высоки, поскольку обнаружено, что d (Тр5)12Т] является эффективной затравкой при репликации роРу (clA) /112/. В ходе репликации тридека-ітиотимидилат оказывался ковалентно связанным с pOiLj (dT)-цепью. Начальная скорость репликации в присутствии d [(TpS)- ] в 2 раза ниже, чем в присутствии c(T)j3 Авторы объясняют этот факт меньшей прочностью комплекса potlj (dA) d [(Тр5)І2т] по сравнению с pOcLj (dA) d(T)I3 (см.раздел 1.2,3). Тиоанало-ги!г. олигодезоксирибонуклеотидов гораздо более устойчивы к действию З1 - ! -экзонуклеазннх активностей ДНК-полимеразы I из . COLL И ДНК-полимеразы фага Т4, чем природные олигонук-леотидн. Начальная скорость гидролиза d [(Tps) ] ДНК-поли-меразой I в 10 раз, а ДНК-полимеразой фага Т4 в 5 10 раза ниже скорости гидролиза d (Т)із /II2/. Матричные свойства тиоаналогов ДНК по отношению к ДНК-полимеразе специально не изучались Описана, однако, нормальная репликация ДНК с одной тионфосфатной связью /126/. Кроме того, найдено, что укороченная форма плазмиды pBR 322, содержащая один тионфосфатный узел, нормально трансформирует клетки . COLL и реплицируется Lft VIVO/82/. Специально не изучалась и способность тионфосфатных аналогов олигонук-леотидов служить затравками для ДНК-полимеразы. Тем не менее, возможность получения с помощью этого фермента и d ЫТРоС S частично модифицированных полинуклеотидов /74,77/ говорит о том, что такие соединения являются компетентными затравками для ДНК-полимеразы. Устойчивость тионфосфатных межмономерных узлов к действию 3 - -5-экзонуклеазной активности, ассоцииро- ванной с ДНК-полимеразами из различных источников, установлена в работах /75,77/ и подтверждена рядом исследований /76,78/. Включившись в состав ДНК, тионфосфатные мономерные звенья не могут быть "вырезаны" под действием редактирующей активности ДНК-полимераз. Это свойство было использовано для выяснения вклада з - »5 экзонуклеазной активности в обеспечение надежности копирования ДНК, Обнаружено, что введение ти-онфосфатных связей в 20 раз повышает число ошибок при считывании ДНК-полимеразой I из матричной цепи ДНК /77/. Благодаря совокупности таких свойств, как: I) возможность ферментативного введения с помощью о NTPO(S ; 2) устойчивость к редактирующей активности ДНК-полимераз; 3) способность к нормальной репликации - межмономерный тионфосфатный узел может быть использован для создания точечных мутаций с целью направленного мутагенеза /125/. Частично модифицированные полидезоксирибонуклеотиды с P-NH-C фосфоамидными узлами могут служить затравками для ДНК-полимеразн I, что показано в работах ДГетсингера и сотр. /107-109/. 1.3.2.3. Полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза) ПНФаза катализирует обратимую полимеризацию рибонуклео-зиддифосфатов с образованием полинуклеотидов и неорганического пирофосфата. Фермент катализирует также обмен неорганического фосфата с -фосфатным остатком A"DP /114/.
В литературе имеются данные о двух аспектах взаимодействия тионфосфатннх аналогов олиго- и полирибонуклеотидов с ПНФазой. Возможность получения с помощью этого фермента и NDPo $ полностью модифицированных аналогов РНК свидетельствует о том, что тионфосфатные слито- и полирибонуклеотиды являются компетентными затравками для ПНФазы /68,72/. Б работе /127/ исследован катализируемнй ПНФазой обмен -меченного неорганического фосфата с -фосфатным остатком ADPo S в присутствии АрА, а также fL и 5 диастереомеров Ap(S)A, поскольку известно, что динуклеозидмонофосфаты активируют эту обменную реакцию. Обнаружено, что изомер PL активирует обменную реакцию с той же эффективностью, что и АрА, а изомер Sp с эффективностью, почти в 2 раза меньшей. 1.3.2.4. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (терминальная трансфераза) Терминальная трансфераза катализирует присоединение де-зоксинуклеотидов к 3-гидроксилу однотяжевых и двутяжевых ДНК, используя в качестве субстратов cl NTP /115/. Исследована способность этого фермента использовать в качестве затравок для наращивания нуклеотидной цепи фосфотри-эфирных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов. Варант и сотр. /128/ сравнивали скорости присоединения дезоксинуклеотидно-го звена к Зінонцу .риэфирнн аналогов гекоатшидшштов, со-держащих одну, две, три и пять межмономерных хлорфенильных групп (см. формулы на стр.55). Обнаружено, что скорости реакций убывают с увеличением степени модификации, а полностью модифицированный гексатимидилат терминальной трансферазой не наращивается вообще. Декануклеотид с одной фосфотриэфирной межмономерной связью, отстоящей от 3-конца на 5 мономерных звеньев d [GpQpiipApQp(OEt)ApTpTpGpG] , наращивался терминальной трансферазой так же, как природный декануклеотид /5/. Таким образом, можно заключить, что все исследованные тшш неприродних межмономерных узлов в составе олиго- и полинуклеотидов называют замедление скорости транскрипции и репликации при использовании таких модифицированных соединений в качестве матриц. Замедление может быть вызвано I) изменением конформации матрицы в месте модификации; 2) стерическими затруднениями, препятствующими связыванию и транслокапии фермента; 3) локальным отсутствием отрицательного заряда (в случае фосфотриэфирных межмономерных групп), препятствующим правильному связыванию матрицы с ферментом. Модификация межмономерных фосфатных групп приводит также к замедлению начальной скорости наращивания аналогов олиго-и полинуклеотидов всеми рассмотренными ферментами. Однако чувствительность ферментов к структуре затравки не столь велика, как к структуре матрицы. Наибольшее влияние оказывает модификация фосфатных групп, прилежащих к 3-концу затравки. 1.3.3,- Т4-Полинуклеотидкиназа Полинуклеотидкиназа из клеток . С Осі , инфицированных фагом Т4, катализирует перенос У-фосфата АТР на 5-гидроксил ДНК или РНК ДІ5/. Изучение взаимодействия этого фермента с аналогами нуклеиновых кислот представляет особый интерес, поскольку ферментативное фосфорилирование может быть использовано для -мечения модифицированных олиго- и полинуклеотидов.
Получение и физико-химические свойства двутяжевых ДНК с повторяющимися 3^5-пирофосфатными межнуклеотидными узлами
Обнаруженное сходство термической устойчивости комплексов 3-монофосфорилированных нона- и декануклеотидов и их 3 и з5-дифосфатных производных позволило нам для получения модифицированных дуплексов воспользоваться методом химической матричной конденсации олигонуклеотидов. Этот метод, предложенный Нейлором и Гилхемом /135/, получил дальнейшее развитие в работах других исследователей как химический путь сборки (так называемое химическое лигирование) двутяжевых полидезокси-рибонуклеотидов /137-139,141,164/. Основным преимуществом химического лигирования по сравнению с ферментативным, на наш взгляд, является возможность получения модифицированных поли-нуклеотидов, в том числе с неприродными межнуклеотидными узлами. Такие полинуклеотиды могут быть получены химической матричной конденсацией олигонуклеотидов, уже содержащих в своем составе неприродные межмономерные узлы. Однако синтез подобных модифицированных олигонуклеотидов является самостоятельной, достаточно сложной задачей (см. обзор литературы, раздел I.I). Более простым и перспективным нам кажется создание неприродного межмономерного узла непосредственно при химической сборке двутяжевого полинуклеотида. Так, З пирофосфатная связь может быть получена ковалентним сшиванием концевой ди-фосфатной группы одного олигомера с пространственно сближенным в комплементарном комплексе концевым гидроксилом другого, а также сшиванием 3- и 5-концевых фосфомоноэфирных остатков двух соседних олигомерных блоков. Протекание реакции конденсации в условиях комплексообразования обеспечивает 3- 5 ориентацию образующейся межолигомерной связи. Такой подход позволяет использовать для создания двутяжевых ДЕК с юприродными пиро-фосфатными связями обычные (природные или синтетические) оли-гонуклеотиды с 3- и біконцевнми фосфатными группами и их ди- фосфатные производные. Последние могут быть получены постсинтетической модификацией уже готовых олигонуклеотидов.
Тем самым отпадает необходимость трудоемкого введения неприродных межмономерных связей на стадии олигонуклеотидного синтеза С целью выяснения наиболее эффективного синтеза модифицированных двутяжевых полинуклеотидов нами исследованы оба возможных варианта получения межмономерной 3-5-пирофосфатной группировки Для конденсации дифосфатов олигонуклеотидов в условиях комплексообразования использованы два метода активации концевых фосфатных групп - карбодиимидный, с использованием водорастворимого 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодаимида (КДИ) и имидазолидный, заключающийся в конденсации фосфоимидазолид-ных производных в присутствии 1-метилимидазола Оба эти метода ранее применялись для матричной поликонденсапии 3-монофос-форилированных TGGCCAAGCTp, CCTGGAATTp и CCAGGAGCTp в составе комплексов (УШ) и (ХЕ), что приводило к образованию протяженных двутяжевых полинуклеотидов природного строения /139,141, І64Д Поскольку Тдд ДНК-подобных комплексов (30, (71) и (УП) лишь незначительно отличаются от Тдд. комплексов (Ж) и (IX), при получении модифицированных двутяжевых полинуклеотидов мы использовали условия матричной поликонденсации, найденные оптимальными для химического сшивания TGGCCAAGCTp /138,139,164/, а также CCTGGAATTp и CCAGGAGCTp /141/. Таким образом, индуцируемую КДЙ матричную поликонденсацию 3- и З дифосфатов нона-и декануклеотидов проводили при 0С в буфере П (см.раздел 3 1), содержащем 2 10 М ЕДИ /139/. Поликонденсацию 3-фосфоимидазо-лидов 3- или З бідифосфатов декануклеотида осуществляли при 0С в буфере Ш (см. раздел 3.1) /164/. Во всех экспериментах концентрация дифосфатов олигонуклеотидов и их имидазолидных производных составляла 10 в расчете на мономерное звено. 2.2.1. Химическая матричная поликонденсация TGGCCAAGCTpp Возможность использования для конструирования двутяжевых ДНК с межнуклеотидными 3-5-шгрофосфатными связями З дифосфат-ных производных олигонуклеотидов исследована нами на примере матричной поликонденсации TGGCCAAGCTpp. За ходом химического сшивания следили методом ионообменной МКХ, путем отбора алик-вот реакционных смесей через каждые сутки. На рис.10 приведены хроматографические анализы реакционных смесей через 4 и 14 суток после начала реакции в случае КШ-индуцируемой лоли-конденсации.
Суммарный выход полшлерных продуктов через 14 суток достигал 50%, а их максимальная длина 40 50 нуклеотидных звеньев. Более длительное инкубирование реакционной смеси оказалось нецелесообразным, так как параллельно с поликонденсацией происходило частичное расщепление пирофосфатной связи в TGGCCAAGCTpp и накопление в реакционной смеси TGQCCAAGCTp, также способного полимеризоваться /139/. Расщепление пирофосфатной связи происходило, по-видимому, в результате того, что индуцируемая КДИ активация частично передается и на с -атом фосфора концевой пирофосфатной группировки, который затем подвергается нуклеофильной атаке молекулами воды. Не исключено, что такая передача активации может приводить к частичному образованию при матричной поликонденсации 3-дифосфата дека-нуклеотида не пирофосфатных, а природных фосфодиэфирных связей в результате атаки пространственно сближенным в комплексе 5-гидроксилом оС -атома фосфора. Активированный КДй В -фосфатный остаток Судет являться в этом случае уходящей группой. Сравнивая скорости накопления продуктов поликонденсации TGGCCMGCTpp и TGGCCMGCTp под действием КДЙ, можно отметить существенно меньшую эффективность поликонденсации TGGCCMGCTpp (рис,II). Это связано, вероятно, с менее благоприятным пространственным расположением в комплексе реагирующих концевых групп декануклеотидов, а также возможной локальной дестабилизацией комплекса за счет концевых лирофосфатных групп. Для выяснения природы образующейся в результате поликонденсации межолигомерной связи суммарную полимерную фракцию, выделенную из реакционной смеси (рис.12), гидролизовали ферментами. При обработке смесью ЗМЭ и ФДЭ змеиного яда происходило полное расщепление продуктов поликонденсации до смеси нуклеозидов. Полный гидролиз препарата свидетельствует о том, что продукты поликонденсации не являются симметричными диза-мещенными полифосфатами типа:
Физико-химические свойства полинуклеотидов с 3^5-пирофосфатными межмономерными связями
Дяя оценки среднестатистической длины продуктов поликон-денсации pTGGCCMQCTp нами применен метод седиментационного анализа. При этом использовали нефракционированнуто полимерную смесь, куда входили все продукты поликонденсации 35 дифосфа-та декануклеотида. Коэффициенты седиментации определяли в условиях комплексов образования (в 0,075 М натрий-цитратном буфере, рН 7,2,- содержащем 0,75 М NaC) и в условиях полной дестабилизации комплексов (в растворе, содержавшем 0,1 М NlaOH и 0,9 М NaC). Коэффициенты седиментации двутяжевых модифицированных полинуклеотидов найдены равными 5,2+0,2 S, а одно-тяжевых 4,6+0,2S. Такие значения характерны для фрагментов ДНК с 200-220 мономерными звеньями /168,169/. На основании данных электрофореза в ПААГ можно заключить, что полинуклеотиды приблизительно такого же размера (среднестатистическая длина цепи около 200 мономерных звеньев) образуются при матричной поликонденсации pCCTGC AATTp и pCCAGQAQCTp (см. рис.15 и 17). Межнуклеотидная пирофосфатная группировка увеличивает расстояние между прилежащими к ней мономерными звеньями поли-нуклеотидной цепи и несет на один отрицательный заряд больше, чет фосфодиэфирная. Эти отличия должны приводить к некоторым изменениям структуры как однотяжевых, так и двутяжевых полинуклеотидов с пирофоофатншли связями по сравнению с аналогичными полимерами природного строения. Однако поскольку межнуклеотидная пирофосфатная связь образуется в составе комплементарного двутяжевого комплекса, можно предполагать, что структурные изменения невелики. Влияние повторяющихся межнуклеотидных пирофосфатыых связей на термическую устойчивость дуплексов исследовали на примере продуктов поликонденсации pTQQCCAAQCTp и TGGCCAACJCTp. В том и другом случае использовали нефракционировэнные смеси продуктов поликонденсации. Использованные модифицированные полимеры имели среднюю длину несколько большую, чем немодифицированные.
Однако известно, что для таких протяженных полинуклеотидов длина практически не сказывается на термической устойчивости комплементарных комплексов /170/. Кривые плавления исследованных двутя-жевых ДНК-подобных комплексов приведены на рис.22. Анализ данных о плавлении свидетельствует, что межолигомерные пирофос-фатные связи дестабилизируют комплементарный комплекс, но дестабилизирующий эффект невелик. Температуры плавления модифицированного и природного комплементарных комплексов отлича-ютоя:. лишь на 5 С (75и и 80 С соответственно). Плавление комплементарных комплексов, образуемых модифіщированннми полинук-леотидами, характеризуется большей кооперативностью. Причина этого заключается,по-видимому, в том, что межнуклеотидные пи-рофосфатные узлы могут являться инициаторами и первичныгли центрами плавления комплементарного комплекса. В пользу того,что введение дополнительных фосфатных групп не вносит существенных изменений в структуру двойной спирали ДНК, свидетельствует и сходство спектров КД модифицированных и аналогичных природных комплементарных комплексов (рис.23). Обращает на себя внимание аномальная электрофоретичес-кая подвижность олиго- и полинуклеотидов с дополнительными концевыми и межнуклеотидшми фосфатными группами в денатурирующем 20% ПАКТ, Так, подвижности декануклеотидов с одной и двумя концевыми фосфатными группами отличаются очень незначительно, несмотря на разницу в зарядах (рис.15). Продукты поликон- денсации 5 - -pTGGCCAAGCTp длиной 20, 90 и 40 мономерных звеньев, содержащие межнуклеотидные пирофосфатные связи, движутся несколько медленнее соответствующих немодифищрованных по-линкулеотидов (рис.15). Подвижности 50-звенных полинуклеоти-дов одинаковы, а начиная с 60-звенных подвижность модифицированных продуктов оказывается выше, чем подвижность аналогичных полинуклеотидов природного строения (рис.15). Аналогичная закономерность изменения подвижности обнаружена и в случае продуктов поликонденсации s - -pCCTGGMTTp и S- P-pCCAGGAQCTp (рис.17). Таким образом, не наблюдается прямой зависимости между зарядом молекулы модифицированных полинуклеотидов и их подвижностью в ПААГ. Причина этого, по-видимому, в том, что продукты поликонденсации 3,5- дифосфатов олигонуклеотидов обладают большей гибкостью, чем аналогичные полинуклеотиды природного строения за счет дополнительных конформационных возможностей межмономерных пирофосфатных узлов. Это приводит к тому, что модифицированные полинуклеотиды длиной 20 40 звеньев проникают в поры ПААГ, недоступные для аналогичных немодифи-цированных полинуклеотидов, и мигрируют с меньшей скоростью, несмотря на наличие дополнительных отрицательных зарядов. Для продуктов поликонденсации с длиной полинуклеотидной цепи 50 и более мономерных звеньев разница в конформационной подвижности молекул становится несущественной,и роль основного фактора, определяющего электрофоретическую подвижность, начинает играть заряд молекул. Таким образом, в настоящем разделе работы нами описан эффективный способ синтеза межолигомерных 3 5-пирофосфатных группировок путем конденсации 3- и 5-фосфомоноэфирных остатков, пространственно сближенных в комплементарном ДНК-подоб- ном комплексе. Поскольку пирофосфатная межнуклеотидная связь образуется непосредственно при химической сборке полинуклео-тидного дуплекса, положение возможных мест ее введения определяется положением "стыков" олигомерных блоков.
Этот факт необходимо учитывать и для направленного введения пирофосфатных связей соответственным образом разбивать полинуклеотид на олигомерные блоки при планировании синтеза олигонуклео-тидов для сборки ДНК-дуплекса» Предлагаемый метод может быть использован также для введения пирофосфатных связей в заданное положение природных дву-тяжевых ДНК. Известно, что при гидролизе ДНК большинством эн-донуклеаз рестрикции в местах расщепления возникают 5-концевые фосфатные остатки /121/. Введением в места разрыва дополнительных 3-концевых фосфатных групп (каким-либо из существующих химико-ферментативных способов /142,143/) и последующим химическим сшиванием липких концов дуплекса может быть получена двутяжевая ДНК с одной единственной в каждом тяже неприродной пирофосфатной связью. Проведенное исследование физико-химических свойств ДНК-дуплексов с регулярно повторяющимися 3-5-пирофосфатными меж-мономерными связями показало, что структура таких соединений близка к структуре аналогичных немодифицированных дуплексов. Это открывает широкие возможности использования двутяжевых полинутслеотидов с межмономерными пирофосфатными узлами в качестве аналогов субстратов ферментов нуклеинового обмена. 2.3. Субстратные .„свойства полинуклеотидов с 3-5-пирофосфатными меямономерннми связями Субстратные свойства модифицированных нуклеиновых кислот в значительной мере определяют области их возможного при Изменения в молекулярно-биологических исследованиях. Поскольку двутяжевые ДНК-подобные полимеры с 3-о-пирофосфатными связями синтезированы нами впервые, большой интерес представляло изучение их субстратных свойств, то есть взаимодействия таких соединений с ферментами нуклеинового обмена. В связи с этим нами исследовано расщепление двутяжевых полинуклеотидов с регулярно повторяющимися пирофосфатными межмономерными узлами эндонуклеазами рестрикции, участки узнавания которых "заложены" в первичной структуре полинуклеотидов, а также "считывание" таких модифицированных двутяжевых ДНК ДЕК-зависимой РНК-полимеразой.
