Введение к работе
Актуальность проблемы. Системы рестрикции-модификации (Р-М) широко распространены в бактериальных клетках и содержат гены, кодирующие ферменты рестрикции (эндонуклеаза, ЭР) и модификации (метилтрансфераза, МТаза). Системы Р-М могут выступать в роли дискретных форм жизни аналогично вирусам и транспозонам (Kobayashi et al, 2001). Эндонуклеаза рестрикции гидролизует вторгающуюся ДНК, не модифицированную должным образом, то есть система Р-М выполняет функцию примитивной иммунной системы, защищающей бактерию-хозяина от проникновения чужеродной ДНК. Также в некоторых случаях было показано, что системы Р-М могут вести себя как эгоистичные мобильные элементы и вызывать перестройку генома. После закрепления системы Р-М в геномной ДНК она становится жизненно важной для бактерии. При потере клеткой системы Р-М долгоживущая (по сравнению с метилтрансферазой) эндонуклеаза рестрикции неминуемо приведет к гибели клетки (Rocha et al, 2001). Нарушение функции специфического метилирования ДНК клетки-хозяина также может приводить к её гибели за счет расщепления собственной ДНК. В то же время, соотношение внутриклеточной активности МТазы и ЭР должно быть таким, чтобы ЭР могла гидролизовать чужеродную ДНК до того, как она будет специфически модифицирована МТазой. Таким образом, регуляция экспрессии генов ЭР и МТазы играет чрезвычайно важную роль при функционировании систем Р-М в клетках бактерий, что определяет актуальность всестороннего изучения этого процесса.
Исследования регуляции активности генов в системах Р-М, проведенные в последнее время, показали, что не существует универсального механизма этого процесса. Однако регуляция на уровне транскрипции, по-видимому, является определяющим механизмом координированной экспрессии генов систем Р-М. Выделяют 3 основных типа подобной регуляции систем Р-М: посредством С-белков (от английского слова «control»), посредством метилирования промоторной области системы Р-М МТазой, а также посредством взаимодействия МТаз с регуляторными последовательностями ДНК, отличными от участка метилирования. Последний тип регуляции характерен для С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз.
Объектом нашего исследования является система Р-М П-го типа SsoII, обнаруженная в штамме Shigella sonnei Al. Эта система является уникальной среди других систем Р-М, для которых описана регуляция экспрессии генов посредством С5-цитозиновых ДНК-МТаз (M.Msp, M.EcoRII, M.ScrFI, M.LlaJI). Показано, что помимо авторегуляторной функции - ингибирования собственного синтеза - МТаза SsoII (M.SsoII) активирует транскрипцию гена ЭР SsoII (R.SsoII) (Karyagina et al, 1997). Регуляция в этой системе осуществляется благодаря специфическому взаимодействию N-концевой области M.SsoII (1-71 а.о.) с промоторной областью генов системы Р-М SsoII (Shilov et al, 1998). Основное число контактов с M.SsoII обеспечивает локализованный внутри промоторной области 15-звенный инвертированный повтор (регуляторный участок) {Воробьева и др., 2000). Несмотря на активное изучение
взаимодействия M.SsoII с регуляторным участком, непосредственно механизм регуляции экспрессии генов в системе Р-М M.SsoII оставался еще невыясненным. Вместе с тем, всестороннее исследование этого процесса, возможно, позволит выявить закономерности регуляции экспрессии генов в прокариотических клетках и глубже понять его основные аспекты.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в установлении особенностей механизма регуляции в системе рестрикции-модификации SsoII.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Изучить in vitro транскрипцию генов системы Р-М SsoII в присутствии и в
отсутствие метилтрансферазы SsoII и SsoII-подобной МТазы Ecll8kl.
2. Оценить эффективность комплексообразования МТазы и РНК-полимеразы Е. coli
с фрагментами ДНК, содержащими регуляторные элементы генов системы Р-М SsoII.
Выяснить способность полипептида, представляющего собой N-концевую область M.SsoII (1-71 а.о.), выступать в роли фактора транскрипции, то есть связываться с промоторной областью генов системы Р-М SsoII и регулировать их экспрессию.
Исследовать роль отдельных аминокислотных остатков N-концевой области M.SsoII во взаимодействии с регуляторным участком и их влияние на транскрипционную активность фермента.
Установить, существует ли взаимосвязь между регуляторной и метилирующей функциями M.SsoII.
Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что M.Ecll8kI аналогично M.SsoII регулирует экспрессию генов in vitro в системе Р-М SsoII. Уровень синтеза транскрипта с промотора гена ЭР в отсутствие МТазы незначителен, однако он возрастает при добавлении в реакционную смесь МТазы (M.SsoII или M.Ecll8kI). Синтез транскрипта с промотора гена МТазы в присутствии 4-кратного относительно РНК-полимеразы избытка M.SsoII или M.Ecll8kI полностью подавляется. Установлено, что ингибирование транскрипции гена M.SsoII осуществляется за счет связывания МТазы с регуляторным участком вблизи собственного промотора. Эффективность данного взаимодействия выше, чем эффективность связывания РНК-полимеразы с промотором гена МТазы. Показано, что метилтрансфераза не мешает образованию открытого комплекса РНК-полимеразы Е. coli с промотором гена ЭР. Активация транскрипции гена ЭР происходит за счет снятия эффекта транскрипционной интерференции посредством блокирования МТазой собственного промотора.
Показано, что делеционная форма SsoII-подобной метилтрансферазы Ecll8kl -A(72-379)Ecll8kI не взаимодействует с регуляторным участком в составе 31-звенного ДНК-дуплекса и фрагментов ДНК, содержащих межгенную область системы Р-М. Такой белок не способен регулировать экспрессию генов в системе рестрикции-модификации SsoII. Следовательно, наличие области, ответственной за метилирование, необходимо для связывания M.SsoII с регуляторным участком и выполнения функции фактора транскрипции.
Установлено, что мутантные формы S soil-подобной МТазы Ес118к1: M.Ecll8kI(R35A) и M.Ecll8kI(R38A) практически не взаимодействуют с регуляторным участком как в составе 31-звенного дуплекса, так и в составе ДНК, содержащей межгенную область системы Р-М SsoII. По-видимому, остатки Arg35 и Arg38 играют ключевую роль в связывании регуляторного участка. В экспериментах по транскрипции in vitro продемонстрировано, что M.Ecll8kI(R35A) и M.Ecll8kI(R38A) не способны регулировать транскрипцию. Отсутствие контактов лизина с углеводофосфатным остовом регуляторного участка ДНК было показано методом аффинной модификации белка 2'-альдегидсодержащими ДНК-дуплексами. Совокупность полученных данных в целом согласуется с нашими теоретическими предположениями, основанными на анализе модели комплекса N-концевой области М.SsoII с регуляторным участком (Karyagina et al, 2003). Остатки Arg35 и Arg38 довольно «жестко закреплены» около ДНК, в то время как остальные аминокислотные остатки не столь критичны для взаимодействия с лигандом.
Нами впервые показано, что аминокислотные замены в N-концевой области SsoII-подобной МТазы Ecll8kl влияют не только на ее способность регулировать транскрипцию в системе Р-М, но и на метилирующую активность фермента. В свою очередь замена Cysl42 на Ala в области белка, ответственной за метилирование, приводит к увеличению его сродства к регуляторному участку в ДНК. Полученные данные свидетельствуют о существовании взаимосвязи между функционированием двух ДНК-связывающих центров SsoII-подобных МТаз.
Принимая во внимание значительную структурную гомологию всех С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, включая эукариотические, результаты, полученные для М.SsoII и M.Ecll8kI, могут быть использованы для анализа принципов организации, структуры и механизма функционирования этих ферментов, а также для конструирования новых регуляторных белков, обладающих направленным влиянием на процесс регуляции в системах Р-М.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на конференции «Ломоносов-2006» (Москва, Россия, апрель 2006 г.), конференции «Ломоносов-2007» (Москва, Россия, апрель 2007 г.), конференции «Offspring-Meeting of the International Research Training Group Giefjen/Marburg-Moscow» (Москва, Россия, февраль 2008 г.), конференции Spring-Meeting and Workshop «Protein-protein interactions» (Раушхолыгхаузен, Германия, март 2008 г.), IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.) и конференции «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, апрель 2009 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен регуляции экспрессии генов в системах рестрикции-модификации прокариот на уровне транскрипции), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 84 рисунками, 5 схемами, 15 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 95 цитированных работ.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 07-04-00545 и программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых» (гранты 08-04-91973 ННИОМа и IRTG GRK 1384).
