Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 9
1. Механизмы нейродегенеративных процессов и роль митохондрий в них 9
1.1. Биомолекулярные основы болезни Альцгеймера 10
1.2. Роль митохондрий в патогенезе болезни Альцгеймера 19
1.2.1. Нарушение работы дыхательной цепи и продукция свободных радикалов как патогенетический фактор нейродегенеративных заболеваний 19
1.2.2. Накопление амилоида митохондриями 24
1.2.3. Открытие поры скачка митохондриальной проницаемости 25
1.2.4. Роль митохондрий в регуляции кальциевого гомеостаза клетки 34
1.3. Митохондрии как мишень терапии нейродегенеративных заболеваний 36
1.3.1. Модуляторы кальциевого гомеостаза клетки и митохондрий 36
1.3.2. Митохондриально-направленные соединения 38
1.3.3. Ингибиторы СМП 40
1.3.4. Димебон и его аналоги 41
Глава II. Материалы и методы 45
2.1. Приготовление гомогената мозга крыс 46
2.2. Выделение субклеточных фракций полушарий головного мозга крыс 46
2.3. Выделение митохондрий печени крыс 47
2.4. Определение белка в препаратах митохондрий при помощи микробиуретового метода 48
2.5. Определение трансмембранного потенциала митохондрий 48
2.6. Исследование скачка митохондриальной проницаемости 49
2.7. Скачок митохондриальной проницаемости энергизованных митохондрий 50
2.8. Скачок митохондриальной проницаемости деэнергизованных митохондрий 50
2.9. Исследование накопления кальция митохондриями и кальциевой мкости митохондрий мозга 50
2.10. Исследование конформационных переходов ANT. 51
2.11. Исследование образования АФК митохондриями 52
2.12. Определение интенсивности перекисного окисления липидов 53
2.13. Определение цитотоксичности и цитопротекторных свойств тетрагидро--
карболинов на первичных культурах нейронов крысят 53
2.14. Исследование процессов распределения в несмешивающихся средах 55
Глава III. Результаты и их обсуждение 56
3.1. Исследование действия димебона на митохондрии 56
3.1.1. Действие димебона на скачок митохондриальной проницаемости энергизованных митохондрий 56
3.1.2. Действие димебона на скачок митохондриальной проницаемости деэнергизованных митохондрий 58
3.1.3. Влияние АДФ на ингибирование СМП димебоном 60
3.1.4. Переносчик адениновых нуклеотидов как вероятная мишень действия димебона 61
3.1.5. Влияние димебона на кальциевый гомеостаз митохондрий 65
3.1.6. Исследование действия димебона на кальциевую мкость митохондрий в моделях болезни Альцгеймера 72
3.1.7. Влияние димебона на перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс 75
3.2. Поиск потенциальных нейропротекторов в ряду структурных аналогов
димебона 80
3.2.1. Разработка системы методов скрининга аналогов димебона 82
3.2.2. Скрининг биологической активности модифицированных пропионамидными фрагментами тетрагидро--карболинов 84
3.2.3. Скрининг биологической активности N-замещенных-тетрагидро--карболинов, содержащих пептидные остатки 88
3.2.4. Скрининг биологической активности фторсодержащих тетрагидро--карболинов 91
3.2.5. Влияние молекулярной структуры монофторированных аналогов димебона на свойства распределения в системе октанол/буфер 98
Выводы 101
Список литературы 102
- Нарушение работы дыхательной цепи и продукция свободных радикалов как патогенетический фактор нейродегенеративных заболеваний
- Определение трансмембранного потенциала митохондрий
- Действие димебона на скачок митохондриальной проницаемости деэнергизованных митохондрий
- Влияние молекулярной структуры монофторированных аналогов димебона на свойства распределения в системе октанол/буфер
Введение к работе
Актуальность темы
В связи с ростом средней продолжительности жизни в развитых странах одно из самых актуальных проблем здравоохранения является проблема обусловленных возрастом нейродегенеративных заболеваний. Наиболее распространенной формой деменции является болезнь Альцгеймера (БА). По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире проживает более 35 миллионов человек с БА, на лечение людей с деменцией и уход за ними ежегодно расходуется более 600 миллиардов долларов США. До сих пор не разработана эффективная нейропротекторная терапия, а препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний являются симптоматическими и направлены на компенсацию специфического для данного заболевания медиаторного дефицита, а также не решена проблема ранней медицинской диагностики данного заболевания.
Было установлено, что важным звеном патогенеза БА является нарушение
митохондриальных функций и, в том числе, снижение их способности регулировать
гомеостаз кальция в клетке и устойчивости к процессу скачка митохондриальной
проницаемости (СМП). Процесс СМП обусловлен открытием комплекса пор, что
является ключевым этапом каскадов гибели клеток. Именно поэтому митохондрии, и
особенно процесс СМП, являются крайне перспективной мишенью для поиска
нейропротекторных препаратов. Было показано, что нейропротекторное действие в
различных моделях токсичности отечественного препарата димебон (3,6-диметил-9-
(2-метилпиридил-5)-этил-1,2,3,4-тетрагидро--карболина дигидрохлорид),
являющегося одним из перспективных лекарственных средств
лечения БА, по меньшей мере частично обусловлено именно
взаимодействием с митохондриями - с его способностью
увеличивать их устойчивость к индукции СМП. Однако
конкретные митохондриальные мишени димебона до конца не
известны. В связи с этим возникает необходимость детального
исследования влияния и механизмов взаимодействия димебона с Рисунок 1.
основными компонентами поры СМП. Одновременно с этим, Структурная принимая во внимание нейропротекторное действие димебона, формула особый интерес представляет направленный синтез и димебона.
последующий скрининг активности ряда его структурных аналогов.
Целью настоящей работы являлось исследование механизма влияния димебона на процесс СМП и кальциевый гомеостаз митохондрий, а также поиск потенциальных эффективных нейропротекторов в ряду его новых структурных аналогов.
Основными задачами настоящей работы являлись:
-
Разработка комплексной системы скрининга на проявление митопротекторной активности и ее практическая проверка на примере оригинальных аналогов димебона в ряду производных тетрагидро--карболинов.
-
Исследование механизма действия димебона на явление скачка митохондриальной проницаемости митохондрий мозга крыс.
-
Исследование действие димебона на кальциевый гомеостаз митохондрий мозга крыс.
-
Анализ взаимосвязи структуры и влияния на функциональные характеристики митохондрий для серии оригинальных аналогов димебона в ряду производных тетрагидро--карболинов.
Научная новизна работы
Впервые исследованы механизмы влияния димебона на процесс СМП митохондрий мозга крыс. Показано, что способность димебона увеличивать устойчивость митохондрий к СМП зависит от энергизации митохондрий, при полном ингибировании работы дыхательной цепи димебон не подавляет СМП. Также показано, что, в отличие от известного ингибитора СМП циклоспорина А, димебон не влияет на конформационные переходы переносчика адениновых нуклеотидов. Способность димебона увеличивать кальциевую мкость митохондрий зависит от характера увеличения кальция в среде.
Был разработан комплекс методик для скрининга активности потенциальных
нейропротекторных препаратов, основной мишенью которых являются митохондрии.
С применением разработанного комплекса методов впервые был проанализирован
ряд новых структурных аналогов димебона, содержащих тетрагидро--карболиновую
фармакофорную группировку. Установлено, что биологическая активность
соединений зависит не только от природы заместителей в тетрагидро--карболиновой
группировке, но и от структуры фрагмента, связанного через этильный линкер,
присоединенный к атому азота пиррольного цикла. Обнаружены соединения, которые повышают устойчивость митохондрий к индукции СМП эффективнее, чем димебон. Показан нейропротекторный эффект соединения-лидера в моделях глутаматной эксайтотоксичности и в модели свободнорадикального окислительного стресса на первичных культурах гранулярных клеток новорожденных крыс.
Практическая значимость
Исследованные в настоящей работе соединения перспективны в качестве
эффективных препаратов для лечения, в том числе предупреждения,
нейродегенеративных расстройств (в первую очередь, БА). В настоящее время одно из выявленных соединений-лидеров выбрано для доклинических исследований в рамках Федеральной целевой программы Министерства образования и науки. Помимо этого, методологические находки при разработке совокупности методов скрининга ТГК также представляют практический интерес в области поиска потенциальных лекарственных препаратов, основной мишенью которых являются митохондрии.
Личный вклад автора
Диссертант принимал активное участие в постановке целей и задач работы, выборе методов исследования и их апробации. Экспериментальные исследования, анализ и интерпретация полученных результатов, а также подготовка научных статей к публикации выполнены непосредственно автором.
Апробация работы
Основные результаты были доложены на следующих Российских и международных конференциях: 1ая Российская конференция по медицинской химии «MedChem Russia-2013» (г. Москва, 2013), 17ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (г. Пущино, 2013), 26th ECNP Congress (г. Барселона, Испания, 2013), 4ая международная научная конференция «Химия, структура и функция биомолекул» (г. Минск, Белоруссия, 2012), 24th ECNP Congress (г. Париж, Франция, 2011), 8th IBRO Word Congress of Neuroscience (г. Флоренция, Италия, 2011).
Публикации
По материалам работы опубликовано 3 научные статьи в российских и международных журналах, 1 статья в электронном виде на сайте журнала и 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 123 страницах, включает 26 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 240 наименований.
Нарушение работы дыхательной цепи и продукция свободных радикалов как патогенетический фактор нейродегенеративных заболеваний
Как известно, старение является основным фактором риска различных нейродегенеративных заболеваний. С возрастом вероятность развития БА значительно увеличивается, в возрасте 65-69 лет около 2% людей страдают БА, а после 90 лет – уже 25% [62]. Митохондриальная гипотеза учитывает данный факт. Согласно этой гипотезе, с возрастом происходит снижение эффективности митохондрий, что приводит к росту концентрации АФК, что вызывает чрезмерное образование A.
Митохондриальная дисфункция является одним из самых первых признаков БА [63,64]. В 2005 году впервые было показано, что внутримитохондриальное накопление амилоидных форм предшествует внеклеточному накоплению [65]. Также следует принимать во внимание, что нарушение митохондриальной функции вследствие роста окислительного стресса может способствовать образованию бета-амилоидных олигомеров. Образующиеся пептиды вызывают еще большее повреждение митохондрий, что усугубляет окислительный стресс и может вызывать апоптоз. То есть именно нарушение митохондриальной функции запускает цикл само-стимулированной генерации бета-амилоида.
Митохондрии, которые также называют энергетическими станциями клетки, являются не только основным источником АТФ, но также контролируют различные процессы в клетках. Митохондрии обладают собственной мДНК, кодирующей в числе прочего некоторые субъединицы четырех комплексов дыхательной цепи (комплексов I, III, IV, V). Известно, что при работе дыхательной цепи происходит утечка до 2% электронов, в результате чего образуются активные формы кислорода – супероксид анион (O2-), перекись водорода (H2O2) и гидроксильный радикал . Супероксид анион радикал может также реагировать с другими радикалами, например с NO, с образованием активных форм азота. В здоровых организмах опасные АФК и АФА нейтрализует эндогенная антиоксидантная система - супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза или глутатионпероксидаза. В ходе старения и при нейродегенеративных заболеваниях высокий уровень АФК, также называемый окислительным стрессом, приводит к накоплению окисленных форм белков, липидов, нуклеиновых кислот, то есть может приводить к нарушению функций клеток [54]. Стоит подчеркнуть, что помимо токсичных свойств, АФК также выполняют роль сигнальных молекул, регулирующих ряд физиологических процессов [66,67].
Считается, что наш мозг особо восприимчив к окислительному стрессу по трем причинам. Во-первых, мозг потребляет около 20% от общего количества потребляемого кислорода, при этом по массе он составляет 2%. Во-вторых, в мозге повышен уровень полиненасыщенных жирных кислот, в-третьих, в мозге снижена антиоксидантная защита по сравнению с другими органами [68]. Рост окислительного стресса при старении был показан несколькими независимыми группами исследователей [69–72]. На основании этих данных была сформулирована теория, согласно которой образование АФК в процессе дыхания митохондрий приводит к окислительному повреждению белков дыхательной цепи и к соматическим мутациям мДНК, что в свою очередь приводит к снижению дыхательной функции митохондрий, и в результате к БА [73].
С другой стороны, есть данные о том, что рост образования АФК инициирует токсичный процессинг APP, то есть протеолиз APP по амилоидогенному пути. На различных клеточных моделях было показано, что вызванный гидроксиноненалем (HNE) и перекисью водорода окислительный стресс приводит к увеличению продукции A [74,75]. При исследовании действия АФК, селективно генерируемых комплексом I, был также описан рост уровня бета-амилоида [76]. Авторы этой работы ингибировали ротеноном комплекс I на клетках линий HEK293 и SY5Y и показали значительное увеличение уровня A40 в обоих случаях. Эта гипотеза была также подтверждена на разных моделях мышей. В работе Chen и соавторов описано исследование действия параквата на митохондриальные характеристики и образование A у мышей дикого типа и у трансгенных мышей с мутацией APP. Как известно, паракват часто используется в качестве модели оксидативного стресса. Было показано, что паракват увеличивает уровень A40 (мышей) у животных дикого типа, вызывает снижение активностей ферментов дыхательной цепи митохондрий и приводит к когнитивным нарушениям. У мышей со сверхэкспрессией PRDX3 – внутримитохондриального белка, обладающего антиоксидантной активностью, введение параквата не вызывало повреждения митохондрий и роста уровня A40. У мышей с экспрессией APP человека (Tg2576) паракват вызывает рост уровней как A40, так и A42, который у мышей, не экспрессирующих APP человека, не обнаруживается. Мыши с одновременными мутациями APP и PRDX3 также оказались устойчивы к воздействию параквата, их уровень A40 и A42 не отличался от уровня соответствующих контролей [77]. Предполагается, что рост уровня бета-амилоида под действием окислительного стресса происходит в результате повышающей посттранскрипционной регуляции BACE1 [77].
В защиту теории о ключевой роли митохондрий в патогенезе БА также выступают данные, полученные на мышах линии SAMP8. Преждевременно стареющие мыши SAMP8 обладают мутацией A11181G в гене mt-ND-4. Этот ген кодирует одну из субъединиц комплекса I. У стареющих мышей этой линии выявлено увеличение уровня A на 50% [78,79].
Приведенные выше литературные данные свидетельствуют о тесной взаимосвязи активности комплекса I дыхательной цепи митохондрий и амилоидогенного процессинга белка-предшественника амилоида APP. Также показано, что экспрессия APOE4 уменьшает экспрессию комплекса I [80].
Известно, что активность комплекса I значительно снижается в процессе естественного старения, в то время как активность комплекса III практически не меняется [81–84]. Стоит принять во внимание, что семь субъединиц активного центра комплекса I (из как минимум 45) кодирует мДНК. Мутации менее защищенной по сравнению с ядерной мДНК под действием АФК могут приводить к снижению активности комплекса I и к росту генерации АФК. Различные железосерные кластеры комплекса I также могут являться мишенью АФК, а их окислительная модификация может приводить к изменению ферментативной активности комплекса I и к нарушению функции митохондрий в целом. Считается, что окислительный стресс и нарушение функций митохондрий являются связующим звеном между синдромом Дауна и БА [85]. У больных с синдромом Дауна повышен риск развития БА: в возрасте 35-49 лет он составляет 8%, а в возрасте старше 60 лет – 75% [86,87]. Уже в раннем возрасте у больных повышен уровень окислительного стресса и нарушены митохондриальные функции [88]. На трансгенных мышах, моделирующих синдром Дауна, и на фибробластах больных с этим заболеванием было показано снижение активности комплекса I и увеличение уровня генерации АФК [89]. Эти дефекты можно отчасти объяснить трипликацией генов APP и SOD-1. Существует мнение, что увеличение экспрессии SOD-1 связано с ростом образования H2O2, что приводит к смещению равновесия процессов восстановления супероксида [88].
Определение трансмембранного потенциала митохондрий
Трансмембранный потенциал митохондрий измеряли по флуоресценции потенциал-зависимого индикатора сафранина О на многофункциональном планшетном анализаторе Victor 3 (Perkin Elmer, США) [205]. Регистрировали флуоресценцию при ех 485 нм / ет 590 нм.
Рабочую суспензию митохондрий готовили в буфере А, состоящем из 225 мМ маннитола, 75 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes, 0.02 мМ ЭГТА, 1 мМ КН2Р04 (рН 7.4). Концентрация митохондрий составляла 0.2 мг/мл для несинаптосомальных митохондрий мозга или 0.5 мг/мл для митохондрий печени крыс. Индикатор потенциала к суспензии митохондрий добавляли непосредственно перед началом измерения в концентрации 5 мкМ.
Суспензию митохондрий с индикатором помещали в 96-луночный плоскодонный планшет и регистрировали изменение трансмембранного потенциала при помощи планшетного анализатора Victor 3. Оценивали действие исследуемых соединений на трансмембранный потенциал митохондрий как при инкубации митохондрий с исследуемыми соединениями до энергизации митохондрий, так и при добавлении соединений к митохондриям на фоне энергизации. Через 5 минут от начала записи к суспензии добавляли субстраты дыхания митохондрий: 5 мМ глутамат калия и 2.5 мМ малат калия, либо 5 мМ пируват калия и 2.5 малат калия, либо 5 мМ сукцинат калия в присутствии 1 мкМ ротенона. Запись продолжали в течение 30 минут, после чего добавляли 1 мкМ CCCP для полной деполяризации митохондрий. Анализ полученных данных проводили с помощью графика зависимости флуоресценции от времени с помощью программ Microsoft Excel и OriginPro.
Действие соединений на скачок митохондриальной проницаемости оценивали по их влиянию на набухание митохондрий [205]. Процесс набухания митохондрий регистрировали спектрофотометрически в 96-луночных планшетах при 530 нм на планшетном анализаторе Victor 3 (Perkin Elmer, США) при 30С. Действие соединений исследовали как на препаратах энергизованных митохондрий (в присутствии субстратов дыхательной цепи митохондрий), так и на препаратах деэнергизованных митохондрий (в условиях ингибирования дыхательной цепи митохондрий). Концентрация митохондрий составляла 0.2 мг/мл для несинаптосомальных митохондрий мозга или 0.5 мг/мл для митохондрий печени крыс. В качестве индукторов СМП использовали растворы хлорида кальция, атрактилозида, бета-амилоида. 2
Митохондрии инкубировали с изучаемыми соединениями в буфере А (225 мМ маннитола, 75 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes, 0.02 мМ ЭГТА, 1 мМ КН2Р04, рН 7.4) в присутствии субстратов дыхательной цепи митохондрий (5 мМ сукцината натрия и 1 мкМ ротенона или 5 мМ глутамата натрия и 2.5 мМ малата натрия). В качестве контролей использовали равный объем соответствующего растворителя, используемого для растворения веществ. При изучении ДМСО растворимых веществ концентрация растворителя не превышала 1%. Через 5 минут после начала записи к суспензии митохондрий добавляли инжектором 5 мкл индуктора открытия поры. Скорость набухания оценивали как АА530/мин. и вычисляли как тангенс угла наклона наиболее крутого участка кривой зависимости A5зо от времени в программах Microsoft Excel и OriginPro.
Митохондрии инкубировали с изучаемыми соединениями в буфере Б (150 мМ KCl, 25 мМ Hepes, 10 мМ Tris, 0.5 мкМ ротенон, 0.5 мкМ антимицин А, 2 мкМ А23187, рН 7.4). В лунки контроля добавляли равный объем растворителя, использовавшегося для приготовления маточных растворов соединений. Плашку помещали в анализатор и регистрировали изменения оптической плотности при постоянной температуре 30С. Самопроизвольное набухание митохондрий в присутствии соединений регистрировали в течение 5 минут, после чего к суспензии митохондрий добавляли инжектором 5 мкл индуктора открытия поры. Сравнивали максимальные скорости набухания, которые оценивали как угол наклона кривой изменения светопропускания от времени на наиболее отвесном участке. Обработку данных проводили в программах Microsoft Excel и OriginPro.
Кальциевую емкость несинаптосомальных митохондрий мозга определяли спектрофлуориметрически с использованием внешнемитохондриального кальциевого зонда четвертого поколения – Calcium Green-5N (CaG5N) [206]. Измерения проводили в 24-луночных и 96-луночных планшетах при помощи многофункционального планшетного анализатора Victor 3 (Perkin Elmer, США). Измерения проводили в 3 различных режимах: режиме единственной добавки, режиме болюсов и режиме насоса [120,207,208].
Для всех трех вариантов постановки эксперимента зонд в концентрации 100 нМ добавляли к суспензии митохондрий непосредственно перед началом измерения. Митохондрии (0.2 мг/мл) инкубировали в KCl-буфере (120 мМ KCl, 20 мМ Hepes, 100 мМ сахароза, 0.2 мМ KH2PO4, 0.45 мМ MgCl2, 0.15 мМ АДФ, 1 мг/мл олигомицин, pH 7.2) в присутствии субстратов дыхательной цепи с исследуемыми соединениями в лунках планшетов.
При постановке экспериментов в режиме насоса использовали 24-луночные планшеты. К суспензии митохондрий каждые 20 секунд инжектором добавляли по 5 мкл раствора хлорида кальция, то есть со средней скоростью 10 мкМ/мин (150 нмоль Са2+/мг белка митохондрий в минуту). Кальциевую емкость оценивали исходя из времени начала максимального выброса кальция митохондриями.
Эксперименты в режиме единой добавки и в режиме болюсов проводили в 96-луночных планшетах с темными стенками с темным или прозрачным дном. В режиме единственной добавки кальций добавляли однократно при помощи инжектор. Оценивали время до начала выброса кальция и максимальную скорость увеличения концентрации катиона Ca2+ вне митохондрий. В режиме болюсов CaCl2 добавляли к суспензии митохондрий инжектором каждые 2.5 минуты по 30 нмоль Са2+/мг белка. Оценивали количество кальция, добавленного к суспензии митохондрий до момента начала резкого роста концентрации катиона вне митохондрий.
Конформационные изменения ANT оценивали по изменению светопропускания при 530 нм в буфере В (120 мМ KCl, 20 мМ K-HEPES, 10 мМ Tris, pH 7.2, 0.5 мМ ЭГТА, 1 мМ KH2PO4, 5 мМ сукцинат калия) при помощи планшетного анализатора Victor 3 (Perkin Elmer, США) [147]. Каждая проба содержала 1 мг/мл белка. Известно, что при данных условиях внутренний объем митохондрий не меняется, то есть изменения оптической плотности обусловлены не открытием поры. Смотрели влияние атрактилозида и катионов кальция на конформацию ANT. К суспензии митохондрий при помощи многоканальной пипетки добавляли атрактилозид и/или хлорид кальция. О конформации ANT судили по форме кривой зависимости А530 от времени.
Действие димебона на скачок митохондриальной проницаемости деэнергизованных митохондрий
С целью исследования действия димебона непосредственно на пСМП были проведены эксперименты с использованием модели деэнергизованных митохондрий. Изолированные митохондрии мозга крыс инкубировали в среде, содержащей ингибиторы NADH-убихинонредуктазы и цитохром-ц-редуктазы -ротенон и антимицин А, а также кальцимицин (ионофор антибиотик А23187). В этих экспериментальных условиях, поскольку дыхание митохондрий заблокировано, невозможен активный транспорт кальция в митохондриальный матрикс. Наличие кальцимицина в среде инкубации позволяет катионам Са2+ свободно диффундировать в/из митохондрии без изменения митохондриального трансмембранного потенциала. В условиях деэнергизованных митохондрий димебон не способен ингибировать СМП, вызванный катионами кальция как на митохондриях мозга, так и на митохондриях печени крыс (Рисунок 5). Рисунок 5. Кальций-индуцированное набухание деэнергизованных митохондрий. Открытие пор скачка митохондриальной проницаемости в мозге (А) или в печени (Б) индуцировали добавлением 0.2 мМ CaCl2 (400 нмоль/мг) в присутствии димебона.
Циклоспорин ингибирует СМП в деэнергизованных митохондриях как печени, так и мозга в диапазоне концентраций 10нМ - 1 мкМ. В работе при сравнении с ЦсА использовали его в концентрации 1 мкМ. Данная концентрация выбрана на основании литературных данных и позволяет избежать токсического действия высоких концентраций ЦсА [216].
Димебон не только не снижает скорость набухания митохондрий, но наоборот, незначительно увеличивает е как на митохондриях мозга, так и на митохондриях печени крыс. Модель энергизованных митохондрий ближе к состоянию in situ, однако использование деэнергизованных митохондрий позволяет проанализировать действие соединения на ансамбль пСМП, не принимая во внимания потенциал-зависимые или потенциал-формирующие (m) факторы, оказывающие регуляторное действие на процесс е образования. Такие факторы как соотношение АДФ/АТФ в клетке, вход и выход Ca2+, состояние дыхательной цепи митохондрий способны оказывать влияние на СМП. Полученный результат может свидетельствовать о том, что димебон не взаимодействует непосредственно с основными компонентами образующейся в данных условиях пСМП, в отличие от ЦсА, который связывается с CypD. Действие димебона на пСМП может зависеть от дыхательной активности митохондрий, либо быть направлено на регуляцию кальциевого гомеостаза. На настоящий день нет единого мнения как о составе пСМП, так и о возможных физиологических модуляторах е активности. Можно предположить, что пора может иметь переменный белковый состав, который может зависеть от множества факторов, в том числе и от тех, которые исключает модель деэнергизованных митохондрий.
Известно, что в митохондриях печени и мозга АДФ способен ингибировать Са2+-вызванный СМП. Для циклоспорина А показано, что ингибирование СМП в его присутствии зависит от наличия в инкубационной смеси АДФ. В присутствии АДФ ингибирование процесса СМП циклоспорином А эффективней. Степень ингибирования СМП димебоном не зависит от наличия АДФ и олигомицина (Рисунок 6). Рисунок 6. Влияние АДФ на кальций-индуцированное набухание митохондрий мозга. Митохондрии (0.2 мг/мл) инкубировали с димебоном (30мкМ) или циклоспорином А (1 мкМ) в присутствии (+АДФ) или без (-АДФ) 0.5 мМ АДФ и олигомицина (1 мкг/мл) в течение 5 минут. Открытие поры вызывали добавлением 25 мкМ раствора хлорида кальция. Представлены средние значения зависимости светопропускания от времени в 3 параллелях в рамках одного опыта.
В различных структурных моделях поры СМП переносчик адениновых нуклеотидов (ANT) занимает положение основного е компонента. Механизм осуществления этим переносчиком основной функции - обмена АДФ и АТФ -связан с внутримембранным конформационным вращением переносчика с фиксированием двух (ц- и м-) функционально различных конформаций. Известно, что переход переносчика адениновых нуклеотидов ANT в ц-конформацию в присутствии ионов кальция может увеличивать чувствительность митохондрий к индукции открытия поры. Атрактилозид, являющийся конкурентным ингибитором обмена АДФ/АТФ через соответствующий переносчик, переводит и стабилизирует ANT в ц-конформации [217,218]. Атрактилозид обладает высоким сродством к ANT (Kd 1мкМ) [135]. Таким образом концентрации 5 мкМ достаточно для полного связывания ингибитора с ANT. Однако атрактилозид в концентрации 5 мкМ фиксирует ANT в ц-конформации лишь в присутствии катионов кальция [219]. Поэтому с целью выявить возможное участие этого компонента поры в механизме действия димебона мы исследовали действие димебона на набухание митохондрий мозга, индуцированное как низкими (5мкМ) концентрациями атрактилозида в присутствии катионов кальция, так и высокими концентрациями атрактилозида в отсутствии добавления внешнего кальция.
В опытах на изолированных митохондриях мозга добавление 5 мкМ атрактилозида не приводило к набуханию митохондрий, но потенцировало кальций-индуцированное открытие митохондриальной поры СМП (Рисунок 7).
Влияние молекулярной структуры монофторированных аналогов димебона на свойства распределения в системе октанол/буфер
Одними из важных процессов, играющих ключевую роль в доставке веществ, являются процессы распределения. Как правило, это начальные стадии абсорбции, которые предшествуют диффузии вещества через мембраны (пассивный транспорт). Кроме этого, выбор траекторий доставки в пределах мембран (межклеточная или внутриклеточная) также определяется характеристиками распределения. Иными словами, рассматриваемые процессы описывают гидрофильно-липофильный баланс молекулы. В этой части работы нами, совместно с сотрудниками лаборатории "Физической химии лекарственных соединений" ИХР РАН (г.Иваново) под руководством д.х.н. Перлович Г.Л., были изучены процессы распределения в несмешивающихся средах, моделирующих различные типы биологических мембран. Так, система н-октанол/буфер (pH 7.4) описывает процессы, происходящие в амфифильных мембранах и может отчасти моделировать наружную мембрану митохондрий, тогда как н-гексан/буфер (pH 7.4) в большей степени отражает условия внутренней мембраны митохондрий. Результаты проведенных экспериментов приведены в Таблица 10.
Как следует из Таблица 10, значения коэффициентов распределения в системе буфер/октанол ( Doct/ buf ) лежат в пределах от 25 до 70. Значения для системы буфер/гексан ( Dhex/buf ) находятся в пределах от 0.6 до 6. Причем, два соединения (1a и 1d) имеют значения меньше 1. Это свидетельствует о том, что данные вещества предпочитают водо-обогащенные пути доставки внутрь мембранноограниченных структур, тогда как оставшиеся – гексановую фазу (т.е. фазу, неотягощенную специфическими взаимодействиями). Следует отметить, что значения Dhex/buf не сильно отличаются от единицы, что предполагает сопоставимые диффузионные потоки рассматриваемых соединений в обеих несмешивающихся фазах.
Если рассмотреть соединения, отличающиеся только заместителем в положении 8-, то их можно расположить в порядке уменьшения Doct/ buf : 1a (H-) 1c (F-) 1d (Cl-) 1b (CH3-). В свою очередь данный ряд веществ в порядке уменьшения Dhex/buf выглядит следующим образом: 1b (Me-) 1c (F-) 1d (Cl-) 1a (H-). Если рассмотреть сопоставимые структуры, то добавление метиленового фрагмента в заместителе в положении 2- приводит к следующим изменениям коэффициентов распределения: для 1e Doct/ buf увеличивается на 4.9 по сравнению с 1b, тогда как для системы буфер/гексан наблюдается противоположный тренд и значение Dhex/buf для 1e уменьшается на 2.53 по сравнению с 1b. Сопоставление же соединений 1f и 1d показывает, что Doct/ buf при добавлении метиленового фрагмента уменьшается на 6.3, тогда как коэффициент распределения Dhex/buf увеличивается на 5.
Была выявлена закономерность изменения способности соединений снижать индукцию СМП в зависимости от их коэффициента распределения в системе октанол/буфер (Рисунок 26). При увеличении коэффициента распределения Doct/buf (увеличения липофильности соединения) способность соединений подавлять индукцию СМП уменьшается. В то же время, корреляции активности соединений и
Dhex/buf не обнаружено. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что как димебон, так и его аналоги, вероятнее всего взаимодействует не с интегральными мембранными компонентами, а с мишенями, локализованными либо в межмембранном пространстве митохондрий, либо связанными с наружной стороной внутренней мембраны митохондрий.
1. Разработана комплексная система скрининга соединений на проявление митопротекторной активности как основа создания мультитаргетных нейропротекторных препаратов. Проведено исследование активности свыше тридцати новых тетрагидро--карболинов с использованием разработанной системы методов скрининга.
2. Впервые установлено, что митохондрии мозга мышей линии 5хFAD (трансгенной модели болезни Альцгеймера) обладают значительно сниженной кальциевой мкостью.
3. Обнаружено, что способность димебона увеличивать устойчивость митохондрий мозга крыс к СМП проявляется в условиях энергизации митохондрий, не зависит от присутствия в среде АДФ и не связана с влиянием на конформационные переходы переносчика адениновых нуклеотидов. Димебон одинаково эффективно ингибирует скачок митохондриальной проницаемости in vitro как на митохондриях мозга, так и на митохондриях печени крыс.
4. Показано, что в ряду структурных аналогов димебона способность влиять на устойчивость митохондрий к индукции СМП зависит не только от вида заместителей в тетрагидро--карболиновом фрагменте молекулы соединения, но и от группы, связанной с пиррольным атомом азота через этильный мостик. Соединения, содержащие алифатический заместитель, в указанных экспериментах не активны.
5. В ряду структурных аналогов димебона выявлены соединения-хиты, представляющие интерес для дальнейшей разработки в качестве потенциальных лекарственных препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний. Соединение-лидер (1b) передано для доклинических испытаний в рамках Федеральной целевой программы Министерства образования и науки.
