Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Взаимосвязь стрессоустойчивости организма с функциональной межполушарной асимметрией 12
1.2. Биохимические сдвиги в функционировании головного мозга при нарушении мозгового кровообращения 16
1.2.1. Механизмы ишемического и реперфузионного нарушений функционирования клеток головного мозга 16
1.2.2. Нарушения энергетического обмена при ишемическом повреждении мозга 19
1.2.3. Избыток глутамата и повышение концентрации внутриклеточного кальция при ишемии мозга 22
1.2.4. Развитие окислительного стресса в мозге при нарушении мозгового кровообращения 26
1.2.5. Роль радикала оксида азота в развитии окислительного стресса при нарушении мозгового кровообращения 34
1.3. Структура и механизм действия AR-R 17477 40
Глава 2. Материалы и методы исследования. 44
2.1. Постановка эксперимента 44
2.2. Определение латерального профиля у крыс 45
2.3. Приготовление гомогенатов мозга 46
2.4. Биохимические методы исследования ткани мозга 46
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 52
Глава 3. Описание полученных результатов 53
3.1 . Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на свободнорадикальные процессы в мозге крыс с разным латеральным профилем 53
3.1.1. Содержание ТБК-реактивных продуктов в мозге крыс с разным латеральным профилем при окклюзии сонных артерий под влиянием ARR 17477 53
3.1.2. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на активность каталазы и функциональное состояние глутатионовой системы в мозге крыс с разным латеральным профилем 58
3.1.3. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на содержание белковых тиоловых групп в мозге крыс с разным латеральным профилем 85
3.2. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на энергетический обмен в мозге крыс с разным латеральным профилем 90
3.2.1. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на содержание глюкозы в мозге крыс с разным латеральным профилем 90
3.2.2. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на содержание пирувата в мозге крыс с разным латеральным профилем 94
3.2.3. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на содержание лактата в мозге крыс с разным латеральным профилем 99
3.3. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на коэффициенты асимметрий нейрохимических систем в мозге крыс с разным латеральным профилем. 104
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 120
Выводы. 139
Список литературы 141
Приложения 166
- Взаимосвязь стрессоустойчивости организма с функциональной межполушарной асимметрией
- Избыток глутамата и повышение концентрации внутриклеточного кальция при ишемии мозга
- Постановка эксперимента
- . Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на свободнорадикальные процессы в мозге крыс с разным латеральным профилем
Введение к работе
Изменение интенсификации свободнорадикальных процессов (СРП) возникает в организме в ответ на любое воздействие (Болдырев, 2001; Лобов с соавт., 2002; Olney, 1994; Shivakumar et al., 1995; Kondo et al., 1997; Rao et al., 1999; Adibhatia et al., 2003; Warner et al., 2004 и др.). В условиях стресса могут развиваться* энергетический дефицит (Биленко, 1989; Лукьянова с соавт., 2007), дестабилизация клеточных мембран и нарушение процессов рецепторного-связывания (Гусев, Скворцова, 2001; Скворцова, 2003), что приводит к гибели клеток по механизмам'некроза и апоптоза (Chopp; Li, 1996; Morita-Fujimura et al, 2001; Nozaki et al., 2001; Kim et al., 2002; Crack et al., 2006 и др.).
Одним из основных медиаторов, регулирующих развитие этих процессов, является оксид азота, исследование* которого стал о возможным после открытия ферментных систем, ответственных за продукцию NO (Реутов, 1995). При этом использование ингибиторов NO-синтаз в различных моделях стресса способствует раскрытию' вопроса о взаимосвязи антиоксидантного статуса и состояния системы оксида азота. Известно, что синтез индуцибельной NO-синтазы в макрофагах и других клетках организма является основой неспецифической резистентности и адаптации к стрессорным воздействиям (Меерсон с соавт., 1994), а ингибирование деятельности индуцибельной NO-синтазы снижает проявления1 окислительного стресса в условиях ишемического повреждения мозга (Parmentier et al., 1999; Rawal et al., 2004).
Одним из малоизученных препаратов, включающихся в регуляцию активности синтаз оксида азота, является AR-R 17477. Опираясь на данные литературы, можно утверждать, что AR-R 17477 ингибирует как индуцибельную (Проскуряков с соавт., 2005), так и нейрональную изоформы NO-синтазы (Harukuni et al., 1999; O'Neil et al., 2000; Fedorov et al., 2004; Willmot et al., 2005). Важно, что данный препарат не ингибирует эндотелиальную NO-синтазу в силу ее важнейшей роли в поддержании сосудистого тонуса (Fedorov et al., 2004).
В настоящее время широко, обсуждается проблема функционального состояния систем N0 и антиоксидантов в контексте межполушарных взаимоотношений в, условиях стресса. Исходя из представления о сопряженности поведенческого, нейрофизиологического и биохимического уровней системы функциональной' межполушарной асимметрии (Клименко, 2004), наиболее адекватной^ моделью1 для изучения показателей свободнорадикального окисления* является нарушение мозгового кровообращения (НМК) у животных с разным латеральным профилем.
Актуальность проблемы ишемического повреждения і мозга обусловлена тем, что, согласно статистическим^ данным, ежегодное мире переносят инсульт около 6 млн. человек, а в-России - более 450 тысяч (Яхно, Парфенов, 2000). Сосудистые заболевания» головного мозга являются^ одной из- ведущих причин заболеваемости, смертности и инвалидизаци№ в. нашей стране (Верещагин, Суслина, 2003"; Гусев с соавт., 2003). При этом локализация» ишемического очага в мозге в значительной мере определяет степень, функциональных и регуляторных нарушений.в организме (Кадыков, 2003), вероятно, в том числе, в результате различий в антиоксидантном статусе структур мозга, а именно; латерализации нейрохимических систем (Фокин, Пономарева, 2004).
В связи с вышесказанным, целью данного исследования* явилось изучение влияния ингибитора NO-синтазы на развитие окислительного стресса и изменение энергетического» обмена в мозге крыс с разным латеральным профилем при* двусторонней окклюзии сонных артерий.
В соответствии с поставленной целью были определены, следующие*
задачи'исследования:
1. Исследовать состояние свободнорадикальных процессов и
і. энергетического баланса в мозге крыс с разным латеральным профилем, при 3-
минутной окклюзии сонной артерии со стороны полушария, контралатерального направленности побежек и ротаций в лабиринте, и 24-часовом лигировании сонной артерии со стороны полушария, ипсилатерального направленности побежек и ротаций.
Изучить состояние свободнорадикальных процессов и энергетического баланса в мозге крыс с разным латеральным профилем при 3-минутной окклюзии сонной артерии со стороны полушария, ипсилатерального направленности побежек и ротаций, и 24-часовом лигировании сонной артерии со стороны полушария, контралатерального направленности побежек и ротаций в лабиринте.
Выявить влияние ингибитора синтазы оксида азота (AR-R 17477) на свободнорадикальные процессы и энергетический баланс в мозге ложнооперированных крыс с разным латеральным профилем.
Исследовать влияние AR-R 17477 на процессы свободнорадикального окисления и энергетический баланс в структурах мозга крыс с разным латеральным профилем, находящихся в условиях двусторонней окклюзии сонных артерий.
Выявить критерии устойчивости организма к окклюзии сонных артерий различной продолжительности у животных с разным латеральным профилем по изменению межполушарных взаимоотношений нейрохимических систем.
Положения, выносимые на защиту.
1. В коре больших полушарий ложнооперированных животных с
праволатеральным профилем уровень ТБК-реактивных продуктов и
антиоксидантных ферментов выше, чем у крыс с леволатеральным профилем,
что является неспецифическим фактором, определяющим устойчивость
животных с разным латеральным профилем к стрессу. При стрессовом
воздействии одинаковой интенсивности у животных с праволатеральным
профилем происходит более выраженное истощение антиоксидантной системы
и накопление молочной кислоты в мозге по сравнению с левополушарными
крысами, что определяет больший процент выживаемости последних.
2. Снижение интенсификации свободнорадикальных процессов и увеличение
асимметрии в распределении нейрохимических систем в коре больших
полушарий и в стволовых структурах мозга крыс в условиях введения AR-R
17477 перед двусторонней окклюзией сонных артерий способствуют
8 возрастанию процента выживаемости животных с разным латеральным профилем. У крыс с праволатеральным профилем введение AR-R 17477 перед 24-часовой окклюзией правой сонной артерии и 3-минутной окклюзией левой сонной артерии оказывает наиболее значительное влияние на энергетический обмен, что сопровождается повышением процента выживаемости животных в два раза в данной модели стресса.
3. Под влиянием введения ингибитора синтазы оксида азота ложнооперированным животным с разным латеральным профилем происходит повышение межполушарных перестроек в функциональных системах антиоксидантных ферментов.
Научно-практическая значимость работы.
Результаты исследования расширяют представления о нейрохимических основах формирования резистентности организма к условиям нарушения мозгового кровообращения в зависимости от латерального профиля. Результаты работы дополняют теоретические сведения о развитии окислительного стресса и изменении энергетического обмена в мозге крыс при нарушении мозгового кровообращения. Полученные данные о влиянии AR-R 17477 на показатели системы антиоксидантных ферментов и энергетического обмена открывают перспективу его практического применения в неврологической практике в качестве лекарственного препарата.
Основные результаты работы внедрены в учебный процесс в виде методических разработок для проведения лекционных, практических и семинарских занятий в процессе преподавания вузовских курсов по «Физиологии человека» и «Психофизиологическим основам интеллектуальной деятельности» на кафедре анатомии и физиологии детей и подростков Педагогического института Южного федерального университета.
Научная новизна результатов исследования.
Впервые в модели двусторонней окклюзии сонных артерий были установлены различия в протекании свободнорадикальных процессов и энергетического обмена в структурах мозга крыс с разным латеральным
9 профилем.
Впервые было показано, что низкая устойчивость правополушарных крыс в условиях окклюзии- сонных артерий формируется в результате недостаточности антиоксидантнои системы защиты и энергетического дефицита в структурах мозга.
Впервые было показано, что ингибитор синтазы оксида азота (AR-R 17477) снижает интенсивность свободнорадикальных процессов, улучшает состояние энергетического обмена в головном мозге у крыс с разным латеральным профилем при двусторонней окклюзии сонных артерий.
Апробация диссертационной работы.
Материалы диссертации были представлены на IV научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005), на Всероссийской конференции с международным участием^ «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007), на II' научно-практической конференции «Современные проблемы общей биологии и естествознания» (Ростов н/Д, 2007), на, I международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов н/Д, 2007), на IV конференции с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Паттайа, Таиланд, 2007), на IV научной международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Гоа, Индия, 2007), на II научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы науки и образования» (Варадеро, Куба, 2007).
Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
1. Косенко, Ю.В. Влияние функциональной межполушарной асимметрии и ингибитора индуцибельной NO-синтазы на показатели свободнорадикальных процессов в мозге у крыс при окклюзии сонных артерий / Ю.В. Косенко, A.M.
10 Менджерицкий, Г.В. Карантыш // Валеология. — 2007. - № 4. - С. 20-25 (0,21 п.л., личн. вк. 60%).
2. Менджерицкий, A.M. Влияние ингибитора индуцибельной NO-синтазы
на показатели системы свободнорадикальных процессов у крыс с разным
латеральным профилем в условиях нарушения мозгового кровообращения /
A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш, Ю.В. Косенко // Нейрохимия. - 2008. - Т.
25, № 3. - С. 1-6 (0,21 п.л., личн. вк. 60%.).
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Карантыш, Г.В. Баланс нейромедиаторов и свободнорадикальные процессы при ишемии/реперфузии / Г.В. Карантыш, A.M. Менджерицкий, И.Л. Краснова, Ю.В. Косенко // Сборник трудов 4-й Научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Смоленск, 2005. - С. 275-277 (0,08 п.л., личн. вк. 30%).
Косенко, Ю.В. Влияние AR-R 17477 на уровень МДА и активность глутатионпероксидазы и глутатион-8-трансферазы в гемисферах коры у крыс с разным латеральным профилем при хронической окклюзии сонных артерий со стороны доминирующего полушария / Ю.В. Косенко, Г.В. Карантыш, A.M. Менджерицкий // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга». - М.: ГУ НИИ неврологии РАМН, 2007. - С. 331-335 (0,21 п.л., личн. вк. 80%).
Менджерицкий, A.M. Влияние окклюзии сонных артерий на глутатионовую систему крыс с разным латеральным профилем / A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш, Ю.В. Косенко // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 1. - С. 77-79 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).
Косенко, Ю.В. Влияние ингибитора индуцибельной NO-синтазы на ферментативную активность глутатионпероксидазы в мозге крыс с разным латеральным профилем при окклюзии сонных артерий / Ю.В. Косенко, СВ. Демьяненко, Г.В. Карантыш, A.M. Менджерицкий // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 3. - С. 81-83 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).
Косенко, Ю.В. Энергетический обмен в мозге крыс с разным латеральным профилем при окклюзии сонных артерий / Ю.В. Косенко, Г.В. Карантыш, A.M. Менджерицкий // Фундаментальные исследования. - 2007. -№ 4. - С. 72-74 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).
Косенко, Ю.В. Влияние ингибитора индуцибельной NO-синтазы на энергетический метаболизм в мозге правополушарных крыс /Ю.В. Косенко, Г.В. Карантыш, A.M. Менджерицкий // Сборник тезисов докладов 2-й Научно-практической конференции «Современные проблемы общей биологии и естествознания». - Ростов-н/Д.;: Изд-во ПИКЭФУ, 2007. - С. 33-35 (0,13 п.л., личн. вк. 80%).
Косенко, Ю.В. Функциональные перестройки нейрохимических систем у животных с разным латеральным профилем в условиях окклюзии сонных артерий / Ю.В. Косенко // Материалы Первой Международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине». - Ростов-н/Д.: ЦВВР, 2007. - С. 21-22 (0,08 п.л., личн. вк. 100%).
10. Mendzheritskii, A.M. Effect of an inhibitor of inducible NO-synthase on
the indices of free radical-mediated process in rats with different lateralization
profiles under conditions of impaired cerebral blood flow I A.M. Mendzheritskii,
G.V. Karantysh, Yu.V. Kosenko II Neurochemical J. - 2008. - Vol. 25, № 3. - P.
209-214 (0,21 п.л., личн. вк. 60%).
Структура работы.
Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 257 источников (96 отечественных и 161 работа иностранных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 31 рисунком.
LINK1 Взаимосвязь стрессоустойчивости организма с функциональной межполушарной асимметрией LINK1 Мозг у позвоночных - парный орган. Его разделение на два полушария обусловлено билатеральным планом строения тела, симметрией сенсорных и моторных функций. Каждое полушарие связано с противоположной половиной тела (контралатерально) - это основные эволюционно древние связи. Смысл этого перекреста остается неясным. Эволюционно молодые и более слабые ипси-связи играют второстепенную роль, которая также неясна. Полушария головного мозга связаны со сторонами тела энергетическими (сонные артерии) и информационными (нервные пути) связями. Первые - только ипси-, вторые -контра- и ипси-связи: (Геодакян, 2005).
Долгое время считалось, что ФМА у животных отсутствует и присуща только человеческому мозгу. После введения понятия «индивидуальной» асимметрии (Бианки, 1985) подтвердилось наличие раннее обнаруженной моторной асимметрии конечностей у крыс, кошек, приматов. Тем самым было доказано наличие ФМА у животных. Таким образом, ФМА — одно из основополагающих неспецифических и эволюционно детерменированных свойств нервной системы (Черноситов, Орлов, 2004).
В норме у человека и животных имеются межполушарные различия в уровне содержания белков, активности ферментов, нейрогормонов, спонтанному и вызванному электрогенезу (Рахимов с соавт., 1989; Starr, Kilpatrick, 1981; Gainotti et al., 1982; Glick et al., 1988). Также доказано; что систолическое давление крови в глазной артерии у правополушарных, как правило, выше справа, у левополушарных - слева, а у амбидекстеров -одинаково (Касинов, Никитюк, 1975).
В работах Г.Н. Косицкого, В.М. Смирнова (1970) было показано, что искусственно сформированная доминанта в одном из полушарий повышает стрессоустойчивость организма. Причем более высокая стрессоустойчивость наблюдается в случае доминирования левого полушария (Русинова, 1997): В работах А.В. Черноситова, В.И. Орлова (2004) также показан наименьший уровень летальности в условиях стресса среди леводоминантных особей, у которых латеральный профиль пробежек в лабиринте был более 0,3 (Черноситов, Орлов, 2004).
У людей при ишемическом поражении левого полушария наблюдались наиболее значимые нарушения высших психических функций. Однако при поражении правого полушария восстановление высших психических функций происходит медленнее (Боголепова, 2004). Возможно, это обусловлено более высокими компенсаторными возможностями левого полушария по сравнению с правым полушарием (Доброхотова, Брагина, 1994).
Важная- роль, в механизмах стрессоустойчивости и неспецифической резистентности принадлежит катехоламиновой системе. Катехоламины рассматриваются как одно из звеньев патогезеза экстремальных состояний и стресса. Именно с их неравномерным распределением в полушариях связывают моторные проявления ФМА (Черноситов, Орлов, 2004). В более ранних исследованиях М. Попай с соавт. (1984) доказано, что под влиянием различных экстремальных воздействий происходит симметризация содержания катехоламинов в полушариях. Однако в настоящее время показано, что неоднородная для разных структур мозга межполушарная дезинтеграция катехоламинов на фоне их общего снижения и увеличения интенсивности СРП, является важным звеном патогенеза и определяет высокую стрессуязвимость особей (Черноситов, Орлов, 2004).
Известно, что морфологические изменения ФМА могут быть связаны, с гормональными сдвигами, например, при акромегалии. Возможно поэтому направление исходного моторного предпочтения (правшество или левшество) могут в какой-то части быть результатом нарушений гормонального статуса (Иоффе с соавт., 2004). Действительно, в ряде исследований показана корреляция гормональных сдвигов со знаком моторного предпочтения. Обнаружены, разные изменения содержания- гипофизарного гормона пролактина в ответ на стресс у мышей с разным моторным предпочтением, причем эти изменения были различны в разных генетических линиях (Waters et al., 1996). Подобные же результаты были получены при исследовании содержания адренокортикотропного гормона (Beancur et al., 1992). В то же время самцы не обнаруживали корреляции моторного предпочтения с изменением содержания пролактина и адренокортикотропного гормона в ответ на стресс.
Обнаружены также межполушарные различия в регуляции вегетативных функций. Предполагается, что правое полушарие оказывает более значительное влияние на иммунитет и деятельность эндокринных желез (Gerendai, Halasz, 1997). Таким образом, поскольку правое полушарие в большей степени контролирует гуморальную, эндокринную и вегетативную регуляторные системы, то, считается, что возможности правого полушария определяют эффективность мозговой гемодинамики. Именно поэтому увеличение линейной скорости кровотока в ответ на гипоксическую пробу больше у людей с праволатеральным профилем. Более эффективная мозговая гемодинамика у левшей обусловлена тем, что при гипоксии и падении оксигенации артериальной крови до 80% у них не происходит снижение кровоснабжения левого полушария, в отличие от правшей (Леутин, 2004). По мнению данного автора, нейрофизиологическая организация, обусловливающая устойчивость мозгового кровообращения в полушариях мозга у левшей является фактором, ответственным за более высокие адаптационные возможности людей с праволатеральным профилем к условиям гипоксии.
ФМА и межполушарные отношения - это два феномена, базирующиеся на сравнении деятельности полушарий. Межполушарные отношения практически всегда рассматриваются в контексте физиологических, чаще электрофизиологических, исследований. Для определения устойчивых МО в настоящее время используется показатель уровня постоянного потенциала головного мозга. Уровень постоянного потенциала отражает потенциалы гематоэнцефалического барьера (ГЭБ); зависящие: от концентрации ионов водорода в? мозге. А так как снижение рВ и интенсивность энергетического обмена в головном, мозге взаимосвязаны, то;, следовательно; по- величине уровня? постоянного потенциала можно судить об интенсивности обмена.. В: результате выяснилось,, что; в; норме, (состояние4 спокойного бодрствования) энергетический1 обмен выше в доминантном полушарии,, однако? у левшей наблюдалась более: значительная; вариабельность данного показателя . При умеренном; стрессе активность, церебрального: энергетического обмена;, как; правило,. перемещается- в субдоминантное полушарие, что является «отдыхом» для деятельности доминантного( полушария и сопровождается- изменением центральной регуляции; гомеостаза. Жри различных видах патологии подобное: переключение; затруднено; что4 приводит к нарушению процессов» адаптации (Фокин, Пономарева, 2004); В! исследованиях. Л(Л. Клименко (2000) установлена взаимосвязь асимметричного распределения уровня постоянного потенциала с различной: интенсивностью; энергетического- обмена и, соответственно; с разной теплопродукцией коры больших полушарий. А также сделан: вывод о том, что: доминантные полушария; характеризуются меньшим: уровнем постоянного потенциала, температурой иг меньшей: концентрацией продуктов перекисного окисленшшшпидовшо сравнению с субдоминантными.
Избыток глутамата и повышение концентрации внутриклеточного кальция при ишемии мозга
В работах M.J. Puke, Z. Wiesenfeld-Hallin (1994) показано, что эффективность синаптосомального поглощения глутамата зависит не от уровня гипоксии в мозговой ткани, а от концентрации глюкозы в мозге. На уровень глутамата и аспартата во внеклеточном пространстве оказывают влияние температура, рН и концентрации внеклеточных ионов К+ и Na+ (Гусев, Скворцова, 2001). Известно, что повышение уровня глутамата прямо пропорционально температуре в очаге инфаркта мозга (Nakashima et al., 1996). Кроме того, снижение рН до 5,8 предотвращает обратный захват глутамата астроцитами (Puka, Lehmann, 1994; Swanson et al., 1994). Вследствие снижения активности Na+/K+-ATPa3bi при дефиците ATP, происходит массивный вход ионов Na+ в нейроны, и, следовательно, уменьшение №+-зависимого оттока глутамата из синаптической щели (Fujisawa et al., 1993). При этом поток ионов Na+ сопровождается поступлением в клетку воды и ионов СГ, что приводит к набуханию апикальных дендритов и лизису нейронов (Гусев, Скворцова, 2002).
Избыточный выброс во внеклеточное пространство глутамата и аспартата при снижении синтеза АТР в условиях НМК связан с резким увеличением концентрации ионов К+ в экстрацеллюлярном пространстве (Zablocka, Domanska-Janik, 1996). Кроме того, увеличение внеклеточного К+ приводит также и к повышенному содержанию гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и глицина во внеклеточном пространстве (Mainprize et al., 1995).
В экспериментальных исследованиях Е.И. Гусева и В.И. Скворцовой (2001) установлена значимость дисбаланса между возбуждающими и тормозными нейротрансмиттерными системами. В патогенезе ишемического инсульта важную роль играет дефицит защитных тормозных механизмов, прежде всего ГАМКергических. Ранняя нормализация уровня глутамата в экстрацеллюлярном пространстве также имеет свою патологическую значимость. Она связана с энергетическим дефицитом и, следовательно, с нарушением энергозависимого внутриклеточного синтеза глутамата из продуктов цикла Кребса.
Для удаления нейромедиаторов из синаптической щели существуют три основных механизма: 1) ферментативное расщепление; 2) диффузия через пресинаптическую мембрану; 3) обратный захват нейромедиатора пресинаптическими окончаниями или глиальными клетками. Основным механизмом для инактивации глутамата из синаптической щели является обратный захват медиатора пресинаптическим окончанием и глиальными клетками. Этот процесс протекает медленно и при многих патологических состояниях приводит к накоплению глутамата в синаптической щели (Мошарова с соавт., 2004).
Одной из важнейших особенностей глутамата является его участие во внутриклеточной регуляции ионов Са" (Мошарова с соавт., 2004). Перевозбуждение глутаматом NMDA-рецепторов приводит к резкому повышению концентрации внутриклеточного Са (Гусев, Скворцова, 2002). При взаимодействии глутамата с ионотропными глутаматными рецепторами стойкое повышение Са+ обусловлено постоянным открытием кальциевых каналов и нарушением функции выведения Са из клеток. Это приводит к деполяризации митохондрий и нарушению обратного захвата Са митохондриями. Вследствие этого прекращается аэробный синтез АТР (Мошарова с соавт., 2004). Неконкурентные антагонисты АМРА-рецепторов (EGIS-8332 и GYKI 53405) значительно уменьшают размер инфаркта мозга (на 30% и более) но не позднее, чем через 180 минут от начала ишемии (Matucz et. al., 2006). Метаботропные глутаматные рецепторы стимулируют образование внутриклеточных посредников (диацилглицерола и инозитол-1,4,5-трифосфата), которые индуцируют высвобождение кальция из внутриклеточных депо (Хунтеев, Дамбинова, 2001).
Наиболее чувствительными к ишемии являются пирамидные клетки СА1 области гиппокампа и нейроны дорсолатерального отдела стриатума, что связано с высокой плотностью кальциевых каналов на поверхности нейронов (Ginsberg, 1990). Огромное количество глутаматных » аспартатных рецепторов на дендритах этих нейронов компенсируется большим числом рецепторов для ГАМК на телах клеток (Siesjo, 1986).
Следует также отметить, что наряду с ионами Са2+ в механизмах повреждения нейронов участвуют также и ионы-Zn2+. NMDA-рецепторы для глутаминовой кислоты содержат 2п2+-связывающий участок. Zn2+ неконкурентный антагонист NMDA-рецепторов для фенциклидинсвязывающего- сайта (Peters et al., 1987). Ионы Zn уменьшают время открывания канала NMDA-рецепторов (Mayer et al., 1988). Важно отметить токсические эффекты высоких концентраций экстрацеллюлярного о,і. Zn . В работах J.Y. Koh et al-. (1996) было показано, что при глобальной церебральной г ишемии происходит накопление экстрацеллюлярного Zn2+ в постсинаптических гиппокампальных нейронах перед их гибелью. Когда приток внеклеточного, Zn" в постсинаптические нейроны блокируется, гибель нейронов предотвращается. Поэтому, избыточные концентрации внутриклеточного цинка вызывают некроз или апоптоз (Sensl et al., 1997). Однако умеренное увеличение Zn2+ в плазме проявляет защитные эффекты. Существует также терапевтическое доказательство защитных эффектов некоторых концентраций цинка. В том числе, трициклический антидепрессант -дезметилимипрамин имеет свойства, подобно действию-Zn2+, а именно может связываться с тем же самым сайтом NMDA-рецепторов (Baron et al., 1989).
Кроме того, при ишемическом повреждении мозга происходит нарушение ГЭБ. При повышенном количестве глутамата в синаптической щели возможно проникновение альбумина через измененный ГЭБ. Это приводит к дополнительному открытию Са -каналов NMDA-рецепторов (Eimerl, Schramm, 1991).
Постановка эксперимента
Исследование проводили на 196 крысах-самцах линии Вистар в возрасте 6 месяцев, массой 200-250 г. Животных содержали в условиях вивария при температуре +18 - +20С на стандартном рационе питания.
В работе использовали модель двусторонней окклюзии сонных артерий (Pulsinelli et al., 1982) с целью- развития у животных ишемических и реперфузионных повреждений структур мозга. Крыс обездвиживали введением 1,2 мл 1% раствора тиопентала на 100 г массы тела животного. Все хирургические процедуры проводили стерильно. Ингибитор синтазы оксида азота вводили в дозе 30 мг/кг веса (Du et al., 2000; Reif et al., 2000; O Neil et al., 2000). Контрольной группой служила группа «ложнооперированных» животных, которым проводилась аналогичная операция, но без окклюзии сонных артерий.
В зависимости от поставленной задачи экспериментальные животные с разным латеральным профилем были разделены на 6 групп: Экспериментальные животные с разным латеральным профилем были разделены на шесть групп: 1-я группа - контрольные ложнооперированные крысы с праволатеральным (п = 8) и леволатеральным профилем (n = 8); 2-я группа - животные с праволатеральным (n = 30) и леволатеральным профилем (n = 24), которым проводили перевязку сонной артерии (СА) со стороны полушария, контралатерального направленности побежек и ротаций (НПР) в лабиринте, на 3 минуты и окклюзию СА со стороны полушария, ипсилатерального НПР, на 24 часа; 3-я группа - крысы с праволатеральным (п = 29) и леволатеральным профилем (n = 18), которым моделировали окклюзию СА со стороны полушария, ипсилатерального НПР, на 3 минуты и 24-часовую окклюзию СА со стороны полушария, контралатерального НПР; 4-я группа — крысы с праволатеральным (п = 8) и леволатеральным профилем (n = 8), которым за 1 час до ложной, операции (л/о)- внутрибрюшинно вводили» AR-R 17477 в дозе-30 мг/кг веса; 5-я группа — крысы с праволатеральным (п = 17)и леволатеральным профилем (п = 16), которым внутрибрюшинно за. 1 час до операции вводили AR-R 17477 (30 мг/кг), затем проводили перевязку СА со стороны полушария; контралатерального Hi IP, .на- 3- минуты и окклюзию, GA со стороны полушария, ипсилатерального НИР, на 24 часа; 6-я,группа - крысы,с праволатеральным. (п = 19) и леволатеральным (п =11) профилем, которым-за 1 час до.oпepaцииiвнyтpибpюшиннo ввoдили AR-R 17477 (30 мг/кг) и проводили окклюзию СА со стороны- полушария; ипсилатерального. HTTP; на 3 минуты, и окклюзию,СА со стороны-полушария, контралатерального HI\Р, на 24 часа.
Через, 24 часа после операции, животных-декапитировали в утренние часы (чтобы избежать суточных колебаний ритма). Мозг извлекали и при минусовой температуре выделяли правук и- левую- кору больших полушарий, а также правые и левые стволовые структуры. Результаты сравнивали с контрольной группой животных.
Bof всех сериях эксперимента в- гомогенатах отделов мозга определяли: содержание ТБК-реактивных продуктов; активность АО-ферментов - каталазы,. глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы» и глутатион-Б-трансферазы, а также уровень, восстановленного глутатиона, тиоловых групп белков. Интенсивность углеводного» обмена в мозге оценивали по содержанию основных метаболитов: глюкозы, пировиноградной кислотьт и молочной-кислоты.
Латеральный профиль- животных определяли с использованием Y-образного лабиринта (Ефимов с соавт., 1987). Тестирование крыс в Y-образном лабиринте проводили в одно и то же время суток (с 10 до 14 часов) в,течение нескольких дней при максимальном ограничении внешних раздражителей. Вычисление латерального профиля (ЛП) проводили по формуле: л-п лп = л+п где Л и П — суммарное количество левосторонних и правосторонних побежек и ротаций (разворотов в тупиках коридоров) крысы за несколько сеансов тестирования. Латеральный профиль побежек является адекватным показателем степени выраженности и направленности функциональной межполушарной асимметрии для крыс вне зависимости от их пола. Согласно данным литературы (Русинов, 1977; Порошенко 1985) электрофизиологические корреляты моторно-ориентационной асимметрии в сопоставлении с электрофизиологическими признаками искусственно1 сформированной доминанты позволяют рассматривать полушарие, ипсилатеральное преимущественной направленности побежек в лабиринте, как доминантное.
. Влияние введения AR-R 17477 перед окклюзией сонных артерий на свободнорадикальные процессы в мозге крыс с разным латеральным профилем
К настоящему времени накоплено большое количество данных об изменениях свободнорадикальных процессов при ишемических и реперфузионных повреждениях мозга (Биленко, 1989; Гусев, Скворцова, 2001; Лобов с соавт., 2002; Суслина, Максимова, 2004; Abe et al., 1987; Chan, 1988; Oliver et al., 1990; Olney, 1994; Shivakumar et al., 1995; Halliwell, Gutteridge, 1999; Rao et al., 1999; Warner et al., 2004). Однако в настоящее время недостаточно изучено влияние ингибитора синтазы оксида азота (AR-R 17477) на адаптационные процессы животных с разным ЛП при НМК. Известно, что крысы с ЛЛП более устойчивы к стрессорным воздействиям по сравнению с правополушарными (Русинова, 1997; Черноситов, Орлов, 2004). Поэтому на данный момент времени закрепилось предположение о важной роли функциональной межполушарной асимметрии в обеспечении адаптационных процессов организма. При этом другим неспецифическим механизмом на стресс является изменение интенсивности СРП, одну из ведущих ролей в которых играет оксид азота.
С целью выявления механизмов, лежащих в основе стратегии адаптации животных с разным ЛП, находящихся в условиях введения AR-R 17477, было проведено исследование функционального состояния отдельных нейрохимических систем в мозге крыс при окклюзии СА различной продолжительности. Развитие окислительного стресса в головном мозге при патологических воздействиях обусловлено интенсивным потреблением кислорода нейронами, высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот, аскорбата, а также недостаточно высокой активностью антиоксидантных систем (каталазы, ГПО) (Болдырев, 2001; Гусев, Скворцова, 2001).
В связи с этим, в данном исследовании проведено изучение содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) — наиболее часто исследуемого интегративного показателя, отражающего степень окислительного повреждения клетки (прил. 1). Содержание ТБК-РП в мозге у ложнооперированных крыс с разным ЛП представлено в табл. 1. Таблица 1. Содержание ТБК-РП в мозге (нмоль/г белка) у ложнооперированных крыс с разным латеральным профилем, (М±т) Группы Правая корабольших полушарий Левая корабольшихполушарий Правые стволовые структуры Левые стволовые структуры Контроль, крысы с ПЛП 26,22±0,89 26,33±0,98 27,49±1,43 24,32±1,15 Контроль, крысы с ЛЛП 21,02±0,81# 20,09±0,72# 28,40±1,21 25,45±1,67 ВведениеAR-R 17477 перед л/окрысам с ПЛП 24,57±2,31 24,78±1,67 22,32±0,93 22,67±2,21 ВведениеAR-R 17477 перед л/окрысам с ЛЛП 19,27±1,08 18,23±0,89 17,47±1,56 20,33±1,21 Примечание: р 0,05 по сравнению с контролем; # р 0,05 между крысами с ПЛП и ЛЛП. Согласно проведенному исследованию у ложнооперированных крыс с ЛЛП уровень ТБК-РП был ниже в правой коре больших полушарий на -20% (р 0,05) и в левой коре больших полушарий на -24% (р 0,05) относительно правополушарных крыс. В результате введения AR-R 17477 перед ложной операцией (л/о) у правополушарных крыс наблюдалось снижение данного показателя в правых стволовых структурах на -19% (р 0,05), а у крыс с ЛЛП снижение в правых и левых стволовых структурах, соответственно, на -39% (р 0,05) и на -20% (р 0,05) относительно контроля (табл.1). Во 2-й группе крыс с ПЛП в условиях 3-минутной окклюзии С А со стороны полушария контралатерального НПР и 24-часовой окклюзии СА со стороны полушария ипсилатерального НПР увеличение уровня ТБК-РП составляло в правой коре больших полушарий +132% (р 0,01), левой коре больших полушарий +38% (р 0,05), правых стволовых структурах +76% (р 0,05) и левых стволовых структурах +36% (р 0,05) относительно контроля. В результате введения AR-R 17477 перед аналогичной моделью окклюзии СА у правополушарных крыс (5-я группа) содержание ТБК-РП достоверно не отличалось от контроля (рис. 2). У левополушарных животных при 3-минутной окклюзии правой С А и 24-часовом лигировании левой СА (2-я группа) наблюдалось значительное накопление ТБК-РП в правой коре больших полушарий на +212% (р 0,001), левой коре больших полушарий на +231% (р 0,001) и левых стволовых структурах на +54% (р 0,05) относительно контроля. Введение AR-R 17477 перед данной моделью окклюзии С А крысам с ЛЛП (5-я группа) способствовало снижению уровень ТБК-РП достоверно не отличался от контрольных значений (рис. 2). При 24-часовом лигировании СА со стороны недоминирующего полушария и 3-минутной окклюзии С А со стороны доминирующего полушария у крыс с ПЛП (3-я группа) происходило увеличение уровня ТБК-РП в правой и левой коре больших полушарий, а также в левых стволовых структурах, соответственно, на +212% (р 0,001), +146% (р 0,01), +40% (р 0,05) по сравнению с контролем. В аналогичной модели окклюзии СА у левополушарных крыс (3-я группа) увеличение содержания ТБК-РП составляло в правой коре больших полушарий +75% (р 0,05), левой коре больших полушарий +46% (р 0,05), правых стволовых структурах +71% (р 0,05) и левых стволовых структурах +30% (р 0,05) по сравнению с контролем. В результате введения AR-R 17477 перед 3-минутной окклюзией СА со стороны доминирующего полушария и 24-часовой окклюзией СА со стороны недоминирующего полушария у крыс с разным ЛП (6-я группа) уровень ТБК-РП достоверно не отличался от контроля (рис. 3).
