Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
1.1. Актуальность проблемы 4
1.2. Цель и задачи исследования 4
1.3. Научная новизна 5
1.4. Научно-практическая значимость работы 6
1.5. Обоснование постановки темы диссертационной работы 7
2. Обзор литературы 9
2.1. Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот Основные элементы 9
2.1.1. Промоторы 9
2.1.2. Энхансеры 20
2.1.3. Транскрипционные факторы 25
2.1.4. Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК
2.2. Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов 45
3. Материалы и методы 51
3.1. Материалы и оборудование 51
3.2. Методы 53
4. Результаты и обсуждение 66
4.1. Определение нуклеотидной последовательности промоторной области гена человека RFP2
4.2. Компьютерный анализ промоторной области гена человека RFP2.
4.3. Функциональная характеристика промоторного региона гена человека RFP2
4.4. Потенциальные регуляторные элементы промоторной области гена человека RFP2
4.5. Установление структуры гена мыши Щр2 85
4.6. Сравнительный анализ области гена RFP2 у человека и мыши 88
Общее заключение 90
Выводы 91
Список цитируемой литературы. 93
- Научно-практическая значимость работы
- Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот Основные элементы
- Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов
- Установление структуры гена мыши Щр2
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы.
Опухолевые заболевания являются одной из ведущих по частоте групп болезней человека и одной из основных причин смертности взрослого населения. Вероятность возникновения и интенсивность прогрессии опухолей зависят от генотипа индивида и от соматических мутаций, возникающих в процессе индивидуального развития. Важным генетическим барьером на пути возникновения и прогрессии опухолей являются гены-супрессоры опухолей. Мутации в этих генах «запускают» опухолевый процесс и этапы его прогрессии. Изучение тонкой структуры и регуляции генов супрессоров у человека необходимы для понимания генетического контроля нормы, определяемой этими генами, и молекулярно-генетических механизмов возникновения и прогрессии опухолей. Поэтому проведение таких исследований является высоко актуальным.
Такие исследования стали возможны в последние годы в результате реализации всемирной и российской программ геном человека. Исследование тонкой структуры и функционирование отдельных областей генома проводят сегодня путем сопоставления данных о структуре генома человека в норме с данными о его структуре при патологическом опухолевом процессе, а также на основе данных сравнительной геномики. Такой подход стал возможным лишь в самое последнее время, и бвл использован в ходе осуществления данной диссертационной работы.
1.2. Цель и задачи исследования.
Целью исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей регуляторного района гена RFP2 человека, как наиболее вероятного гена супрессора опухолевого роста, расположенного в области ql4 хромосомы 13.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
1. Определить нуклеотидную последовательность промоторного региона гена RFP2 человека и точку инициации транскрипции для этого гена.
2. Провести биоинформатический анализ промоторной области и выявить потенциальные элементы регуляции транскрипции гена RFP2
3. Выявить и провести анализ спектра потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов и список самих транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторной областью гена RFP2 у человека
4. Минимизировать промоторную область гена RFP2 человека и экспериментально локализовать потенциальные регуляторные элементы этого гена.
5. Определить нуклеотидную последовательность промоторного региона гена RFP2 мыши и провести биоинформатический сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов промоторных районов гена RFP2 человека и мыши и, таким образом, выявить причины сходства спектров тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши.
1.3. Научная новизна.
Впервые определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность нуклеотидов длиной 3,6 т.п.н содержащая промоторный регион гена человека RFP2. Экспериментально определено положение точки инициации транскрипции гена RFP2. Впервые проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и выявлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2: в транскрибируемой нити ДНК перед GC-боксом расположен несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена асимметрия в распределении количества сайтов связывания транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой нити ДНК, а в нити, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют. Впервые с помощью люциферазных конструкций локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность мРНК гена RFP2. Определены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в участках промотора гена RFP2, предположительно содержащих энхансер и сайленсер. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека и мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белок-кодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека. Впервые с помощью биоинформатического анализа в регуляторной части гена RFP2 у мыши выявлен набор 20 потенциальных сайтов связывания для 18 факторов транскрипции, относящимися к 11 семействам. Проведен сравнительный анализ наборов сайтов связывания транскрипционных факторов и самих транскрипционных факторов в регуляторной области генов RFP2 у мыши и человека.
1.4. Практическая значимость.
Установление последовательности нуклеотидов промоторной области потенциального гена супрессора опухолей RFP2 практически полезно в качестве основы для мутационного скрининга повреждений этого гена в группах пациентов с опухолевыми заболеваниями, сопровождающимися утратой области генома 13q 14.
1.5. Обоснование постановки темы диссертационной работы.
Одной из областей генома человека, предположительно участвующих в супрессии опухолевого фенотипа является область 13ql4.3. В составе этой области выявлено несколько генов, которые как предполагается, могут выполнять функцию гена-супрессора опухолевого роста. Одним из наиболее вероятных генов-кандидатов в области 13ql4 является ген RFP2. Мутационный анализ белок-кодирующих участков этого гена не выявил соматических мутаций у больных хроническим лимфолейкозом
- тем не менее, именно в этой группе больных утрата области генома 13ql4 является наиболее частой (до 80% в некоторых выборках) [Liu et al., 1997].
Одной из возможных мишеней для мутаций, инактивирующих ген, является его регуляторная область. Для проведения мутационного анализа этой области у больных необходимо знание ее структуры и принципов ее регуляции в норме. Структура промоторной области в случае гена RFP2 человека была неизвестна к началу данной работы, хотя первая версия черновой последовательности генома человека к тому времени уже была доступна. Кроме того, структура регуляторнои области гена влияет на тканевый спектр его экспрессии. Поэтому информация о структуре регуляторнои области опухолевых супрессоров , необходима для понимания молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолей, ассоциированных с утратой области 13ql4, в том числе множественной миеломы и карциномы простаты [Tiazhelova et al., 2004].
Представление о важности отдельных элементов регуляторной области может быть получено на основе сравнительного анализа регуляторных областей ортологичных генов у родственных видов. Было известно, что спектры тканеспецифичности экспрессии генов RFP2 человека и мыши сходны [Baranova et al., 2003], что позволяло надеяться на большее понимание механизмов регуляции тканеспецифичности этого гена при сравнительном анализе структур его регуляторных областей у двух видов. Структура кодирующей области мышиного ортолога гена RFP2 человека была известна, однако регуляторная область не была секвенирована к началу данной работы, что и определило постановку данной цели исследования.
Таким образом, данная работа посвящена актуальной задаче изучения и сравнительного анализя регуляторных областей гена RFP2 у человека и мыши. Работа проводилась в рамках плановой тематики ИОГен РАН и поддерживалась грантами российских программ «Геном человека» и «РФФИ».
Научно-практическая значимость работы
Впервые определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность нуклеотидов длиной 3,6 т.п.н содержащая промоторный регион гена человека RFP2. Экспериментально определено положение точки инициации транскрипции гена RFP2. Впервые проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и выявлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2: в транскрибируемой нити ДНК перед GC-боксом расположен несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена асимметрия в распределении количества сайтов связывания транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой нити ДНК, а в нити, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют. Впервые с помощью люциферазных конструкций локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность мРНК гена RFP2. Определены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в участках промотора гена RFP2, предположительно содержащих энхансер и сайленсер. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека и мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белок-кодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека. Впервые с помощью биоинформатического анализа в регуляторной части гена RFP2 у мыши выявлен набор 20 потенциальных сайтов связывания для 18 факторов транскрипции, относящимися к 11 семействам. Проведен сравнительный анализ наборов сайтов связывания транскрипционных факторов и самих транскрипционных факторов в регуляторной области генов RFP2 у мыши и человека. Установление последовательности нуклеотидов промоторной области потенциального гена супрессора опухолей RFP2 практически полезно в качестве основы для мутационного скрининга повреждений этого гена в группах пациентов с опухолевыми заболеваниями, сопровождающимися утратой области генома 13q 14.
Одной из областей генома человека, предположительно участвующих в супрессии опухолевого фенотипа является область 13ql4.3. В составе этой области выявлено несколько генов, которые как предполагается, могут выполнять функцию гена-супрессора опухолевого роста. Одним из наиболее вероятных генов-кандидатов в области 13ql4 является ген RFP2. Мутационный анализ белок-кодирующих участков этого гена не выявил соматических мутаций у больных хроническим лимфолейкозом - тем не менее, именно в этой группе больных утрата области генома 13ql4 является наиболее частой (до 80% в некоторых выборках) [Liu et al., 1997]. Одной из возможных мишеней для мутаций, инактивирующих ген, является его регуляторная область. Для проведения мутационного анализа этой области у больных необходимо знание ее структуры и принципов ее регуляции в норме. Структура промоторной области в случае гена RFP2 человека была неизвестна к началу данной работы, хотя первая версия черновой последовательности генома человека к тому времени уже была доступна. Кроме того, структура регуляторнои области гена влияет на тканевый спектр его экспрессии. Поэтому информация о структуре регуляторнои области опухолевых супрессоров , необходима для понимания молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолей, ассоциированных с утратой области 13ql4, в том числе множественной миеломы и карциномы простаты [Tiazhelova et al., 2004].
Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот Основные элементы
Промоторный участок является основным регуляторным районом гена, принципиально важным для его правильного функционирования. С этой последовательности нуклеотидов с помощью РНК-полимеразы начинается синтез РНК. У высших эукариот, в том числе и у человека существуют три РНК-полимеразы: I, II и III. Каждая из них распознает свой набор промоторов и, тем самым, транскрибирует свой набор генов [Патрушев, 2000].
РНК-полимераза I транскрибирует рибосомальные гены (18S, 5.8S и 28S), представленные сотнями повторяющихся копий, разделенных спейсерами. Промоторы РНК-полимеразы I содержат два базальных регуляторных элемента (CPE - core promoter element), локализованных между положениями - 75 и -50, а также -30 и +1. Последовательность СРЕ обеспечивает специфичность транскрипции генов рРНК, и присутствие её достаточно для инициации.
Спейсеры, разделяющие рибосомальные гены, соответствуют по своим свойствам промоторам, однако, несмотря на то, что в них удается выявить минимальные участки с промоторной активностью, к сожаленью вывести для них консенсусную последовательность оказалось пока невозможным. Надо сказать, что в конце каждого спейсера находится сайт терминации размером 5 нуклеотидов, который отвечает также и за реинициацию нового транскрипта. При высвобождении транскрипта полимераза I остаётся связанной с ДНК и, в результате взаимодействия с дополнительным белковым фактором, тут же начинает следующий акт инициации транскрипции. Благодаря сопряжению актов терминации и инициации в одном сайте обеспечивается высокая эффективность процесса транскрипции, поскольку каждый новый акт инициации не требует поиска промотора. РНК-полимераза III транскрибирует три класса генов: гены 5S рРНК, тРНК и гены, кодирующие малые ядерные РНК. Транскрипция этих генов не зависит от последовательностей, расположенных перед ними, а определяется промотором, который лежит внутри этих генов (Shenk Т., 1981). В случае генов тРНК, промотор состоит из двух блоков, разделенных отрезком ДНК длиной около 20 п.н. Первый блок начинается через 8-30 п.н. после точки инициации транскрипции и представлен видеконсенсусной последовательности TGGCNNAGTGG. Второй блок начинается в позициях (+51 -+72) и имеет консенсус - GGTTCGANNCC. РНК полимераза II транскрибирует самый большой (более 40 тысяч) и самый разнообразный класс РНК - матричные РНК (мРНК), а также некоторые малые РНК (миРНК). Из трех РНК полимераз полимераза II является самой доступной для регуляции. Промоторы, узнаваемые РНК полимеразой II чрезвычайно многообразны. Длина их варьируется от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Сама по себе РНК полимераза II не способна к связыванию с ДНК и инициации транскрипции. По сути, все промоторы РНК полимеразы П являются уникальными, так как включают в себя множество различных комбинаций сайтов посадки регуляторных факторов. Регуляторные факторы связываются с генами в районе, соответсвующем их факторов. Энхансеры, напротив, могут быть удалены от старта транскрипции на большое расстояние, до 60 тысяч пар оснований, их находят и в 5 -концевых и в З -концевых участках генов, энхансеры могут перекрываться как с экзонами, так и с интронами.
Если элементы базального промотора определяют точку начала транскрипции, то регуляторные проксимальные и другие элементы увеличивают частоту (или вероятность), с которой транскрипция инициируется, а также определяют тканеспецифический спектр экспрессии транскрипта.
До недавнего времени было очень мало известно в целом о альтернативных промоторах. В литературе было описано более 200 альтернативных промоторов, что позволяет представить, как выглядит механизм этого явления.
Вклад альтернативных промоторов в разнообразие транскриптома оценен по анализу базы данных полноразмерных клонов мыши. В анализ входило порядка 21 тысячи полноразмерных траскриптов, и по проведенному анализу их первых 5 альтернативных экзонов было выявлено около 9% генов имеющих альтернативный промотор [Okazaki et al., 2002].
Подобная работа была сделана и на транскриптоме человека. В компьютерный анализ были взяты 67 тысяч мРНК, кластеризующихся в 18 тысяч локусов [Stamm et al., 2002]. Анализ выявил, что порядка 18% генов имели альтернативное затравление.
В последнее время были найдены так называемые двунаправленные промоторы, способные направлять транскрипцию генов, расположенных на двух разных цепях ДНК. Конечно, одновременная транскрипция с комплементарных нитей ДНК с одного и того же участка при участии двух комплексов РНК-полимеразы II невозможна вследствие огромных размеров транскрипционной машины.
Комплексы, собираемые на разных цепях ДНК, могут конкурировать между собой, или же направление работы промотора может быть тканеспецифичным.
Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов
Первые результаты сравнения генома человека и чернового варианта генома мыши показали, что в результате такого подхода можно извлечь очень большое количество информации и значительно облегчить процесс поиска генов. Сравнение 70 млн. п.н. хромосомы 19 человека со схожими последовательностями в геноме мыши выявило 12000 консервативных элементов, в том числе ранее не выявленные экзоны, целые гены, а также 4000 предполагаемых регуляторных элементов. Было также показано, что практически все гены хромосомы 19 человека, содержащиеся в геноме в виде единичных копий, имеют свои ортологи в геноме мыши и, кроме того, ортологичные гены сходно организованы в родственных геномах [Dehal et al., 2001]. В то же время, были найдены и примеры значительных структурных и регуляторных различий между генами-ортологами [Castresana et al., 2002], в том числе такие различия были показаны для генов, кодирующих факторы транскрипции с «цинковыми пальцами», обонятельные рецепторы, рецепторы феромонов, сериновые протеазы и др. Заметно различающиеся гены часто организованы в кластеры, нередко содержащие тандемные повторы, соответствующие отдельным доменам или цельным генам в составе кластера. Благодаря присутствию повторяющихся участков кластеры генов в процессе эволюции быстрее накапливают хромосомные перестройки, в том числе дупликации и делеции, что приводит к появлению крупных структурных отличий, возникающих в процессе расхождения эволюционных ветвей, ведущих к человеку и к мыши.
В декабре 2001 года были опубликованы первые данные сравнительного анализа двух полных геномов млекопитающих - мыши и человека [Asif et al., 2002]. Несмотря на то, что цитогенетический анализ позволил сделать заключение о многочисленных хромосомных перестройках, произошедших за это время и приведших к перетасовкам хромосомных фрагментов в составе геномов мыши и человека, сравнительный анализ этих геномов выявил 217 протяженных синтенных хромосомных участков (блоков синтении), покрывающих 90,2% генома человека и 93,3% генома мыши. Разница между двумя последними цифрами отчасти объясняется разницей в длине геномов -геном мыши на 14% короче генома человека [Asif et al., 2002]. Степень консервативности синтенных блоков заметно варьирует от хромосомы к хромосоме. Так, хромосома X представлена одним блоком синтении, человеческая хромосома 20 полностью соответствует части мышиной хромосомы 2, причем для всех частей хромосомы за исключением небольшого центрального сегмента сохранен порядок следования консервативных маркеров. Человеческая хромосома 17 также соответствует части хромосомы 11 мыши, однако в данном случае большое количество хромосомных перестроек привело к образованию 16 отдельных сегментов, изменивших свое расположение друг относительно друга. С учетом инверсий и перестановок хромосомных фрагментов в составе блоков синтении, эти блоки во многих случаях можно подразделить на более мелкие синтенные участки (сегменты), общим числом 342.
Интересные наблюдения были сделаны при сравнительном анализе нуклеотидного состава двух геномов. Так, по общему содержанию нуклеотидов G и С в геноме человек и мышь различаются несущественно (41% нуклеотидов G и С в составе генома человека и 42% - в геноме мыши). Однако, оказалось, что в геноме человека 1,4% «окон» размером 20 т.п.н. содержат более 56% нуклеотидов G и С, а 1,3% «окон» - менее 33% G и С, в то время как в геноме мыши «окна» с таким экстремально высоким и экстремально низким содержанием указанных нуклеотидов отсутствуют. Геном мыши содержит гораздо меньше CpG-островков, чем геном человека - 15500 против 27000, что напрямую связано с регуляцией.
Преимущества сравнительной геномики для выявления регуляторных последовательностей неоднократно показывались в разных теоретических и экспериментальных работах [Koop et al., 1994; Oeltjen et al., 1997; Lamerdin et al., 1995] Так было доказано, что эволюционно-консервативные последовательности, фланкирующие 1-й экзон гена ВТК, содержат регуляторные элементы, обуславливающие специфическую экспрессию этого гена [Oeltjen et al., 1997].
Наиболее показательным примером является крупномасштабный проект Genomatix (http://www.genomatix.de/), в котором были экспериментально выявлены с помощью микрочипов промоторные регионы всех на данный момент известных генов человека и мыши. Большая часть этих промоторных регионов (порядка 6 тысяч) была выявлена с помощью сравнительной генетики.
Транскрипционный фактор, кодируемый геном Oct4, экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках и половых клетках мышиных эмбрионов, но отсутствует в дифференцированных соматических клетках. Предпринятый анализ промоторной последовательности гена Oct4 выявил область минимального промотора, не содержащего ТАТА-box, и два возможных энхансера - дистальный и проксимальный, но не позволил однозначно судить о механизмах регуляции специфической экспрессии этого гена. Секвенирование 5 -области человеческого гомолога гена ОСТ4 и последующее сравнение соответствующих последовательностей у человека и мыши показало наличие в предполагаемых регуляторных последовательностях четырех консервативных участков (CR1-4) со степенью сходства 66% - 99%. При дальнейшем изучении этих участков, оказавшихся консервативными также и в геноме быка, в них были обнаружены сайты узнавания транскрипционных факторов Spl/Sp3 и элемент HRE (hormone responsive element) [Nordhoff et al., 2001].
Установление структуры гена мыши Щр2
Следующим этапом было выяснение структуры промотора и определение механизмов регуляции гена Rfp2 мыши. В случае сходства структуры промоторов генов-ортологов RFP2 у мыши и человека, мышь можно было бы использовать в качестве модельного организма для дальнейшего глубоко изучения регуляции гена RFP2, тем более что в результате более ранней работой выполненной в лаборатории анализа генома ИОГен РАН было показано, что спектр тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши является сходным.
На момент начала работы о структуре генома мыши в области RFP2 ничего не было известно. Мышиный гомолог Rfp2 расположен на 14-й хромосоме мыши в области, синтенной району 13ql4.3 человека. Ранее в нашей лаборатории на основе анализа базы данных dbEST была установлена in silico структура человеческого гомолога гена Rfp2 мыши [Baranova et al., 2003]. В результате были описаны три изоформы мРНК мышиного гена Rfp2 на основе перекрывающихся клонов кДНК АА499774, BF714458, ВВ575397, BG079221 и BF714459. Все они имеют высокую степень сходства с человеческим геном в кодирующей области. Компьютерный анализ показал, что аминокислотные последовательности продуктов человеческого и мышиного генов имеют одинаковую длину и содержат 86% идентичных позиций и всего 8% неэквивалентных замен. В то же время, 5 -нетранслируемые области мышиных изоформ составленных in silico не были гомологичны человеческим последовательностям, имеющимися в базах данных GenBank и dbEST.
Первым этапом этой части работы было экспериментальное доказательство существования выявленных in silico изоформ РНК мышиного ортолога гена Rfp2. Для этого мы провели ПНР на продуктах обратной транскрипцией на тотальной РНК мыши (ОТ-ПЦР) на праймерах указанных в таблице 4.
Результаты этого эксперимента приведены на рис.П. Полученные амлификаты были заклонированы в вектор pGEMT-easy, и затем были определены их нуклеотидные последовательности. Таким образом, нам удалось подтвердить существование двух изоформ мРНК у этого гена -IF1 и IF2. Обе эти изоформы в своей 5 нетранслируемой части имеют два альтернативных первых экзона и один общий второй.
Следующим этапом было проведение компьютерного анализа областей перед двумя первыми экзонами гена RFP2 мыши. Анализ нуклеотидных последовательностей показал среднее содержание GC нуклеотидов в промоторной области - около 60%. Нами было выявлено два регуляторных элемента перед экзоном 1а: ТАТА-бокс за 23 п.н. от точки инициации транскрипции (CTTTTTATAGC) и GC-бокс за 158 п.н. (TGGGTGGCCC). В непосредственной близости от второго экзона каких-либо регуляторных элементов обнаружено не было. Анализ плотности распределения сайтов посадки транскрипционных факторов также не выявил дисбаланса между двумя цепями ДНК.
На момент начала работы о структуре генома мыши в области Rfp2 ничего не было известно, она появилась в ходе данной работы в 2002 [Emes R.D. et al., 2003]. Проведенное нами сравнение генома человека и мыши в области гена RFP2 показал, что в этом районе проходит граница синтении, расположенная перед кодирующим экзоном. Таким образом, оказалось, что область промотора и первых двух экзонов гена RFP2 у человека и мыши не имеет протяженных областей гомологии.
В то же время важно отметить, что спектр тканеспецифичности экспрессии этого гена у человека и мыши остается сходным [Baranova et al., 2003]. Из этого следовало, что при сравнении промоторных областей гена RFP2 у человека и мыши могут быть обнаружены одинаковые регуляторные элементы.
Мы провели сравнительный анализ особенностей промоторных областей гена RFP2 у мыши и человека с целью выявления общих и различных регуляторных элементов:
Промоторная область гена RFP2 человека имеет очень высокий GC-состав - 72% по сравнению с мышиным гомологом 60%. Также в промоторной области гена RFP2 человека локализована область с повторами типа GnA, способными образовывать такие сложные вторичные структуры как квадруплексы, играющие роль в регуляции транскрипции. 2) Регуляторные элементы Как уже было выше сказано, в промоторной области гена RFP2 человека не было обнаружено ТАТА-бокса, но найдено два GC-бокса. У мышиного гомолога перед экзоном изоформы ГРІ были обнаружены и ТАТА-бокс и GC-бокс. 3) Характер распределения транскрипционных факторов в промоторной области У гена RFP2 человека выявлен дисбаланс плотности распределения сайтов посадки транскрипционных факторов между комплементарными цепями ДНК, и определены семейства факторов вносящих основной вклад в это распределение - IKAROS, SP1, CETS1P54. У гена Rfp2 мыши наблюдалось равномерное распределение плотностей сайтов посадки транскрипционных факторов. 4) Альтернативный сплайсинг 5 -нетранслируемых частей У гена RFP2 человека зарегистрировано три изоформы образующихся в результате альтернативного сплайсинга первых двух нетранслируемых экзонов. Мышиный гомолог данного гена кодирует две изоформы мРНК, IF1 и ГБ2, каждая из которых имеет свой промотор. 5) Антисенс регуляция Антисенс-транскрипт к гену RFP2 человека был клонирован ранее в лаборатории анализа генома ИОГен РАН. Для гомолога мыши Rfp2 антисенс транскрипта обнаружено не было. Как видно, ген RFP2 человека имеет очень сложную и абсолютно не похожую регуляцию по сравнению с мышиным ортологом. Использование мыши в качестве модельного организма для исследования регуляции гена RFP2 не является обоснованным.
