Введение к работе
Актуальность проблемы
Отличительной особенностью эукариотического генома является большое количество различных типов диспергированных и тандемно организованных повторяющихся последовательностей ДНК. Многие из этих повторов являются источниками различных полиморфизмов и используются в качестве генетических маркеров в популяционных и эволюционных исследованиях (Рысков, 1999). Функциональная роль большинства повторов остается неясной, хотя и предполагается, что некоторые из них могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии, например, путем участия в специфической организации хроматина (Трифонов, 2002). Встает вопрос, не играют ли эти последовательности определенную роль в спецификации клеток, в клеточной дифференцировке.
Очевидно, эксперименты в рамках этой концепции направлены на выявление геномных различий между специализированными клетками и их предшественниками. В биологических системах описано такое явление, как соматический мозаицизм, что означает присутствие в одном организме генетически различных популяций соматических клеток. Структурные изменения в ДНК злокачественно трансформированных клеток - наиболее известный пример соматического мозаицизма (Ionov et al., 1993). Его причинами могут служить как генетические, так эпигенетические события (Vikki et al., 2001). Причиной соматического мозаицизма могут быть потеря гетерозиготности путем митотической рекомбинации, хромосомная нестабильность, изменения в микросателлитных локусах (Cavenee et al., 1983; Lengauer et al., 1998). В то же время, имеется очень мало данных о соматическом мозаицизме в нормальных тканях.
Таким образом, актуальным является выявление возможных различий в строении ДНК разных органов и тканей на уровне индивидуального организма.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является изучение феномена соматического мозаицизма в нормальных органах и тканях млекопитающих с помощью методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD-PCR) и мультилокусного ДНК-фингерпринтинга.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Разработать варианты RAPD-анализа для получения информативных амплификационных спектров ДНК органов и тканей человека и мыши.
-
Исследовать ДНК, выделенную из органов и тканей эмбрионов человека, методами ДНК-фингерпринтинга и RAPD-PCR с целью выявления соматического мозаицизма на уровне индивидуального организма.
-
Исследовать ДНК органов и тканей взрослых мышей методом RAPD-PCR с целью выявления соматического мозаицизма у индивидов разных линий.
-
Оценить наблюдаемые эффекты геномных изменений на модели длительно пассируемых клеточных культур с помощью RAPD-анализа.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые обнаружена соматическая изменчивость ДНК в нормальных тканях эмбрионов человека и мыши методами RAPD-PCR и ДНК-фингерпринтинга. Показано, что возникновение соматического мозаицизма происходит с довольно высокой частотой и носит случайный характер.
Впервые показана измечивость PARD-спектров клеточных культур при длительном пассировании (мезенхимные прогениторные клетки костного мозга человека, стромальные клетки жировой ткани человека, клетки фибробластов человека).
Эти результаты имеют фундаментальный характер и вносят важный вклад в изучение проблемы соматического мутагенеза.
Практическая значимость результатов связана с разработкой эффективного варианта RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека и выявления генетических изменений при их длительном пассировании (Заявка на патент «Способ паспортизации и контроля за генетической изменчивостью в клеточных культурах различной длительности пассирования» No 2008114535/13 (016031) от 16 апреля 2008 года).
Метод может найти применение в медицине для изучения клеточных аномалий (в том числе онкологических), контроля генетической стабильности клеточных культур, используемых в качестве источника материала для клеточной терапии и регенерации тканей, а также паспортизации клеточных линий с целью их юридического правообладания.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: 11-th PhD meeting in evolutionary Biology. Bordeaux. France. 2005; IV International conference Molecular genetics of somatic cells. Zvenigorod. Russia, 2005; 12-th PhD meeting in evolutionary Biology. St.Andrews. Skotland. 2006; 13-th meeting in evolutionary Biology. Lund. Sweden. 2007.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК - 2, заявка на патент - 1, тезисов докладов и материалов конференций - 3.
Структура и объем работы
