Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1. Двуспиральные структуры в составе ядерной про-мРНК 13
2. Мобильные диспергированные гены 16
3. Отличные от ЩГ протяженные повторяю щиеся элементы в геноме дрозофилы 21
4. Короткие рассеянные по геному млеко питающих повторы 27
5. Эндогенные ретровирусы 34
2 Материалы и методы 43
1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирования 43
2. Выделение тотальной РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха 43
3. Выделение ядерной и цитоплазматической РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха 44
4. Ввделение ядерной и цитоплазматической РНК из клеток печени и опухоли МОРС 21 45
5. Выделение поли(А)+рнК из различных препаратов РНК 45
6. Введение метки в РНК 45
7. Электрофорез РНК в агарозных гелях 47
8. Выделение ДНК из клеток печени мыши 49
9. Элгация фрагментов ДНК из гелей 50
10. Выделение плазмид. 51
11. Клонирование Фрагментов ДНК мыши в плазмиде pBZ322 53
12. Анализ клонированных последовательностей 56
13. Клонирование фрагментов ДНК мыши в бактериофаге % 47.1 57
14. Введение метки в ДНК 60
15. Рестрикционный анализ ДНК 61
16. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных и акриламидных гелях 61
17. Деление цепей ДНК 63
18. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозннх фильтрах 63
19. Гибридизация иммобилизованных на нитроцеллюлозе нуклеиновых кислот с меченными пробами 64
20. Гибридизация иммобилизованной на ДБМ-бумаге РНК с меченными пробами ДНК 64
21. Определение первичной структуры ДНК 65
3 Результаты 69
1. Клонирование последовательностей ДНК мыши, гомологичных дсРНК-А 69
2. Природа последовательности AI и ее структурная организация 74
3. Природа последовательности А2 и ее структурная организация 78
4. Транскрипция элементов AI и А2 86
4 Обсуждение результатов 93
1. Структура ж транскрипция AI 93
2. Структура ж транскрипция А2 97
Выводы 104
- Мобильные диспергированные гены
- Выделение тотальной РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха
- Введение метки в ДНК
- Природа последовательности А2 и ее структурная организация
Введение к работе
Одной из основных задач молекулярной биологии является изучение структуры и функций генома эукариотических клеток. Относительно мало изученной оставалась до последнего времени роль в организации структуры и работы генома эукариотов повторяющихся последовательностей и особенно тех из них, которые относятся к классу разбросанных по геному повторов. Последовательности этого класса повторяются в геноме эукариотов до нескольких десятков и даже сотен тысяч раз и активно транскрибируются.
Во второй половине 70-х годов в лабораториях Хогнесса и Георгиева независимо были проклонированы последовательности генома дрозофилы, относящиеся к классу умеренно повторяющихся последовательностей. Оказалось, что эти активно транскрибирующиеся элементы, имеющие длину в несколько тысяч пар оснований и разбросанные по геному, обладают рядом свойств, сходных со свойствами бактериальных транспозонов. Эти элементы генома дрозофилы были названы мобильными диспергированн-ными генами (МдТ). Они ограничены прямыми повторами длиной в несколько сотен пар оснований, так называемыми длинными концевыми повторами (ДЖ). ДКЇЇ содержат ряд функционально значимых последовательностей, таких, как сигналы полиаденили-рования, инициации и терминации транскрипции и др. Хотя функции ВДГ пока неизвестны, им приписывают важную роль в регуляции работы других генов. Эта регуляция может осуществляться как путем включения транскрипции генов засчет сигнальных последовательностей, содержащихся в ДКП МДТ» так и путем инактивации промоторных последовательностей генов интегрировавшим в них МдТ.
Несмотря на то, что в последнее время мобильные элементы активно изучаются в различных лабораториях мира, мало что известно до сих пор о мобильных элементах генома млекопитающих. Весьма актуальным представлялся поэтому поиск подобных элементов в геноме мыши.
Мобильные диспергированные гены дрозофилы были проклони-рованы благодаря тому, что они активно транскрибируются в культуре клеток. Поэтому меченая поли(А)" ШК служила хорошим зондом для "вылавливания" МдТ из библиотеки генов дрозофилы. Подобный прием не работает в случае млекопитающих, поскольку, в отличие от дрозофилы, в их геноме содержится огромное количество коротких активно транскрибирующихся повторов. Поэтому для выделения из банка фрагментов геномной ДНК мыши мобильных элементов мы использовали другой подход.
В лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии АН СССР в 1973 г. были открыты длинные двуспиральные структуры в составе ядерной РНК мыши. Было показано, что эти двуспиральные РНК (дсРНК) могут быть фракционированы по длине на два класса: А (длинные) и В (короткие). Оба эти класса дсРНК гомологичны повторяющимся после -довательностям, причем БЫЛО продемонстрировано, что цепи дсРНК-В транскрибируются с коротких повторяющихся элементов генома. Позже было обнаружено, что из клеток дрозофилы также может быть выделена дсРНК, однако она представлена только молекулами класса А. Оказалось, что эта дсРНК гомологична ЩГ дрозофилы. Основываясь на этом мы поставили задачу проклонировать ВДГ-подобные элементы из генома мыши, используя в качестве зонда мышиную дсРНК-А. В работе были получены клоны, содержавшие два вида таких последовательностей, названных нами AI и А2. С помощью этих клонов были изучены некоторые особенности структуры и транскрипции выделенных элементов.
Мобильные диспергированные гены
Мобильные диспергированные гены, впервые описанные у ). ії&Ісигодл&Ь&ґt имеют размер 5,8 тыс.п.н., повторяются от 10 до 100 раз в геноме и рассеяны по всем хромосомам дрозофилы /7/. Эти последовательности имеют варьирующую локализацию в геноме разных линии дрозофил /І/. МДТ активно транскрибируются, по крайней мере в культуре клеток. Число обнаруженных семейств МДТ приближается уже к двум десяткам и, следовательно, общее число таких элементов в геноме достигает Ъ% от всего генетического аппарата /3/. Все известные ВДГ очень сходны между собой, поэтому рассмотрим их свойства на примере хорошо изученного МДГІ. Семейство ВДП представлено 20-30 копиями, рассеянными по геному ф. melanaQctsizr. Рестриктазные карты всех копий сходны, что выявляется при гибридизации меченых фрагментов ВДГІ с перенесенной на нитроцеллюлозный фильтр рестриктиро-ванной геномной ДНК. Длина этих генов составляет 7,2 тнс.п.н., на концах находятся длинные повторы (440 п.н. каждый)/8,13/. В клетках культуры дрозофилы до 2% всей поли(А)" ТНК синтезируется на матрице ВДП /8,16/. При этом, однако, надо учесть, что число копий ВДП в геноме культивируемых клеток в 6-8 раз выше, чем в геноме мухи /8/. Главным продуктом транскрипции является полноразмерная копия одной из цепей ДНК. Наряду с ней в составе поли(А)+РНК цитоплазмы присутствуют и более короткие цепи, образующиеся, по-видимому, при сплайсинге первичного транскрипта /9/. Начало и конец главного транскрипта локализуется в пределах ДШ. Интересной особенностью транскрипции МДТІ является присутствие в составе ядерной и цитоплазматической поли(А)" РНК последовательностей, комплементарных обеим цепям ДНК /16/. Если выделить из клеток дрозофилы двухспиральную РНК и гибридизовать ее с ВДГС, то окажется, что такая РНК гибридизуется со всеми фрагментами элемента. Кроме того она одинаково гибридизуется с разделенными цепями ДНК этих генов. Можно сделать вывод, что транскрипция МдП носит симметричный характер. Надо, однако, подчеркнуть, что количество главного транскрипта примерно в 20 раз превышает количество дополнительного /16/. Частично симметричная транскрипция является характерным свойством МДТ, которым не обладают обычные однокопийные гены. Важную роль в функционировании МДГ играют длинные концевые повторы..Анализ нуклеотидной последовательности ДКП показал, что в составе одного элемента левый и правый концевые повторы являются точными копиями друг друга /20/. ДКП разных представителей одного семейства могут несколько отличаться за счет замен отдельных оснований и небольших инсерций и делеций.
В начале и конце каждого ДКП имеются несовершенные обращенные повторы. Сразу перед левым и после правого ДШ обнаруживаются короткие прямые повторы, образующиеся путем дупликации последовательности-мишени в месте внедрения ВДГ /13/. В составе обеих цепей ДЖ ВДГ обнаружены последовательности, могущие служить сигналами инициации транскрипции (ТАТА-блоки) и полиаденилирования транскрипта (ААТААА-последова-тельность) /13/. Более совершенные, "канонические" сигналы выявляются в цепи, кодирующей минорный, а не главный, транскрипт. Структура ДКП мобильных диспергированных генов очень похожа на структуру ДКП ретровирусов (см. главу 5). Длинные концевые повторы обнаруженного недавно нового ВДГ дрозофилы, названного ВДГІ7.6, имеют 60$ гомологию с ДКП ретровируса птиц l\L v /106/. Авторам этой работы удалось выделить из клеток дрозофилы вирусоподобные частицы, содержавшие РНК размером 5 тыс. нуклеотидов. При трансляции Щ Vliro эта РНК направляла синтез белков, обнаруживаемых в выделенных частицах. С частицами была связана также ревер-тазная активность. Генами для РНК этих частиц являются, по-видимому, некоторые ВДГ и, в частности, МДТІ7.6. Скорее всего, ВДГ дрозофилы и ретровирусы птиц и млекопитающих имеют одну и ту же природу /60,62/. Для ретрови-русов хорошо изучен механизм интеграции. Вирусная РНК считы-вается обратной транскриптазой и образующаяся кольцевая молекула двухцепочечной ДНК встраивается в геном хозяина. Затравкой для (-) цепи ДНК служит одна из т-РНК, комплементарная участку ДНК провируса у границы с ДШ. Для инициации (+ ) цепи важен полипуриновый блок, расположенный у границы с другим ДШ /70,114/. Аналогичные элементы обнаружены и в составе ВДГІ/ІЗ/ и ВДГ2 /160/. Такая аналогия вряд ли случайна, и ее наличие позволяет предположить, что по крайней мере для ВДЕТ и ВДГ2 репликация и инсерция осуществляются способом, аналогичным тому, который имеет место у ретровирусов, т.е. через обратную транскрипцию. Как известно, при инфекции ретровирусами удается выявить в клетках кольцевые вирусные ДНК, являющиеся промежуточными продуктами размножения вирусов /70/. Аналогичные кольцевые молекулы, содержащие ВДГ COplcL, были обнаружены в клетках культуры дрозофилы /61/. Показано, что они интенсивно гибридизуются с ядерными и цитоплазматическими поли(А)-содержащими РНК, являющимися транскриптами с МЖ /152/. Аналогичные ВДГ дрозофилы элементы были обнаружены и в геноме других видов эукариот. Здесь мы остановимся на мобильном элементе дрожжей Туї /32/. Длина этой последовательности составляет 5,9 тыс.п.н. и на своих концах она несет длинные концевые повторы, обозначенные как С -элементы. Длина о -элементов - 340 пар оснований. На гаплоидный набор хромосом дрожжей приходится около 35 копий Туї. Число 0 -последовательностей намного выше. Наряду с О , входящими в состав Туї, встречаются и одиночные, не связанные с Туї последовательности /32/. Использование моноклональных линии дрожжей позволило показать относительно высокую частоту перемещений Туї в геноме. Туї является главным, и,возможно, единственным МдТ-элементом дрожжей. Большинство его копий идентичны по длине и сайтам рестрикции, однако, были найдены копии, имевшие вставки или делеции внутри тела ВДГ /94/. о -последовательности были просеквенированы. Оказалось, что в пределах одной копии Туї они являются совершенными повторами. По их краям снаружи от элемента располагается короткая дупликация последовательности хозяйской ДНК, длиной 5 нуклеотидов. Палиндромы по краям 0 -последовательности редуцированы до двух нуклеотидов /64,58/. В обеих цепях о -последовательности обнаруживаются сигналы инициации транскрипции, а в одной из цепей - последовательность, являющаяся сигналом для полиаденилирования транскрипта /64/. С Туї считываются два вида полиаденилированных РНК размером 5,7 и 5,1 тысяч нуклеотидов, причем промоторы и терминаторы для них лежат в О -последовательности /52/. В области стыка О -элемента с телом ВДГ обнаружена последовательность, комплементарная 3 -концевой части одной из тРНК /51/. Вся совокупность приведенных данных говорит в пользу того, что Туї имеет ту же природу, что и мобильные диспергированные гены дрозофилы.
Выделение тотальной РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха
Для выделения тотальной РНК из клеток асцитной карциномы Эрлиха брали около 20 мл асцитной жидкости (3-4 мыши); клетки осаждали при 2,5 тыс. Q, на центрифуге К-23 при 4С, 10 мин. Севшие клетки тщательно суспендировали в 60 мл 0,05 М ацетата натрия, рН 5,0, после чего добавляли $SbS до 1%, перемешивали и оставляли на 20 сек. во льду. Весь лизат приливали к 60 мл предварительно нагретого до 65С фенола, насыщенного ацетатом натрия, рН 5,0, тщательно трясли 3 мин. в водяной бане при 65с, после чего резко охлаждали в бане со льдом. Экстракт центрифугировали 10 мин. при 5000 а на К-23, супернатант отбирали и проводили с ним еще две экстракции горячим фенолом. После третьей экстракции к супернатанту добавляли ацетат натрия рН 6,8, до конечной концентрации 100 мМ и осаждали РНК спиртом. 3. Выделение ядерной и дитоплазматической РНК из клеток асдитной кашиномы Эрлиха. Для выделения отдельно цитоплазматической и ядерной РНК клетки после центрифугирования асцитной жидкости промывали 30 мл буфера, содержащего 0,25 М сахарозы, 0,1 М р/а С/ , 5 мМ JMfr и 10 iMlrk HCfc) рН 8,0 и предварительно обработанного ДШК (ДЕПК добавляется к буферу до концентрации 0,3$, после чего буфер помещается на 5 мин. в кипящую водяную баню). Затем клетки суспендировали в 30 мл того же буфера, содержащего 100 мкг/мл гепарина и добавляли еще 30 мл буфера с 1% fJP -40, после чего инкубировали 5 мин. во льду. Центрифугировали суспензию 5 мин. при 4С , 4000 в . Супернатант, содержащий цитоплазматическую РНК сливали в колбу с 60 мл смеси равных объемов фенола, насыщенного Tri& Hfll} РН 8,0 и хлороформа с 0,5$ S&S и 10 мМ &ГА и проводили 3 депротеинизации, после чего осаждали цитоплазматическую РНК спиртом. Осадок, содержащий клеточные ядра суспендировали в 60 мл 0,1 М ацетата натрия;рН 5,0, содержащего 100 мкг/мл гепарина, добавляли 2 7$ до 5 мМ и S0S до 0,5$, инкубировали 30 сек. при 0С и вливали в нагретый до 65С фенол, насыщенный ацетатом натрия, рН 5,0. Затем проводили 3 экстракции горячим фенолом, как описано выше, и осаждали ядерную РНК спиртом. 4. Выделение ядерной и дитоплазматической РНК из клеток печени и опухоли МОРС 21. Для выделения ядерной и дитоплазматической РНК из твердых тканей (печень и опухоль МОРС 21) 5-6 г клеток гомогенизировали в буфере (такой же, как и для выделения РНК из асцитной жидкости), содержащем 200 мкг/мл гепарина при помощи гомогенизатора Фси0еп&. Суспензию центрифугировали при 4000 а ,10 мин., 4С. Разделяли супернатант, содержащий цитоплазматическую РНК и осадок, содержащий ядра. Ядра еще раз промывали тем же буфером. После этого выделяли ядерную и цитоплазматическую РНК как описано выше. 5. Выделение поли(А)+РНК из различных препаратов РНК. Для выделения поли(А)+ фракции РНК использовали хроматографию на колонке с поли (Us) сефарозой. РНК суспендировали в 10 мл буфера УГ75 (100 мМ tfaXl , I мМ ЖЛ , 20 мМ Vtis H№ » рН 7,6 и 2$ Ж) и пропускали через колонку с 0,4 мл поли(&) сефарозы.
Затем промывали колонку 20-30 мл fJCTS . Связавшуюся с поли( ) сефарозой поли(А)-содержащую РНК снимали в 2 мл 0,2$ tf)S , нагревая колонку до 50С. 6. Введение метки в РНК. Для включения метки в РНК использовали два метода: меченье й /32Р/-АТР и полинуклеотидкиназой /69/, либо ме- ченье f/&r J /135/. Для меченья полинуклеотидкиназой и 32 Р-ортофосфатом сначала гидролизовали 5-25 мкг РНК, инкубируя при 90С, 7-Ю мин. в 90 мкл буфера, содержащего 5 мМ глип -ина, 0,01 М #ЯУ1 , 0,1 мМ спермидина, рН 9,5. Затем эту смесь добавляли к упаренному досуха на роторном испарителе I мкМ XV %У-АТР (трифосфат должен быть взят в избытке по отношению к 5 -концам) К смеси добавляли 10 мкл буфера, содержащего 100 мМ МА&Ч 50 Дитяотриэтола и 500 мМ "Jns , рН 9,5, затем Т4 полинуклеотидкиназу до конечной концентрации 2 ед/ 100 мкл и инкубировали 30 мин. при 37С. После этого очищали препарат от невключившейся метки пропусканием через колонку со смолой Bio - &е Р6 {В& JfacL ) и переосаждали спиртом. Меченье с помощью Mt У применяли для введения метки в дсРНК-А. Для этого смешивали 2 мкл Уаг У , содержавших I md метки с 2 мкл 0,3 мМ раствора fJ SO- в в 0,1 М ацетате натрия, рН 4,1, и инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. После этого к смеси добавляли раствор, содержавший 4 мкл 5 мМ "T&vL в 0,1 М ацетате натрия, рН 4,1 и 4 мкл водного раствора предварительно денатурированной нагреванием дсРНК-А (количество дсРНК - 2-3 мкг). Смесь перемешивали и инкубировали 6 мин. при 800 после этого разбавляли буфером, содержавшим 100 мМ fJuXL , І мМ ШЯ , 5 Ж ТГ& ЖІЄ. , рН 8,0 и 0,1% S&& (А/73) в 10 раз и инкубировали при 0С,Ю мин., после чего пропускали через колонку с сефадексом б -50, уравновешенном Собирали пик меченой РНК и инкубировали 30 минут при 60С, затем добавляли транспортную РНК до концентрации 20 мкг/мл и осаждали спиртом. После формирования осадка его собирали центрифугированием при 5000 о. , 15 минут, 0С, растворяли в воде и пропускали через нжтроцеллюлозные фильтры (НА 0,45, ЦііІлроі - )» после чего снова осаждали спиртом. 7. Электрофорез РНК в агарозном геле. Для изучения РНК использовали либо электрофорез в кислом буфере с мочевиной с последующим переносом РНК на (ДБМ)-бумагу /18/, либо электрофорез в присутствии формальдегида с последующим переносом РНК на нитроцеллюлозу /136/. 7.1. Электрофорез РНК в кислом буфере и перенос на ДБМ-бумагу. Готовили 100 мл геля, содержащего Ъ,Ь% агарозу, 7 М мочевину и 25 мМ цитрата натрия, рН 3,5. Для этого расплавляли 1,5 г агарозы в 60 мл воды, добавляли 42 г сухой мочевины и охлаждали колбу в холодной воде. После этого добавляли 2,5 мл І М цитрата , рН 3,5. Заливали раствор в охлажденный форезный прибор и оставляли на ночь при 4С. Пробы РНК растворяли в формамиде, содержавшем 7 М мочевину и бромфенол, прогревали 3-5 минут при 60С и наносили на форез. Электрофорез вели в 25 мМ цитратном буфере рН 3,5, 2,5-3 часа при напряжении 150 вольт. После этого отмывали гель от мочевины 0,1 М ацетатом аммония, рН 6,0, в течение 40 минут, окрашивали бромидом этидия и фотографировали. Затем отмывали гель І мас в воде от этидия, помещая сначала в 0,05 М р/аОН- на 40 минут (2 раза), а затем в І М ацетат натрия, рН 4,2 на 20 минут (2 раза). После этого проводили перенос при 4С на заранее приготов- ленную ДБМ-бумагу в І М ацетате натрия, рН 4,2. 7.2. Приготовление ДБМ-бумаги. Для приготовления ДБМ-бумаги брали лист бумаги wha,vinatU-54Q размером 14 см X 25 см и смачивали его 10 мл водного раствора пиридиниумхлорида и ацетата натрия (0,8 г пиридиниумхлорида и 0,25 г ацетата натрия доводили водой до объема 10 мл), удаляли пузыри, подсушивали при 60С, а затем сушили 30 минут при 135С. После этого промывали бумагу 2 раза по 20 минут водой и 2 раза по 20 минут ацетоном. Затем помещали лист в 20$ раствор дитионита и держали 30 минут при 65С под тягой. Дальнейшие операции, включая и перенос РНК проводили при 4С. Отмывали бумагу 20 мин. в воде, 20 мин. в 30$ уксусной кислоте, и снова 20 мин. в воде, после чего на бумагу наливали смесь 12 мл HCI, 3,2 мл свежего fJajlOz (концентрация 10 мг/мл), 106,8 мл воды и оставляли на 30 мин. Отмывали бумагу водой 5-6 раз по 5 минут, замачивали в I М ацетате натрия, рН 4,2 и использовали для переноса РНК. Перенос проводили в I М ацетате натрия, рН 4,2, 10-12 часов при 4С, после чего бумагу использовали для гибридизанионных опытов.
Введение метки в ДНК
ДНК метили in Viiro методом "переноса бреши" /137/. Рестрикционная смесь объемом 20 мкл содержала 0,1-0,2 мкг ДНК, 2 мкл 10-кратного буфера (500 мМ frk HCI, рН 7,4, 100 мМ MfSO , І мМ дитиотриэтола, 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина), 100 пикомолей /с6-32Р/ с/и/ГР и по одному наномолю каждого из остальных трифосфатов. К смеси добавляли ДНКазу I до концентрации 10 мкг/мл, после чего прибавляли 5 единиц фермента ДНК-полимеразы I .со1 и инкубировали I час при 15С. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,5 М &ГАж пропускали через колонку с сефадексом вг -50 для очистки от невключившихся трифосфатов. 14.2. Концевое мечение ДНК с помощью ревертазы. Мечение /3 а ьН1-сайта (выступающий 5 -конец) проводили путем матричной достройки сайта непосредственно после обработки 5-Ю мкг ДНК рестрикционной эвдонуклеазой ВальШ.. Рестрикционную смесь прогревали 5 мин. при 65С для инактивации фермента, добавляли 30 микрокюри /32Р/- сІ&ГР , 5-Ю ед. ревертазы и инкубировали I час при 37С. После этого добавляли немеченые d&TP , dJTP , J.LTP и J.TTP до концентрации 25 микромолей, еще 5 ед ревертазы и инкубировали еще 15 мин., 37С. Затем препарат прогревали 5 мин., 65С, обрабатывали другой эндонуклеазой ( Hmf I» со№ или ЦцА Ш), наносили на агарозный или акриламидный гель и проводили электрофоретическое разделение и очистку меченых фрагментов. 15. Рестрикционный анализ ДНК. Рестрикционный анализ ДЕК проводили при помощи рестрик-ционных эндонуклеаз, полученных от В.Енулайтиса (Вильнюс). Реакции вели в буфере, содержащем I мМ дитиотриэтола, 10 мМ JjUC2 10 т Т НС1 Рн 7 5» 50 ш Ж - 16. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных и акриламидных гелях. Электрофорез ДНК проводили в агарозных и акриламидных гелях.3,5$ и Ъ% акриламидные гели применяли при анализе мелких фрагментов ДНК. Для приготовления геля использовался маточный раствор 30$ акриламида, содержавший на 100 мл раствора 29 г акриламида и I г fJ hl -метиленбисакриламида. На 100 мл геля брали 11,6 (для 3,5$ геля) или 16,6 (для 5% геля) мл 30$ акриламида, 2,1 мл 3% раствора персульфата аммония, 10 мл 10-кратного форезного буфера TEE (однократный TEE содержит 0,089 М трисбората и 0,089 М борной кислоты) и 76,3 (для 3,5$ геля) или 71,3 (для Ъ% геля) миллилитров воды. К смеси добавляли 30 мкл ТЕМЩ {fJflJflfN -тетраметилэтилендиамин) и заливали в форезный прибор.
После того, как гель заполимеризовался, проводили префорез в течение 2-3 часов при 150-200 в. Затем наносили пробы и вели форез 10-12 часов при 50-100 в , после чего красили гели бромидом этидия и фотографировали. Агарозные гели различной плотности (от 0,4$ до 3,5$) использовали при анализе крупных фрагментов ДНК (от 200 п.о. до нескольких тыс. п.н.), которые в дальнейшем надо было переносить на нитроцеллюлозу. Обычно гели приготовляли на трисфосфатном (0,08Мтрис-фосфата и 0,008 М 8ЯЯ А ) или на трисацетатном (0,04 М трисацетата и 0,002 М Ф7# ) буферах. Форез вели ночь при напряжении 30-60 в. 16. Перенос фрагментов ДНК из агарозы на нитро-целлюлозные фильтры. Для переноса фрагментов ДНК из агарозных гелей на нит-роцеллюлозные фильтры использовали процедуру Саузерна /151/. После окончания фореза гели красили бромидом этидия, фотографировали и помещали в ванну с 1,5 М ttcUZ , 0,2 н hhOft на один час. Затем гель промывали водой и помещали в раствор I М 7rts HCI, рН 7,6, 1,5 М ЫЛСЛ З.о. один час, после чего промывали водой и помещали в раствор I0 SC (1,5 М fJttXL 0,15 М цитрата fJcL , рН 7,5). Для переноса использовали нитроцеллюлозные фильтры JUMjbofc- НА 0,22 и НА 0,45. Перенос проводили в 10 SSC 10-12 часов при комнатной температуре. После переноса фильтр промывали в 2 SSt подсушивали на воздухе и помещали в вакуумный шкаф на 2 часа, 80С. Для разделения цепей фрагментов ДНК в агарозном геле мы использовали методику, разработанную Гольдбах с сотрудниками /71/. Сополимер поли(&,6-) ((6:6-= 1,0:1,3 , Mi&s Led. ) фрагментировали в свежем 0,05 М hfa CO 24 мин. при 80С, затем нейтрализовали раствор добавлением равных объемов 80 мМ 7/& НС1, рН 7,6 и 0,05 н HCI. После этого переосаждали поли( Ц6-) спиртом и растворяли в 10 мМ JriS HCI, рН 7,6, I мМ #7Й в концентрации 500 мкг/мл. 0,5-1,0 мкг ДЖ, размером 800-8000 п.о., смешивали с 5-Ю мкг дробленого сополимера поли( $ ) (соотношение поли(Ц6-):ДНК обычно составляло 8-10:1) и прогревали 3 мин, при 90С, после чего резко охлаждали во льду, добавляли краску и наносили на 1% агарозный гель. Форез вели ночь в трис-ацетатном буфере при 4С. перенос на нитроцеллюлоз-ный фильтр осуществляли обычным способом. 18. Иммобилизация ДНК на ниттюпеллюлозных Фильтрах.
Для некоторых опытов нужно было иметь большие количества (до 100 мкг) иммобилизованной на нитроцеллюлозных фильтрах ДНК. Дяя этого к раствору, содержащему 100 мкг ДНК в 500 мкл добавляли /JODIIRO концентрации 0,5 н, помещали на 3 мин. ,Ю0С, затем добавляли 7 мл I М КН2Р04, после чего раствор пропускали через фильтр НА 0,45. После этого фильтр промывали AXSSC , высушивали и прогревали при 80С, 2 часа в вакуумном шкафу. 19. Гибридизация иммобилизованных на нитроцеллю лозе нуклеиновых кислот с мечеными пробами. Нитроцеллгалозные фильтры с посаженной на них РНК или ДНК инкубировали при 42С 6-14 часов в растворе, содержавшем 50$ формамид, 5xSSC , 2-кратный раствор Денхардта (1-кратный раствор Денхардта содержит 0,02$ фикола, 0,02$ поливинилпирролидона и 0,02$ бычьего сывороточного альбумина) , 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 7,0, 0,02$ S&S, 200 мкг/мл денатурированной дробленной ДНК спермы лосося. После этого фильтры подсушивали на воздухе и помещали в такой же раствор, но содержавший меченую радиоактивным фосфором пробу (РНК или ДНК). Гибридизацию проводили от 12 часов (если на фильтрах была иммобилизована ДНК) до 48 часов (если иммобилизована РНК) при 42С. 20. Гибридизация иммобилизованной на ДБМ-бумаге РНК с меченными пробами ИНК. 20.1. ДБМ-бумагу с иммобилизованной РНК инкубировали 12 часов при 37С в том же, что и нитроцеллюлозу буфере, но содержавшем 1,5 мг/мл ДНК лосося и 1% глицин. Гибридизацию проводили в таком же буфере, но без глицина, 48 часов при 37с. 20.2. Отмывка фильтров от несвязавшейся метки. Фильтры отмывали от несвязавшейся метки сначала 5 раз по 5 мин. в 2-SSC с 0,1% 5 S при комнатной температуре, затем 2 раза по I часу в 0,I SSC с 0,3$ SbS при 42С. После этого фильтры тщательно сушили и закладывали на экспозицию с рентгеновской пленкой РМ и усиливающим экраном ЭУ-ВЗ. 20.3. Полная отмывка фильтров для повторных гибридизаций. Иногда фильтры использовали для повторных гибридизаций. В этих случаях сгибридизовавшуюся меченую РНК или ДНК удаляли прогреванием фильтров либо 2 раза по 2 мин. в 0,01 S5C при і90С (для нитроцеллкшозных фильтров) либо 2 раза по 2 мин. в 7 М мочевине с I мМ Х) ПА при 85С (для ДБМ-бумаги). 21. Определение первичной СТРУКТУРЫ ДНК. Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК проводили по методу Максама и Гилберта /120/ в модификации Добрынина и соавт. /47/. 21.I. Специфическая химическая модификация меченых фрагментов ДНК. Бессолевой раствор меченной по одному из концов ДНК с активностью 5x10 -5х105 имп/мин распределяли по четырем пробиркам .ьре.л(Ао& в соотношении 2:3:3:2, лиофилизиро-вали и использовали для химической модификации соответственно по гуанину (6-), пуринам (G- + A), пиримидинам (С+Т) и цитозину (С). (6-). Гуанин-специфичное метилирование ДНК. Лиофилизи- рованную пробу растворяли в 60 мкл 1$-ного раствора диметил-сульфата в 50 мМ формиате аммония, рН 3,5 и инкубировали при 20С 1-5 мин. Длительность реакции устанавливали эмпирически в зависимости от длины фрагмента.
Природа последовательности А2 и ее структурная организация
На рисунке 6 показаны результаты гибридизации меченных фрагментов клонов Мч 21 и А «2Ь с тотальной рестрикти-рованной мышиной ДНК. Если в качестве зонда использовали /IwdJE / &! -фрагмент ДНК длиной 0,72 тыс.п.н. ( Мл - 25), то при гибридизации с ДНК мыши, обработанной со&/ , наблюдалась полоса в области 1,35 тыс.п..н. (имеется также некоторая гетерогенно распределенная гибридизация в более высокомолекулярной области). Очень схожая картина имеет место при использовании в таком же опыте fiutcLW /6со/Ы -фрагмента длиной 0,62 тыс.п.н. клона J A L 21. Эта полоса гибридизации точно совпадает с полосой, наблюдаемой в ультрафиолете при обработке мышиной ДНК эн-донуклеазой соИ\ (рис.6). При гибридизации этих же зондов или бсоЙА /ЪалъШ-фрагмента клона Л . 25 (длиной 2,4 тыс. п.н.) с мышиной ДНК, переваренной рестриктазой Всы М можно видеть полосу в области 4,6 тыс.п.н. И опять-таки оказалось, что эта гибридизация совпадает с полосой, видимой на электрофореграмме мышиной ДНК, обработанной ВанЯІ (рис.6).
Очевидно, что наблюдаемые в ультрафиолете мажорные фрагменты, вырезаемые из тотальной ДНК мыши при действии эндонуклеаз саЯ1 или $ам/С( » выщепляготся из какого-то высокоповторяющегося элемента. Поскольку Н-іпсІШ /u f фрагменты обоих клонов гибридизовались с соЩ фрагментом длиной 1,3 тыс.п.н., ввдепляемым из тотальной ДНК, клоны хМ \ 21 и J0 L 25 должны содержать последовательности этого фрагмента. При гибридизации тех же фрагментов клонов с тотальной ДНК, переваренной совместно Ш иШ. и се1Ы наблюдаемые гибридизационные полосы точно соответствовали по размеру длине фрагментов-зондов (рис.6). Учитывая, что и суммарная длина KisuLuL/ и Ц\ фрагментов клонов М - 21 и jU .2b хорошо совпадает с длиной CcoRJ фрагмента тотальной ДНК (соответственно 1,34 тыс.п.н. и 1,35 тыс.п.н.), мы сделали вывод, что в этих клонах находятся две части повторяющейся последовательности, стыкуемые по \1\мАЖ сайту. Как уже отмечалось выше, в клонах М .21 и /& ч-25 имеются гомологичные последовательности (см.рис.1). Для локализации гомологии мы провели перекрестную гибридизацию между этими клонами. Результаты этих опытов приведены на рисунке 7. Оказалось, что гомологичные участки довольно протяженны (около 2,5 тыс.п.н.) и располагаются на концах повторяющейся последовательности.
Мы предположили, что эти повторы аналогичны длинным концевым повторам мобильных элементов дрозофилы и дрожжей. Позже из того же плазмидного банка мы отобрали еще 2 клона ( Лт, 10 и Мл . 43), содержащих ту же часть повторяющейся единицы, что и М 21. В качестве зонда при отборе этих клонов мы использовали меченный So Щфрагмент клона Мы 21 длиной 0,5 тыс.п.н. Параллельно из библиотеки фрагментов геномной ДНК мыши в фаге JI 47.1 мы отобрали два клона (ЛЛбн-2 и Х-Мм 8), содержащих полный А2-повтор (эти клонн отбирались последовательной гибридизацией с bcu fU фрагментом длиной 0,5 тыс.п.н. клона М . 21 и Ьси -Щ фрагментом длиной 0,9 тыс.п.н. клона М" - 25.). Соответствие между Фрагментами различных клонов было подтверждено перекрестной блот-гибри-дизацией (см.рис.2). Гибридизационный анализ четырех новых клонов ясно показал, что они, в отличие от клона МАМ.21, не содержат на своем правом конце протяженной последовательности, гомологичной левому концу изучаемого элемента. Как мы теперь полагаем, описанное для Jkn- 21 расположение последовательностей объясняется тем, что в этом случае был, видимо, проклонирован фрагмент ДНК, в котором состыковываются две копии тандемно расположенных А2-элементов. Правая копия имеет некоторые дефекты в своей структуре, что в свое время затруднило ее идентификацию. Используя имеющиеся клоны, мы попытались определить границы повторяющегося элемента А2. При блот-гибридизации меченного В&М.Ш фрагмента длиной 0,9 тыс.п.н. клона Jlui, 25 с тотальной ДНК, рестриктированной Е сиъН 1 , обнаруживались две мажорные полосы, соответствующие фрагментам ДНК длиной 0,9 и 0,7 тыс.п.н. (рис.8). Отсюда можно сделать вывод, что оба эти сайта Ё &ш.Щ локализуются в пределах повторяющейся единицы, причем возможны два варианта их взаимного расположения: на расстоянии 0,9 и 0,7 тыс.п.н. друг от друга. Аналогичный опыт с использованием в качестве зонда /бшяЕ / За к/6/ фрагмента М 25 длиной 1,9 тыс.п.н. показал, что этот М оЕ-сайт лежит вне повтора (габридизанионные полосы отсутствовали). Гибридизация84 /І25І/-дсРНК-А (рис.3), а также / /-тотальной ДНК мыши с фрагментами Мм. 25 (рис.8) показала, что & и .Ц{ /fCc d-W фрагмент не гибридизуется с этими пробами. Кроме того не удавалось детектировать гибридизации этого фрагмента с клоном ХМ РС2, Все эти результаты показывают, что повторяющаяся единица может заходить в этот фрагмент клона М» 25 лишь незначительно.
Аналогичные подходы были использованы для локализации правого конца повторяющегося элемента. Езют-гибридизация ЬоикКА /со&( фрагмента М к 43 длиной 1,2 тнс.п.н. с рестриктированной тотальной ДЕК мыши не выявило дискретных полос. Это показывает, что и М сайт лежит вне повтора. Этот вывод был подтвержден гибридизацией меченной тотальной ДЕК мыши с рестриктированной ДЕК клона Ju 43. Не детектировалась гибридизация с со&1 I Ьал Щ фрагментом длиной 0,6 тнс.п.н. Также не было гибридизации тотальной ДЕК с двумя правыми субфрагментами, образующимися при обработке со(Ъ\ / Ехи Ш фрагмента длиной 1,2 тыс.п.н. эндо-нуклеазой H fl (рис.8). Таким образом А2-повтор простирается вправо не более чем на 0,7 тыс.п.н. за BXUHHJ сайт. В нижней части рисунка 2 представлена карта А2-повто-ра, суммирующая структуру выделенных нами клонов. Длина повтора составляет примерно 6,2 тыс.п.н. Следует отметить, что не все копии А2-последовательности имеют описанную выше структуру. Так, например, картирование клона %М м-8 выявило значительную делециго в центральной его части (см. рис.2). Для того чтобы выяснить насколько распространены в геноме неполные копии А2-повтора, была проведена гибридиза- ция библиотеки генов мыши в фаге Д47.І с различными фрагментами А2-повторов (рис.9). Эти опыты показали, что последо-вательности, прилежащие к одному из концов А2 (район Bcu HJ фрагмента длиной 0,5 тыс.п.н. Мл . 43) повторяются почти в 10 раз чаще, чем последовательности середины или другого конца А2 (22$ всех бляшек гибридизовалось с &й іШ/ icofbl фрагментом МАМ. 43 длиной 1,2 тыс.п.н. и только 3,8$ с ВамИІ Фрагментов Я 25 длиной 0,9 тыс.п.н.). Таким образом, видимо, многие копии А2 имеют протяженные делеции и представлены лишь последовательностями одного конца. 4. Транскрипция элементов АІ и А2. С помощью гибридизации с ДНК, иммобилизованной на фильтрах, мы выяснили, что соответственно 7$ и 1,5$ дсРНК-А гибридизуется с последовательностями АІ и А2. В то же время только 0,5$ и 0,1$ ядерной поли(А)+РНК соответственно гибридизуется с этими клонированными последовательностями ДНК. Следовательно, имеет место 15-кратное обогащение этими последовательностями дсРНК-А по сравнению с ядерной поли(А)+ РНК? Кроме того, эти данные говорят о том, что АІ- и А2-транскрипты - богато представленные РНК.
