Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Взаимодействие регуляторных факторов с РНК-полимеразой 8
1.1. Введение 8
1.2. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики 9
1.2.1. Рифамшщин 9
1.2.2. Тагетитоксин 14
1.2.3. Альфа-аманитиы 17
1.2.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина. 20
1.2.5. Стрептолидигин 21
1.2.6. Липиармицин 23
1.2.7. МикроцинД25 25
1.2.8. Ингибиторы серии CBR703 29
1.2.9. Дауномицин и марселломицин 31
1.3. Фаговые транскрипционные факторы, модифицирующие бактериальные РНК-полимеразы 34
1.3.1. Регуляция транскрипции в ходе развития бактериофага Т7 34
1.3.2. Регуляция транскрипции бактериофага X 35
1.3.3. Регуляция транскрипции в процессе развития фага Т4 37
1.3.4. Транскрипция фагаБРО! 45
1.3.5. Nun белок фага НК022.. 46
1.3.6. Белок SSB бактериофага N4 47
1.3.7. Белок р4 фага J29 48
1.3.8. Белок ogr фага Р2 48
1.4. Клеточные регуляторы транскрипции 49
1.4.1. Белковые репрессоры и активаторы инициации транскрипции 49
1.4.2. Небелковые регуляторы транскрипции 53
1.4.3. Топоизомеразы 56
1.4.4. Рибосомные белки, участвующие в транскрипции 58
Глава 2. Материалы и методы 62
2.1. Бактериальные штаммы, ллазмиды и бактериофаги 62
2.2. Бактериальные среды 63
2.3. Полимеразы 63
2.4. Приготовление лизата фага Хр-10 63
2.5. Электрофорез 64
2.6. Компетентные клетки и трансформация бактерий 64
2.7. Приготовление ДНК. 64
2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
2.9. Экспрессия субъединиц РНК-полимеразы, частей р'-субъедиинцы РНК-полимеразы Е. coli и X.oryzae и белка р7 , 65
2.10. Выделение тел включения гиперпродуцированных субъединиц, частей 0'-субъедшшцы РНК-полимеразы Е. coli и X.oryzae и белка р7 66
2.11. Очистка белков из тел включения хроматографией на Ni^-NTA агарозе в денатурирующих условиях 67
2.12. Сборка РНК-полимеразы Е. coli из отдельных субъединиц in vitro 67
2.17. Приготовление РНК-полимеразы из клеток. 68
2.18. Частичная очистка РНК-полимераз содержащих (3'- субъедитщу нлазмлдного происхождения 70
2.19. Транскрипция in vitro 70
2.20. Пирофосфоролиз 74
2.21. Получение арестованных в положении +27 элонгационных комплексов .75
2.22. Щелочное расщепление транскрипта 75
2.23. Коиммобйлизация РНК-полимеразы X.oryzae и р7 на Ni-NTA агарозе 76
2.24. Эксперименты по замедлению миграции промоторных фрагментов в нативномПААГ 76
2.25. Разделение белковых комплексов в нативном ПААГ. 77
2.26. Тестирование трансформантов на устойчивость к микроцину J25 in vivo. 77
2.27. Сайт-специфический мутагенез клонированного гена rpoC Exoli 77
2.28. Мечение олигонуклеотидов 78
2.29. КМпС>4 футпринтинг. 79
2.30. Расщепление термолизином микроцина125 79
2.31. Обратнофазная HPLC хроматография микроцина и его производных 79
2.32. Мечение белка р7 80
2.33. Блогтинг и гибридизация 80
Глава 3. Результаты и обсуждение 81
3.1. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы Xanthomonas oryzae белком р7 бактериофага Хр 10 81
3.1.1. Р7 не является анти-сигма фактором 82
3.12. Р7 взаимодействует с N-концевым участком р*-субъединицы 84
3.1.3. Р7 препятствует образованию открытого комплекса РНК-полимеразой X.oryzae 86
3.1.4.р7 подавляет терминацию транскрипции РНК-полимеразой X.oryzae 88
3.1.5. р7 способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрибирующей полимеразы. 90
3.1.6. Р7 участвует в регуляции транскрипции генома фага ХрЮ 98
3.2. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы микроцином J25 105
3.2.1. Открытие и свойства микроцина J25 105
3.2.2. Система отбора устойчивых мутантов 107
3.2.3. Дополнительные мутации устойчивости в консервативном сегменте G. 108
3.2.4. Микрощш J25 специфически подавляет активность РНК-полимераз грам-отрицательных бактерий 112
3.2.5. Эффект мутаций внутри и вокруг консервативного района G' на устойчивость к микрощшу J25 113
3.2.6. Замены, приводящие к устойчивости к микропину, есть и в сегменте F. 117
3.2.7. Некоторые мутации устойчивости к стрептолидигану в р - субъединице оказались мутациями устойчивости и к микроцину 118
3.2.8. Микроцин ингабирует присоединение нуклеотида по смешанному типу. 122
3.2.9. Микроцин уменьшает скорость элонгации транскрипции 123
3.2.9. Микроцин уменьшает скорость пирофосфоролиза. 125
3.2.10. Микроцин замедляет впадение тройного элонгационного комплекса в арестованное состояние 126
3.2.11. Микроцин подавляет стимулируемое GreA фактором расщепление транскрипта и не влияет на собственную эндонуклеазную активность РНК-полимеразы 127
3.2.12.Изучение структуры микроцина J25 129
Выводы 135
Список сокращений: 136
Список литературы 137
Список работ, опубликованных автором по теме диссертации 165
- Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики
- Фаговые транскрипционные факторы, модифицирующие бактериальные РНК-полимеразы
- Компетентные клетки и трансформация бактерий
- Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы микроцином J25
Введение к работе
Актуальность темы. Транскрипцию, то есть синтез РНК на матрице ДНК, осуществляют в клетке сложные многосубъединичные ферменты - РНК полимеразы. Для настройки процесса адаптации к различным физиологическим условиям активность РНК полимераз регулируется разнообразными белковыми и небелковыми факторами..
Важным достижением в почти 50-летней истории изучения РНК-полимераз стало получение трехмерной структуры РНК-полимеразы бактерии Thermus aquaticusy что позволило приписать известные функции определенным структурным элементам, а также начать изучать неизвестные ранее белковые домены. Тем не менее, кристаллическая структура отражает только одну из возможных конформаций фермента. Поэтому информация на основе структурных данных может быть применима лишь с известными ограничениями к мобильному ферменту, цикл работы которого сопровождается конформационными изменениями. Наряду с изучением механизмов базальной транскрипции, можно изучать модуляцию транскрипции разнообразными траснкрипционными факторами. Неоспоримыми достоинством этого подхода можно считать то, что исследуются заведомо функциональные состояния фермента, а полученные данные дают информацию о механизмах регуляции его активности. Количество известных транскрипционных факторов постоянно растет, многообразие механизмов и специфичность их действия способствуют углублению понимания процесса транскрипции.
Более того, ингибиторы бактериальной транскрипции представляют собой большой и практически невостребованный- пул потенциальных антибиотиков* Не исключено, что в ближайшее время, в связи с очевидной проблемой катастрофического увеличения количества устойчивых штаммов бактерий, они и производные на их основе найдут применение в терапии различных заболеваний.
Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение механизма действия двух видоспецифичных ингибиторов бактериальной транскрипции. В работе ставились следующие задачи:
Изучить действие белка р7 бактериофага ХрЮ на РНК-полимеразу бактерия Xanthomonas oryzae. Предсказать роль р7 в регуляции транскрипции фагового генома.
Изучить механизм ингибирования РНК-полимеразы Escherichia coli антибактериальным пептидом микроцином J25.
Научная новизна и практическая ценность работы, В работе исследован механизм ингибирования РНК-полимеразы Xanthomonas oryzae белком р7 бактериофага ХрЮ. Этот уникальный бифункциональный транскрипционный фактор ингнбирует инициацию и терминацюо транскрипции, связываясь с N-концевым районом р'-субъединицы. В работе был изучен механизм антитерминации, вызываемой белком р7. Механизм действия этого белка уникален среди изученных факторов транскрипции — он способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрипционного пузыря. Необходимо отметить, что Xanthomonas oryzae - это бактерия, поражающая рис, основную сельскохозяйственную культуру азиатского региона. Изучение механизма подавления транскрипции этой бактерии, возможно, позволит эффективнее бороться с ней и снизит экономические убытки.
В работе изучен механизм ингибирования различных функций РНК-полимеразы Escherichia coli бактерицидным пептидом микроцином J25. Впервые экспериментально была подтверждена приписываемая вторичному каналу функция размещения 3'-конца транскрипта в арестованном состоянии. Получены мутации устойчивости к этому антибиотику. Изучение действия, а также анализ частоты возникновения мутаций устойчивости полезны при оценке перспективности микрощша и его производных для разработки антибиотиков на его основе.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,- обзора литературы,, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста и содержит 35 рисунков. Библиография включает в себя 194 названия, в том числе 1 русское и 193 иностранных.
Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики
Рифампицин- самый изученный к настоящему времени ингибитор РНК-полимеразы и и единственный нашедший клиническое применение в качестве антибиотика. Рифампицин относится к классу ансамицинов и применяется для лечения проказы и туберкулеза. К тому же классу относятся стрептоварицин и толипомицин. Родовое название этих антибиотиков происходит от названия присутствующей в их структуре 17-членной ненасыщенной так называемой анса-цепи (рис . 1). Основные данные о действии ансамицинов получены при изучении рифампицина, они справедливы также и для других ансамицинов. О стрептоварицине - ациклическом ансамицине - известно также, что он (в концентрациях около 100мкг/мл) ингибирует транскрипцию РНК-полимеразами II и Ш, по-видимому, на уровне сборки инициационного комплекса. Рифампицин давно изучают биохимическими и генетическими методами. Интерес к его изучению на протяжении десятилетий подогревался очевидной настоятельной необходимостью и клинической пользой. Поэтому рассказ о рифампищше носит несколько исторический характер. Рифампицин ингибирует транскрипцию в клетках Е coli на стадии инициации (Mosteller and Yanofsky, 1970). Все эубактериальные РНК-полимеразы дикого типа (за исключением хлоропластных, также причисляемых к классу эубактериальных) чувствительны к рифамгшцину.
Рифампицин прочно связывается с РНК-полимеразой, образуя стабильный при гель-фильтрации комплекс в стехиометрическом соотношении 1:1 (Wehrli et al., 1968). Комплекс устойчив к действию высокой ионной силы (Handschm and Wehrli 1976). Для взаимодействия антибиотика с полимеразой важны ОН-грушш ансацепи, что свидетельствует об участии водородных и отсутствии ионных связей в образовании комплекса. В присутствии неполярных органических растворителей константа взаимодействия рифампицина с РНК уменьшается (Wehrli et al., 1976). Для биологической активности рифампицина необходимы гидроксильные группы в положениях С1,С8, С21 и С23 (Campbell et аЦ2001). Mycobacterium tuberculosis приобретают устойчивость к рифалшицину путем химической модификации заместителей в положениях С1 и С23 (Quan et al.,1999). Устойчивые к действию рифампицина РНК-полимеразы не связывают его. Все мутации рифампициновой устойчивости картируются в гене гроВ (Ovchinnicov et al., 1983 Jin and Gross 1988, Severinov et al., 1993). Изолированная р-субъсдишща не связывает рифамгшцин. Секвенирование гроВ генов из устойчивых клеток показало, что почти все мутации сосредоточены в центральном участке Р-субъединицы (Jin and Gross 1988, Severinov et al., 1993). Внутри этого Rif- района выделено три кластера мутаций: I кластер - кодоны 512-534 II кластер - кодоны 563-574 Ш кластер определяется точечной заменой R687H . Еще одна точечная мутация , замена V146 на F, приводит к сильной устойчивости (Lisitsyn et al., 1984).
В соседних со 146 положениях получен ряд замен, вызывающих невысокий уровень устойчивости (Severinov et al., 1994). Существует четкая связь между мутантным сайтом и уровнем устойчивости фермента. Мутации в положениях 146, 513 , 522 определяют высокий уровень устойчивости полимеразы. Замена R687H обеспечивает только очень низкий уровень устойчивости. В ранних работах был получен ряд данных, позволяющих предполагать, что дискретные Rif - кластеры в нативном ферменте объединены в единую структуру, действующую как функциональная единица РНК-полимеразы (Jin and Gross, 1988; Tavormina etal.,1996). Рифамгшцин практически не влияет на связывание полимеразы с промотором и на образование открытого комплекса с промотором (Hinkle et al.,1972; McClure and Cech, 1978), Связывание рифампицина слегка (примерно в 2 раза) увеличивает кажущуюся Km для инициирующего нуклеотида в і-сайте фермента, и не влияет на связывание следующего субстрата в Ї+1 сайте (McChire and Cech, 1978). Рифамиицин полностью подавляет синтез второй фосфодиэфирной связи (если синтез инициирован с трифосфата) или третьей фосфодиэфирной связи (если синтез инициирован с ди- или монофосфата) (McClure and Cech, I97S). Следовательно, рифампицин не влияет ни на каталитическую активность фермента, ни на его способность к транслокации. Рифампицин не действует на элонгирующую РНК-полимеразу, уже синтезировавшую длинный транскрипт (McClure and Cech, 1978). Сайт связывания рифампицина формируется только в кор-ферменте, и р -субьединица играет важную роль в формировании сайта связывания рифампицина, поскольку ни отдельная р-субъединица, ни комплекс агр не связывают рифампицин (Naryshkina et al.,2001). В трехмерной модели структуры РНК-полимеразы мутации устойчивости к рифамшщину картируются в основании и между долями, которые образует р-"челюсть". Самый близкий к N-концу кластер мутаций устойчивости (положение 146 у E.colf) и ближайший к С-концу кластер (положение 687 Е.СОІІ) находятся там, где эти доли соединяются. Аминокислоты кластера I расположены в обеих долях, аминокислоты кластера П - только в одной доле (Naryshkina et al.,2001). Все эти генетические и биохимические данные позволили еще до определения кристаллической структуры комплекса рифампицина с полимеразой примерно определить сайт связывания и выдвинуть гипотезу о механизме действия рифампицина, согласно которой он препятствует выходу РНК. Этот эффект может быть прямым - рифампицин стерически блокирует путь выхода транскрипта, либо непрямым - рифампицин так меняет конформацию фермента, что РНК не может выходить. Получение кристаллической структуры комплекса РНК-полимеразы с рифампицином с разрешением 33 A (Campbell et al.,2001 ) подтвердило правильность модели рифампицина как простой стерической помехи на пути выхода РНК. Рифампицин связывается в кармане Р-субъединицы, глубоко в РНК-ДНК канале, на расстоянии 12 А от активного центра, то есть слишком далеко для того, чтобы непосредственно влиять на катализ.
Фаговые транскрипционные факторы, модифицирующие бактериальные РНК-полимеразы
Вход в клетку фаговой ДНК и сопутствующая транскрипция ранних генов осуществляется бактериальной полимеразой. Затем активность хозяйской полимеразы блокируется и остальные фаговые гены транскрибируются фаговой полимеразой.
Продукт одного из ранних генов, gp 0.7 это протеин киназа, которая, в числе прочих белков, фосфорилирует р к;уб диницу РНК-полимеразы (Robertson and Nicholson, 1990) . Предполагается, что протеин киназа бактериофага принимает участие в переключении транскрипции с хозяйской на вирусную полимеразу. В работе (Pfennig- Yeh et al.,1978) было показано, что gp 0.7 усиливает терминацию в районе между группой генов, транскрибируемых бактериальной полимеразой и группой генов, транскрибируемых фаговой полимеразой. В настоящее время сайт фосфорилирования р -субьединицы уже картирован. Это треонин в эволюционно вариабельном районе р ( Severmova, готовится в печать). Замена этого остатка треонина на глутаминовую кислоту, имитирующая фосфорилированное состояние Р чгубъединицы, усиливает терминацию транскрипции. Эти данные полностью согласуются с существующей гипотезой о роли gp 0.7 в регуляции транскрипции.
Интересно, что Т7-подобный фаг, заражающий Caulobacter crescentus, бактерию, неродственную Е eoli, кодирует треонин-югаазу, которая фосфоршшрует Р -субъединицу РНК-полимеразы. По всей вероятности, фосфорилирование р -субъединицы, широко распространенное свойство Т7-подобных фагов.
Gp2 - это маленький белок длиной в 64 аминокислотных остатков, который связывается связывается с РНКП Е.соІІ и ингибирует транскрипцию ( Nechaev and Severinov, 1999). Сайт связывания gp2 определен с точносью до фрагмента в 50 аминокислот в вариабельном районе р -субъединицы, следующим в последовательности сразу за консервативным сегментом G\ Сайт связывания расположен в структуре фермента таким образом, что можно предположить, что gp2 препятствует связыванию о -холофермента с промотором и не связывается с открытым промоторным комплексом. Интересно, что ингибирование gp2 специфично по отношению к последовательности промотора и типу ст-субъединицы. В частности, gp2 не ингибирует транскрипцию с промоторов с удлиненной -10 областью. По-видимому, он предотвращает взаимодействие консервативного района 4.2 с —35 элементом промотора. Транскрипция холоферментами, содержащими а , ст а также Т4 gp55 устойчива к gp2 ( Nechaev and Severinov, 1999; Wigneshweraraj and Severinov, неопубликованные данные). С другой стороны, эта специфичность действия может быть только кажущейся. Различный эффект gp2 может быть связан с различной стабильностью открытых комплексов или силой связывания переднего дуплекса ДНК с РНК-полимеразой в комплексах, образованных разными холоферментами. Вероятно, степень ингибирования gp2 оказывается тем больше, чем меньше собственная стабильность промоторного комплекса. Фаг Л, не кодирует собственной полимеразы, и транскрипция в ходе всего цикла развития осуществляется хозяйской РНК-полимеразой. Регуляция ранней транскрипции. Белок N.
Первым из ранних генов бактериофага транскрибирующихся влево, является ген белка N. Продукт гена N- это РНК-связывающий белок, который модифицирует РНК-полимеразу в составе элонгационного комплекса таким образом, что она перестает узнавать терминаторы и способна транскрибировать почти весь геном фага. С-концевой домен N способен слабо взаимодействовать со свободной РНК-нолимеразой или тройным элонгационным комплексом (Mogridge, 1998). Связывание N с элонгационным комплексом становится более прочным, если синтезированная РНК содержит nut-сайт - элемент последовательности, с которым N специфически связывается за счет своего N-концевого аргинин-богатого мотива (Legault et al.,1998). В присутствии только N РНК-полимераза преодолевает терминаторы только в непосредственной близости от nut-сайта (Rees et al.,1996). В настоящее время предполагается, что целая сеть белок-белковых и белок-РНК-взаимодействий стабилизирует взаимодействие N с элонгационным комплексом (Mason and Greenblatt, 1996). Несколько элонгациокных факторов Exoli вовлечены в процесс N-зависимой антитерминации - NusA, В, G и Е. In vitro для стимуляции антитерминации достаточно только NusA (Whalen et al., 198 8). Интересно, что сам NusA, наоборот, значительно усиливает терминацию на многих терминаторах (Farnham et al.,1982). Эффективность терминации зависит от длительности паузы в сайте терминации и от стабильности шпильки в РНК. Мишенью большинства регуляторов терминации является процесс образования шпильки. (Gusarov and Nudler, 2001). Участок РНК, образующий одно из плечей терминационной шпильки, способен связываться как с комплементарным участком РНК, так и с РНК-полимеразой. В конечном счете эффективность образования шпильки зависит от конкуренции двух альтернативных сайтов связывания. NusA дестабилизирует взаимодействие РНК с РНК-связывающим сайтом полимеразы и, таким образом увеличивает стабильность шпильки, и как следствие, усиливает терминацига. N, наоборот, стабилизирует взаимодействие одного из палиндромных элементов с РНК-полимеразой и препятствует терминации.
Поздние гены фага, необходимые для лизиса клетки, упаковки ДНК и синтеза структурных белков, транскрибируются с единственного промотора, pR\ Между этим промотором и первым геном оперона расположен сильный терминатор транскрипции. Еще несколько терминаторов находятся между группами поздних генов. Для транскрипции поздней области с попутным преодолением расположенных по ходу терминаторов, необходим белок Q. При транскрипции с промотора pR \ РНК-полимераза останавливается, когда транскрипт достигает длины 15-16 нуклеотидов (Yang and Roberts, 1989). Пауза вызывается тем, что этот первоначально транскрибирующийся участок содержит последовательность, похожую на последовательность -10 элемента промотора. Этот аналог -10 элемента промотора расположен на расстояния 12 нуклеотидов от собственно -10 элемента и узнается как нематричная оцДНК районом 2 a70 (Ring et al.,1996). Белок Q связывается с паузированяым комплексом и придает РНК-полимеразе антитерминационные свойства, оставаясь связанным в составе элонгационного комплекса. Механизм вызываемой Q антитерминации пока не понят. РНК-полимераза, модифицированная Q, элонгирует быстрее и делает меньше пауз, но этого недостаточно для объяснения эффективной транскрипции через терминатор. Белок Q связывается с pR между -10 и -35 элементами (Yarnell and Roberts, 1992). Так как сайт связывания перекрывается с промотором, принято считать, что Q не связывается с открытым промоторным- комплексом; а связывается- г ДНК и взаимодействует с элонгационным комплексом в положении 15-16 (Manet al„ 2001).
Компетентные клетки и трансформация бактерий
Плазмидные ДНК приготавливали методом щелочного лизиса с использованием реагентов и протокола производителя (Quagen).
ДНК бактериофагов приготавливали, добавляя к лизату бактериофага (0,5 мл с титром 10 фаговых частиц/мл) равный объем фенола, предварительно уравновешенного в 1М Tris-HCl рН 8,0, и перемешивали на Вортексе при максимальной скорости в течение 30 секунд. После центрифугирования (12000g в течение 2 минут) верхнюю фазу аккуратно отбирали, стараясь избежать интерфазы, и переносили в новую пробирку. Обработку фенолом повторяли дважды, после чего проводили однократную экстракцию хлороформом в тех же условиях. К верхней фазе, получившейся после экстракции хлороформом, добавляли равный объем изопропанола и перемешивали. Образовавшуюся "медузу" ДНК переносили в новую пробирку, промывали 1мл 70% этанола, высушивали при комнатной температуре до полного удаления жидкости и растворяли в 100 микролитрах воды. (Выход ДНК составлял 10-20 микрограмм), после чего хранили при -20СС. В качестве матрицы для ПЦР использовали 0,01-0,1 мкг ДНК.
Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью Vent ДНК-полимеразы (New England Biolabs) в соответствии с рекомендациями производителя. 100 мкл стандартной реакционной смеси содержали: 10 мМ Трис-НС1 рН 83; 50 мМ КС1, 4 мМ MgCb, 250 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Pharmacia (Швеция)), 100 ггакомоль каждого праймера, 10 нг ДНК-матрицы, 5 единиц полимеразы. ПЦР проводили на приборе Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer). Реакция состояла из 25-30 циклов, каждый содержал стадии плавления при 94 С (время инкубации зависело от размера ДНК матрицы), отжига праймера (температура зависела от температуры плавления праймера, время - от его длины), и синтеза при 72 С ( время зависело от размера искомого продукта согласно правилу — 1 минута для каждой тысячи пар нуклеотидов). Продукты амплификации разделали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, содержащем IX буфер ТВЕ в присутствии бромистого этидия (Маниатис и др., 1984). Фрагмент геля, содержащий целевой продукт ПЦР, вырезали, и ДНК экстрагировали с использованием реактивов фирмы Qiagen.
Трансформанты, выросшие на твердой среде LB с антибиотиком, пересевали в 2 мл жидкой среды LB и растили до оптической плотности OD oo 1»0. Клетки собирали низкоскоростным центрифугированием, ресуспендировали в 20 мкл воды, и к суспензии добавляли равный объём буфера, содержащего 0,125 М Трис-HCl рН 6,8; 20% глицерин, 0,2% додецилсульфат натрия, 30 мМ р-меркаптоэтанол и 0,001% бромфенолового синего. Пробы нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут, и аликвоту (10 мкл) наносили на денатурирующий белковый гель концентрация полиакриламида в разделяющем геле - 7,5%; соотношение АА:БА — 29:1. Электрофорез проводили в течение 30 мин при силе тока 30 мА. Эффективность экспрессии определяли по наличию суперэкспрессированной белка в геле, окрашенном Кумасси R-250.
Препаративную экспрессию субъединиц проводили в 1 литре LB, содержащей ампициллин. Клетки растили при 37 С при интенсивном качании до оптической плотности OD$oo 0,5. В культуру добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 3 часа, после чего клетки собирали центрифугированием (5000 об/мин 10 мин) и использовали для выделения тел включения,
Выделение тел включения проводилось по методике (Borakhov, Goldfarb, 1993). Клетки, полученные после гиперэкспрессии белков, ресуспендировали в буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 500 мМ NaCl; 5% глицерин; 10 мМ ЭДТА; 10 мМ Р-меркаптоэтанол) в соотношения 10 мл буфера на 1 г биомассы. Клетки разрушали с помощью ультразвука на льду, полученный лизат центрифугировали 10 мин при 12000g. Супернатант удаляли, а осадок, содержащий тела включения, ресуспендировали ультразвуком в 10 мл указанного буфера для промывки от примеси растворимых белков. Ресуслендированные тела включения осаждали центрифугированием (10 мин, 12000 g), супернатант удаляли, и процедуру промывки повторяли ещё 2 раза. После последней промывки тела включения ресуспендировали в указанном буфере с добавлением Na-дезоксихолата до 0,2% и инкубировали на при 0С в течение 2 часов. После инкубации тела включения осаждали центрифугированием и промывали один раз буфером с дезоксихолатом натрия, а затем два раза буфером следующего состава: 50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 100 мМ NaCl, 5% глицерин, 1 мМ ЭДГТА, 2 мМ Р-меркаптоэтанол. Разделённые на аликвоты тела включения осаждали центрифугированием, супернатант удаляли, и полученные осадки хранили при -70 С.
Изучение молекулярного механизма ингибирования РНК-полимеразы микроцином J25
Недавно группой аргентинских ученых был открыт новый ингибитор активности РНК-полимеразы Exoli (Delgado et al., 2001). Микроцин J25 -кодируемый плазмидой циклопептид, состоящий из 21 немодифицированного аминокислотного остатка. Плазмида содержит 4 гена (mcjA, -В, -С, -D), необходимых для синтеза и секреции мнкроцина. McjA кодирует 58 аминокислотный пептид-предшественник, продукты генов McjB и McjC принимают участие в созревании пептида. McjD кодирует белок , придающий бактериям устойчивость к антибиотику.
Последовательность этого белка гомологична последовательности ABC транспортеров - АТРаз, производящих энергию для трансмембранного транспорта молекул. Предполагается, что mcjD, участвуя в активной секреции антибиотика, позволяет поддерживать его внутриклеточную концентрацию ниже токсического уровня. Микроцин синтезируется бактериями в стационарной фазе роста в бедной среде, таким образом, давая производящим его бактериям селективное преимущество в борьбе за субстраты. У E.coli найдено большое количество спонтанно возникших мутаций устойчивости к микроцину J25. Болыпинство из них картировано в генах, кодирующих компоненты клеточной оболочки. (Salomon and Farias, 1995) По-видимому, эти мутации уменьшают проницаемость клеточной стенки для микроцина, и он практически не проникает в клетки этих мутантов. Неожиданно одна из мутаций устойчивости была обнаружена в гене, кодирующем р -субъединицу РНК-поли меразы. Этот факт позволил сделать предположение о том, что именно РНК-полимераза является внутриклеточной мишенью микроцина, и ингибирование этого фермента определяет бактерицидное действие микроцина. Действительно, активность РНК полимеразы Exoli in vitro - (в тесте по включению меченого УТФ в кислотонерастворимую фракцию транскриптов) уменьшалась в присутствии микромолярных концентраций микроцина (Delgado et al, 2001). Наши аргентинские коллеги не изучали фермент с заменой Т93II из-за отсутствия технических средств. РНК-полимераза из устойчивого штамма была выделена в нашей лаборатории и использована для опытов по in vitro транскрипции. Результаты эксперимента, представленные на рис. 20, показали, что мутантный фермент действительно устойчив к микроцину.
Это было первым прямым доказательством того, что микроцнн связывается с РНК-полимеразой, и положение 931 является частью сайта связывания. Первая обнаруженная мутация устойчивости к микроцину в р -субъедияице представляет собой замену эволюционно консервативного остатка Thr931 на Не. Thr 931 расположен в сегменте G, последовательность которого консервативна среди самых больших субъединиц РНК-полимераз. В модели структуры РНК -полимеразы T.aq. аминокислотный остаток, соответствующий Thr 931 расположен на внутренней поверхности вторичного канала , ведущего от каталитического центра к поверхности фермента. На основе структурных данных вторичному каналу приписывается несколько функций. Предполагается, что он направляет субстраты в активный центр? а также принимает 3 -концевой участок РНК в составе арестованного тройного комплекса. Если предположить, что мшфоцин связывается у входа и стерически блокирует вторичный канал, то изучение воздействия этого антибиотика на активность РНК-полимеразы поможет прямо подтвердить или опровергнуть гипотезы о роли вторичного канала в функциях РНК-полимеразы.
Было решено продолжить работу с микроцином, и в первую очередь определить сайт его связывания путем получения мутаций устойчивости к нему, а затем биохимически изучить его действие на разных стадиях транскрипции in vitro. В работе не ставилась задача получить все возможные мутации устойчивости к микроцину J25. Подход заключался в том, чтобы максимально использовать уже полученные в ходе нескольких десятилетий мутации, а также получить разумное минимальное и достаточное количество новых мутаций для того, чтобы обозначить сайт связывания микроцина с РНК-полимеразой. Поэтому часто мы с благодарностью использовали плазмиды с заменами в р -субъединице, полученные ранее и предоставленные коллегами из других лабораторий. Отбор мутантов, устойчивых к действию микроцина производился следующим образом. Мутантные гены больших субъединиц РНК-полимеразы находились в составе плазмид. В данной работе мутации были получены в гене гроС, который находится под контролем /ос-репрессора в плазмиде pRL322 и ее производных. Были также тестированы другие плазмиды, полученные ранее и экспрессирующие мутантные гены гроВ и гроС. Все упомянутые плазмиды содержали также ген Атрг и придавали трансформантам способность расти в присутствии ампициллина. Плазмидами, экспрессирующими мутантный гроС трансформировались клетки чувствительного к микроцину штамм E.coli DH5a, трансформанты высевались на среду LB, содержавшую 200 мкг/мл ампициллина. После подращивания в течении ночи с рекомбинантных колоний делалась реплика ( для отбора мутаций, полученных в данной работе) либо колонии просто перекалывались ( в случае проверки плазмид с известными заменами) на чашку со средой LB, содержавшей 200 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл микроцина и ImM IPTG для снятия репрессии lac промотора, с которого эксирессируется плазмидный ген гроС. Из клеток устойчивых клонов выделялась плазмидная ДНК. Эта ДНК повторно трансформировалась в клетки штамма DH5ct, чтобы подтвердить, что устойчивость клеткам придает плазмидный ген гроС В качестве чувствительного и устойчивого контролей нспользовалить плазмиды pRL322, экспрессирующие соответственно гроС дикого типа и гроС Т9311. Если наличие мутации устойчивости таким образом подтверждалось, то для дальнейших экспериментов in vitro получали частично очищенные РНК-полимеразы, содержащие р -субъединицу плазмидного происхождения.
