Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 5
Актуальность проблемы 5
Цель работы и задачи исследования 7
Научная новизна и практическая ценность 7
Структура и объем работы 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Бактериальная РНКП 9
Ингибиторы бактериальной РНКП 12
Рифампицин 12
Сорангицин 17
Миксопиронин, кораллопиронин и рипостатин 18
Сгрептолидигин 21
Тагетитоксин 23
Новые ингибиторы бактериальной РНКП 24
Семейство ингибиторов CBR703 24
GE23077 25
Липиармицин 26
SB2 27
1.3 Микроцины 28
Микроцин J25 28
1.4 Белки-регуляторы транскрипции, кодируемые бактериофагами 34
Белок AsiA бактериофага Т4 34
Белок Gp2 бактериофага Т7 37
Р7 - транскрипционный фактор бактериофага ХрЮ 39
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
2.1 Бактериальные штаммы 41
2.2Плазмиды 41
Питательные среды и антибиотики 41
Компетентные клетки и трансформация бактерий 42
Выделение ДНК 42
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 43
Сайт-специфический мутагенез гена mcj'A, отбор мутантов и подтверждение мутаций 43
Тест производных микроцина J25 на антибактериальную активность 45
Масс-спектрометрический анализ производных микроцина J25 46
Транскрипция in vitro 46
Тест на ингибированпе активности РНКП in vitro производными микроцина J25 47
Выделение и очистка микроцина J25 и его производного T15G 48
Сравнение устойчивости производных РНКП к рифампицину и сорангицину 49
Выделение белков gp79 и gp36 49
Приготовление лизата фага РЫ32 50
Заражение клеток is. coli 55 бактериофагом РЫ32 50
Выделение тотальной РНК и реакция удлинения праймера 50
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 51
2.20 Дот-гибридизация 51
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 53
3.1 СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МИКРОЦИНА J25 53
Получение коллекции производных микроцина J25 53
Мутации в гене mcjA, влияющие на продукцию микроцина 53
Мутации в гене mcjA, влияющие на ингибированпе РНКП 59
Мутации в гене mcjA, влияющие на ингибированпе роста бактерий 60
3.2 ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ СОРАНГИЦИНА НА БАКТЕРИАЛЬНУЮ
РНКП 64
Влияние сорангицина на транскрипцию РНКП Escherichia coli и Thermus aquaticus .64
Анализ перекрестной устойчивости производных РНКП к рифампицину и сорангицину 65
Структура РНКП с сорангицином 67
Механизм ингибирования РНКП сорангицином 68
Конформационная мобильность сорангицина 68
3.3 ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ БЕЛКОВ GP79 И GP36 ВО ВРЕМЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ
ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ БАКТЕРИОФАГА РЫ32 71
Белки gp79 ngp36 связываются с РНКП in vitro 71
Gp79 ингибирует абортивную транскрипцию РНКП с о70-фактором 71
Исследование временной экспрессии генов бактериофага РЫ32 72
ОрЗб-холофермент РНКП узнает промотор бактериофага РЫ32 в присутствии gp79 75
Промоторы бактериофага РЫ32, узнаваемые gp36-PHKn 76
Схема регуляции временной экспрессии генов в ходе инфекции РЫ32 77
ВЫВОДЫ 78
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 92
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-
ПОЛИМЕРАЗЫ С ИНГИБИТОРАМИ ПЕПТИДНОЙ И
НЕПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ
Введение к работе
Актуальность проблемы
ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) - это центральный фермент транскрипции ДНК. Для бактериальной РНКП детально изучено довольно мало низкомолекулярных ингибиторов. Изучение действия таких' ингибиторов позволит углубить наши представления о механизме действия РНКП, а в перспективе разработать антибактериальные препараты, которые найдутнайдут практическое применение. На сегодняшний день только один ингибитор РНКП, рифампицин, и некоторые его производные нашли применение в медицине, как ключевые компоненты при лечении туберкулеза. Данная работа посвящена изучению трех ингибиторов бактериальной РНКП: микроцина J25, сорангицина и gp79. Основной проблемой при терапевтическом использовании рифампицина является быстрое появление мутаций устойчивости к этому антибиотику. Нами было показано, что сорангицин, полиэфирный антибиотик, продуцируемый микобактерией Sorangium cellulosum, связывается с РНКП там же, где и рифампицин. Мы продемонстрировали, что благодаря своей конформационной лабильности сорангицин во многих случаях остается нечувствителен к мутациям в р-субъединице РНКП, приводящим к устойчивости к рифампицину. Таким образом, возможность конформационной адаптации может быть использована как важный критерий при поиске антибактериальных агентов, действующих на РНКП бактерий.
Несмотря на то, что в последнее время найдено довольно много новых ингибиторов РНКП как синтетических, так и продуцируемых различным организмами, микроцин J25 представляют особый интерес. Микроцин J25 - это пептид, приобретающий в результате посттрансляционных модификаций необычную структуру: первые 8 аминокислотных остатков микроцина J25 замкнуты лактамной связью в кольцо, в которое продет С-концевой хвост пептида. То, что в отличие от других известных ингибиторов РНКП, микроцин J25 кодируется ДНК и синтезируется рибосомами, позволяет применить
молекулярно-генетические методы для получения самых различных его производных.
Изучение этих производных (мутантных микроцинов): определение их активностей и установление их структур - позволяет получить новые данные о процессе созревания микроцина, о его действии на РНКП, а также о структуре самого фермента-мишени. В данной работе была получена коллекция точечных мутаций в гене, кодирующем микроцин J25. Полученные мутации приводят ко всем возможным заменам в каждом положении зрелого микроцина J25. Биохимический и микробиологический анализы мутантных микроцинов позволили определить влияние замен аминокислотных остатков на созревание микроцина J25, его способность ингибировать рост чувствительных клеток и способность ингибировать транскрипцию. Оказалось, что, несмотря, на малые размеры и сложную структуру микроцина J25, лишь 30% замен препятствует созреванию зрелого микроцина J25 и его действию на РНКП. В ходе работы были получены производные микроцина J25 с повышенной активностью и расширенным спектром действия. На основании полученных данных возможно получение новых производных микроцина J25 с желаемыми свойствами.
Бактериофаги - это модельные организмы, изучение которых заложило основы современной молекулярной генетики и молекулярной биологии. В ходе развития в клетке бактерии-хозяина фаги должны ингибировать экспрессию генов бактерии-хозяина и обеспечить правильный временной контроль экспрессии собственных генов. Контроль экспрессии генов инфицированного хозяина и самого бактериофага осуществляется с помощью разнообразных факторов, закодированных в геноме бактериофага и действующих на аппарат транскрипции бактерии-хозяина. Таким образом, изучение кодируемых бактериофагами ингибиторов хозяйской РНКП тесно связано с изучением механизмов временной регуляции транскрипции фаговых генов. Данные о таких ингибиторах не только расширяют знания о конкретном бактериофаге, но и открывают новые механизмы регуляции транскрипции у бактерий. На сегодняшний день становится ясно, что генетическое разнообразие бактериофагов, инфицирующих Е. соН, ограничено. Недавно охарактеризованный бактериофаг РЫ32 существенно отличается от всех известных на сегодняшний день фагов Е. coli. На этом основании мы предполагаем, что РЫ32 использует новые и, возможно, уникальные механизмы регуляции экспрессии генов. В третьей части работы было показано двойственное действие белка gp79 фага РЫ32: с одной стороны, это ингибитор хозяйской РНКП, а, с другой, он активирует транскрипцию
РНКП с а-фактором gp36 бактериофага. Эти результаты вместе с полученными данными о временной экспрессии генов РЫ32 и о функции кодируемого РЫ32 с-фактора в транскрипции поздних генов фага позволили предложить общую схему регуляции транскрипции в ходе инфекции РЫ32.
Цель работы и задачи исследования
Целью данной работы было изучение взаимодействий с бактериальной РНК полимеразой (РНКП) трех ингибиторов этого фермента: микроцина J25, сорангицина и белка gp79 бактериофага РЫ32.
Задачи исследования:
Структурно-функциональный анализ микроцина J25 с определением позиций микроцина важных для созревания, для ингибирования РНКП и для входа в бактериальную клетку.
Изучение механизма действия сорангицина на бактериальную РНКП.
Изучение временной регуляции экспрессии генов бактериофага РЫ32, роли фаговых белков gp79 и gp36 во временной регуляции экспрессии генов фага РЫ32 и изучение механизма действия gp79 на РНКП.
Научная новизна и практическая ценность
В работе была создана коллекция плазмид, кодирующих все возможные единичные единичныезамены аминокислот микроцинв J25, определены позиции микроцина J25, важные для созревания антибиотика, его транспорта в клетку и ингибирования РНКП. Впервые был обнаружен ряд производных микроцина J25 с повышенной и расширенной антибактериальной активностью, ставших основой для патента (патент США 7,442,762). Результаты показывают, что микроцин J25 и его производные могут быть использованы для разработки новых антибактериальных веществ с повышенной активностью и расширенным спектром действия. Одно из производных микроцина J25, полученное в ходе данной работы, в перспективе может быть использовано как антибактериальный консервант в пищевой промышленности (неопубликованные данные). Микроцин J25 активен против патогенных штамов Salmonella, Shigella и Е. coli, включая 0157:Н7, который наиболее часто вызывает
пищевые отравления. Однако, микроцин J25 дикого типа устойчив к протеолитичесим ферментам желудка и кишечника и, таким образом, остается антибиотически активным в пищеварительном тракте, что может быть губительно для нормальной микрофлоры кишечника. Было показано, что замена глицина в положении 12 на тирозин не влияет на активность микроцина, но делает его чувствительным к желудочным протеазам. Показан механизм действия и определено место связывания сорангицина с РНКП, продемонстрировано, что сорангицин обладает конформационной подвижностью, позволяющей ему адаптироватся к изменениям РНКП в месте связывания. Эти данные демонстрируют, что принцип конформационной адаптации может быть использован как важный критерий отбора лигандов при поиске антибактериальных агентов, действующих на РНКП. Установлено ингибирующее действие нового небольшого белка gp79 бактериофага РЫ32 на РНКП Е. coli. Данные показывают, что бактериофаги могут быть использованы как источник генов, кодирующих нобые ингибиторы бактериальной РНКП.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих
