Содержание к диссертации
Введение
Глава I. 30S СУБЧАСТИЦА РИБОСОМ E.coli (Обзор литературы) 5
1.1. Функции 30S субчастицы в процессе инициации трансляции 5
1.2. Структура 30S субчастицы 13
1.2.1. Пространственная структура 166 РНК. 14
1.2.2. Белки 30S субчастицы 17
1.2.3. Модели 30S субчастицы 23
1.2.4. Расположение рибосомных белков в составе 303 суб частицы 25
1.2.5. Расположение I6S РНК в составе 30$ субчастицы 29
1.2.6. Участки связывания лигандов на 305 субчастице 31
1.3. Конформационные изменения 30S субчастицы 35
Глава II. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ I6S НЖ И тРНК С РИБОСОМНЫМИ БЕЛКАМИ МЕТОДОМ УФ-ЖДУЦИРОВАННЫХ РНК-БЕЛКОВЫХ СШИВОК.
(Обсуждение результатов) 41
2.1. Метод УФ-индуцированных полинуклеотидбелковых сшивок 41
2.1.1. Принцип метода 41
2.1.2. Применение метода УФ-индуцированных сшивок 44
2.1.3. Двухкомпонентные нуклеопротеидные комплексы 46
2.1.4. Многокомпонентные нуклеопротеиды 54
2.2. РНК-белковые контакты в аналогах 30- инициаторного комплекса 58
2.2.1. Введение 58
2.2.2. Получение и характеристжа тройных комплексов
2.2.3. Условия облучения и характеристика облученных тройных комплексов 62
2.2.4. Определение белков 30S субчастицы рибосом E.coli пришивающихся к I6S
FHK в составе комплексов 1,11,111. 64
2.2.5. Определение рибосомных белков, пришивающихся к тРНК в составе комплексов
1,11, III 69
2.3. Получение и свойства мономеркурированпной тЖС 77
2.3.1. Меркурирование тРНК 78
2.3.2. Демеркурирование полимеркурированной тРНК в неденатурирующих и денатурирующих условиях ^4
2.3.3. Свойства мономеркурированной тРНК 89
2.3.4. Взаимодействие с белками немодифицирован-ной и мономеркурированной NAcPhe-тРНК в комплексе с поли(D)-заряженными 30S субчастицами рибосом b.colt 92
Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 95
ВЬВОДЫ 114
ЛИТЕРАТУРА 116
- Функции 30S субчастицы в процессе инициации трансляции
- Метод УФ-индуцированных полинуклеотидбелковых сшивок
Функции 30S субчастицы в процессе инициации трансляции
305 субчастица, являясь составной частью 705 рибосомы, функционирует в её составе на всём протяжении процесса трансляции. Однако, на первом этапе трансляции;— стадии инициации, она функционирует как отдельная, самостоятельно существующая субчастица. В данном обзоре мы рассмотрим функции 30S субчастицы только при инициации.
Важнейшей функцией 30S субчастицы при инициации является избирательное узнавание на мРНК истинных мест инициации и корректное её связывание. Впервые Лодиш /2/ показал, что именно 30S субчастица играет основную роль в этом процессе. В дальнейшем ряд экспериментов /3-5/ подтвердил гипотезу об основной роли 305 субчастицы в избирательном связывании мРНК. Показано, что 305 субчастица протектирует от нуклеазного гидролиза тот же фрагмент мРНК, что и 70S рибосома /б/. Таким образом, представление об основной роли 30S суб частицы в декодировании является общепринятым на сегодняшний день. Вклад 50S субчастицы в точность инициации заключается в фиксировании, "замораживании" комплекса малой субчастицы с мРНК /7/. Так как 30S субчастица функционирует как отдельная субчастица при инициации, мы остановимся подробнее на основных событиях, происходящих на этой стадии.
Метод УФ-индуцированных полинуклеотидбелковых сшивок
В настоящей работе с помощью метода УФ-сшивок были определены РНК-белковые контакты в рибосомном комплексе, моделирующем 30S -инициаторный комплекс. Для того, чтобы объяснить, почему именно этот метод был использован нами для нашей работы, остановимся на нем несколько подробнее. 2.1,1. Принцип метода.
В начале 60-х годов-было показано, что облучение УФ-светом нуклеопротеидов приводит к образованию полинуклеотид-белковых сшивок /157,158/ . Сущность этого явления заключается в том, что при поглощении УФ-кванта (Л =254нм) происходит электронное возбуждение соответствующих остатков, которое параллельно с излу-чательной и/или безизлучательной релаксацией, может вступать в различные химические реакции-нуклеофильные, электрофильные и радикальные. Реакция между возбужденным и сближенным с ним остатками может привести к образованию ковалентной связи, в частности, сшивки между двумя макромолекулами.
Разница в спектральных свойствах нуклеиновых оснований и белков ( УФ-свет в диапазоне 250-280нм поглощается нуклеиновыми основаниями и ароматическими аминокислотами, содержание которых в белках обычно мало / 52/) приводит к преимущественному возбуждению нуклеиновых оснований в нуклеопротеидах. Поэтому, по крайней мере один из сшивающихся под действием УФ-света остатков является нуклеиновым основанием. Вторым компонентом сшивки может быть аминокислотный остаток или нуклеиновое основание той же по линуклеотидной цепи (образование пиримидиновых димеров) или другой цепи. Образование сшивок между остатками двух разных поли-нуклеотидных цепей наблюдали только в нескольких случаях /59,159/. Больыая же часть межмолекулярных УФ-индуцированных сшивок в нук-леопротеидах полинуклеотид-белкового типа.
Образование полинуклеотид-белковых сшивок может идти: I.через образование промежуточных продуктов с большим временем жизни, и 2. -непосредственно через возбужденное состояние. Примером первого случая может быть образование сшивок с цитозином, где это может быть вторичным темновым процессом, возникающим после фото-индуцироваиного присоединения молекулы воды по С5-С6 двойной связи /160/. В этом случае мы не можем утверждать что сшивка произошла между сближенными в составе нативного нуклеопротеида остатками, т.к. химическая модификация остатка меняет структуру полинуклеотида, и даже если это изменение локально, оно может Г-енять относительное расположение сшивающихся компонентов друг относительно друга.
