Введение к работе
Актуальность проблемы. Экспрессия на поверхности и секреция в среду белков и других биополимеров определяет патогенность бактерий, клеточно-клеточное узнавание, разложение высокомолекулярных соединений,взаимодействие клеток микроорганизмов с другими микро-и макроорганизмами. Понимание механизма транслокации белков через клеточную оболочку весьма актуально, т.к. необходимо для решения не только указанных выше фундаментальных проблем клеточной биологии, но также и практических задач современной биотехнологии. Особенно важно решение этой проблемы применительно к грамотрица-тельным бактериям, в частности, Escherichia coll. Эта бактерия имеет сложную оболочку, состоящую из цитоплазматической и внешней мембран, разделенных периплазмой и пептидогликановым слоем. Поэтому, большинство секретируемых белков E.coll локализуется в периплазме и только несколько белковых токсинов выделяется в культуральную жидкость. Понять как преодолевается этими белками оболочка E.coll - актуальная фундаметальная проблема. Кроме того, эта бактерия используется в качестве организма хозяина для экспрессии многих чужеродных белков, представляющих интерес для медицины и промышленности, и , таким образом, вывод белков из клеток E.coll в культуральную жидкость является важной задачей биотехнологии.
В связи с этим значительный интерес представляет феномен секреции в культуральную жидкость периплазматических белков E.ooli, кодируемых генами в составе плазмид. Обнаруженный недавно лишь для нескольких белков (Morita, et al., 1983; Lazzaroni, et al., 1985; Несмеянова и др., 1990) он позволяет предположить о существенных изменениях, как в биогенезе белков при их повышенном синтезе, так и в структурной организации клеточной оболочки, становящейся проницаемой для периплазматических белков, и представляет, таким образом, удобную модель для изучения указанных процессов, а также механизма секреции белков в культуральную жидкость. Однако, до настоящего времени подробных исследований в этом направлении не проводилось.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей биогенеза щелочной фосфатази E.coll, механизма ее секреции в культуральную жидкость и роли оболочки в этом процессе при повышенном синтезе этого фермента, кодируемого phoA геном в составе плазмид. В соответствии с целью были определены следующие задачи исследования:
1) Изучить особенности продукции, локализации и спектра множественных форм щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе.
-
Выделить и охарактеризовать различные формы фермента.
-
Выявить особенности ультраструктурной организации и химического состава оболочки клеток, секретирующих фермент в среду.
Научная новизна работы. Работа является первым комплексным исследованием биогенеза и секреции экзобежов при их повышенном синтезе. Установлено, что при повышенном синтезе периплазматичес-кой щелочной фосфатазы, кодируемой phoA геном в составе мультико-пийных плазмид, происходят существенные изменения в ее биогенезе: образование промежуточных форм фермента, соответствующих различным стадиям его посттрансляционной модификации, и альтернативная локализация фермента. В этих условиях происходит накопление предшественника щелочной фосфатазы, содержащего сигнальный пептид, в виде нерастворимых агрегатов в цитоплазме E.coli. Зрелая щелочная фосфатаза имеет более высокое содержание изоформ і и и, а также растворимых мультимеров, которые локализуются не только в периплазме, но и в культуральной жидкости. С помощью биохимического и электронно-микроскопического анализа оболочки клеток установлено, что механизм секреции фермента в среду зависит от природы штамма и характеризуется специфическими для каждого штамма изменениями в химическом составе и ультраструктурной организации оболочки. У E.coli К802 выявлена секреция щелочной фосфатазы в культуральную жидкость с помощью везикул внешних мембран, которая коррелирует со снижением у секретирующих клеток содержания липопротеина внешних мембран. У E.coli DH1 выделение этого фермента в культуральную жидкость происходит другим путем.
Внеклеточная щелочная фосфатаза, а также предшественник щелочной фосфатазы выделены и очищены до гомогенного состояния из одной и той же культуры и изучены их некоторые свойства.
Научно-практическое значение работы. В работе выявлены закономерности биогенеза и секреции щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе у E.coli, а также особенности химического состава и структурной организации оболочки этой бактерии в условиях секреции периплазматических белков через клеточную оболочку. Это позволяет лучше понять механизмы секреции белков в среду у грам-отрицательных бактерий, отдельные этапы секреторного процесса и его взаимосвязи с биосинтезом белка, а также открывает возможность для выработки стратегии вывода белков из клетки в биотехнологических целях.В работе охарактеризованы штаммы-продуценты внеклеточной щелочной фосфатазы и ее предшественника,разработаны методы очистки указанных форм фермента. Таким образом, созданы ос-
новы для получения в больших количествах фермента с целью его ис пользования в генной инженерии и иммуноферментном анализе, а также предшественника щелочной фосфатази для исследований в области мембранологии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных симпозиумах: "Molecular genetics of bacteria and phages" (Cold Spring Harbor, США, 1991) и "Cellular and molecular biology of phosphate and phoshorylated compounds in microorganisms" (Woods Hole, Massachusetts, СІЛА, 1993), на конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, 3-х глав экспериментальной части, 1 главы обсуждения результатов, выводов и списка литературы (236 ссылок). Работа изложена на 179 страницах, содержит 12 таблиц и 27 рисунков.
