Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Секретируемые белки бактерий и особенности их биосинтеза 8
1. Секретируемые белки бактерий 8
2. Особенности биосинтеза секретируемых белков II
3. Природа предшественников секретируемых белков 14
ГЛАВА II. Щелочная фосфатаза E.coli - секретируемнй фермент. 23
1. Структура и свойства щелочной фосфатази 23
2. Особенности биосинтеза щелочной фосфатази, как мембраносвязанного процесса 30
ЭКСЖРИМЕНТАЛШАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА III. Методы исследования 35
1. Используемый штамм и его свойства 35
2. Условия выращивания культуры 35
3. Получение растворимой фракции и мембран 36
4. Солюбилизация мембраносвязанной щелочной фосфатази различными агентами 37
5. Выделение и очистка периплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы 38
6. Разделение множественных форм перишіазглатической щелочной фосфатазы 40
7. Электрофоретические системы . .41
8. Определение молекулярной массы щелочной фосфатази с помощью гельфильтрации на сефадексе С-200 43
9. Снятие ультрафиолетовых спектров 43
10. Хроматография на октил-сефарозе .43
11. Обратимая денатурация щелочной фосфатазы 44
12. Взаимодействие щелочной фосфатазы с искусственными фосфолипидными мембранами
13. Аналитические методы 45
14. Реактивы 48
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА ІV. Выделение и очистка перишіазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы E«coli 50
1. Выбор оптимальных условий для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы 51
2. Выделение и очистка перишіазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы
3. Разделение множественных молекулярных форм перишіазматической щелочной фосфатазы 57
ГЛАВА V. Сравнительное иззгчение некоторых физико-химических и кинетических свойств мембраносвязанной и перишіазматической щелочной фосфатазы Е. coli 62
1. Молекулярная масса 63
2. Ультрафиолетовые спектры 68
3. Оптимум рН . 70
4. Влияние температуры, ионной силы и катионов металлов 72
5. Субстратная специфичность и ингибирование 77
6. Амфифильные свойства 86
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .III
ЛИТЕРАТУРА 117
- Секретируемые белки бактерий
- Структура и свойства щелочной фосфатази
- Используемый штамм и его свойства
- Выбор оптимальных условий для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы
- Молекулярная масса
Введение к работе
Одной из актуальных проблем современной биологии является изучение механизма переноса белков через биологические мембраны. Она включает такие вопросы, как локализация биосинтеза секрети-руемых белков, механизм транслокации белков через мембрану, а также механизмы регуляции биосинтеза, секреции и посттрансляционной модификации белков.
Исследование этих вопросов является важным звеном в решении ряда таких фундаментальных проблем, как сборка и функционирование биологических мембран, а также в решении некоторых практических задач, так как секретируемые белки (гидролазы, токсины, детоксифицирующие ферменты) имеют большое экономическое значение.
В последние годы эта проблема интенсивно исследуется, и к моменту начала настоящей работы многие вопросы, касающиеся биосинтеза и секреции экзобелков, были выяснены. Показано, в частности, что большинство секретируемых белков у прокариот синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах в виде предшественников большего размера с дополнительной гидрофобной последовательностью на її -конце полипептидной цепи и транслоцируется через мембрану по мере своего синтеза, как растущие полипептидные цепи. Процессинг предшественников осуществляется с помощью мембраносвязанных сигнальных пептидаз после "пересечения" белком мембраны. Доказана важная роль сигнального пептида в транслокации белка через мембрану (Inouye , Halegoua , 1980; Wickner , 1980).
Предложено несколько моделей секреции. Самая ранняя "сигнальная" гипотеза (Blobei , Dobbersten , 1975) предполагает транслокацию белка через белковый канал, образуемый специфическими рецепторними белками мембран при взаимодействии сигнального пептида оекретируемых белков с мембранами. Согласно большинству других моделей (inouye , Halegoua , 1980; Wickner , 1980; von Heyne ,Biomberg , 1979), транслокация осуществляется непосредственно через лшшдный бислой. Так "мемррано-триггерная" модель предполагает самосборку изменяющейся белковой конформации при переходе белка из водного компартмента в мембранный. В настоящее время предложена модель транслокации белка, сопряженной с транслокацией фосфолипидов (Несмеянова, 1982).
Однако, несмотря на значительные успехи в понимании процесса секреции, многие вопросы остаются неясными. К ним относятся, в частности, вопросы, касающиеся природы и свойств мембраносвя-занных форм растворимых экзобелков, решение которых также необходимо для понимания процесса секреции. К моменту начала настоящей работы эти вопросы были в определенной степени изучены лишь для пенициллиназы B.iicheniformis , у которой количество мемб-раносвязанной формы составляет до 50$ от общего количества этого секретируемого белка, что несомненно облегчило задачу изучения мембраносвязанной формы. Сравнительное изучение структуры и физико-химических свойств этих форм фермента показало, что мембра-носвязанная форма является предшественником растворимой (Sargent et al. , 1968; Lampen , 1967).
Что касается оекретируемых белков грам-отрицательных бактерий, то они не содержат значительное количество мембраносвязан-ных форм. Попытки препаративного выделения мембраносвязанных форм оекретируемых белков грам-отрицательных бактерий ранее предприняты не были и такая задача была поставлена в настоящей рабо- ~ 6 - те на примере секретируемой щелочной фосфатази E.coli . Ранее небольшое количество этого фермента (до 1%) было обнаружено в прочно связанном с мембранами состоянии (Несмеянова и др.,1975; Северин и др., 1976).
Целью настоящей работы явилось препаративное выделение и сравнительное изучение мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы - секретируемого белка E.coli .
В работе были поставлены следующие конкретные задачи:
Отработать оптимальные условия для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы.
Провести выделение в препаративных количествах и очистку до электрофоретически гомогенного состояния мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы.
Провести сравнительное изучение ряда физико-химических и каталитических свойств этих форм щелочной фосфатазы.
В результате проведенных исследований подобраны оптимальные условия для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы, ато позволило выделить эту форму в препаративных количествах. Выделены и очищены до электрофоретически гомогенного состояния мембраносвязанная и множественные молекулярные формы периплазматической щелочной фосфатазы.
Показано, что мембранная форма имеет более выраженные ам-фифильные свойства по сравнению с растворимой формой. В то же время щелочная фосфатаза, подобно ряду других зрелых форм секре-тируемых белков, имеет определенные амфифильные свойства по сравнению с дитоплазматическими растворшлыми белками. Сходство ряда физико-химических и кинетических свойств изученных форм фермента указывает на идентичность структуры и каталитически активных конформандй и свидетельствует о единстве их природы.
По субстратной специфичности наибольшее сходство обнаружено меаду мембраносвязанным ферментом и изоформой I дериплазмати-ческого фермента, которая, как известно, синтезируется первой ( Schiesinger , Andersen , 1968). Эти данные указывают на то, что мембранная форма является предшественником растворимого фермента.
Секретируемые белки бактерий
В настоящее время под секрецией белков у бактерий подразумевается трансмембранное передвижение белков, а все белки, подвергающиеся этому процессу, считаются секретируемыми или экзо-белками (Glenn , 1976). У грамположительных бактерий, оболочка которых состоит из цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, большинство секре тируемых белков выделяется в окружающую среду (Glenn , 1976; Ramaley , 1978). Секретируемые белки грамот-рицательных бактерий составляет оообенно обширную группу. Эти бактерии имеют более сложную структуру оболочки, которая состоит из цитоплазматической мембраны, пептидогликанового слоя или клеточной стенки, внешней мембраны и расположенного между цитоплазматической и внешней мембранами периплазматического пространства ( Freer, Salton , 1967; Costerton et al. , 1974; Di Rienzo et al , 1978).
Как белки внешней мембраны, так и белки периплазмы синтезируются с внутренней стороны цитоплазматической мембраны и транслоцируготся через мембрану к месту своей окончательной локализации, являясь, таким образом, секретируемыми. Кроме перечисленных выше секретируемых белков, следует упомянуть еще и о ряде белков, локализованных в цитоплазматической мембране. Это синтезируются в шфипдрованной фагом клетке Е.СОІІ » а затем встраиваются в цитоплазматическую мембрану ( wickner 1976) При изучении механизмов биосинтеза и внедрения этих белков в мембрану выявлены закономерности общие с таковыми для секретируемых белков. Поэтому следует принять во внимание и эту группу белков, не являющихся секретируемыми по определению. Во внешней мембране обнаружено до 20 белков (Di Кіеп-ад , inoye , 1979; Booth , 1980; Lugtenberg ,1981), составляющих 60% белка оболочки (Di Kienzo.et al. , 1978). Некоторые из них, так называемые основные белки, являются преобладающими. К ним относятся мат-риксные белки или порины ( Rosenbush, I974;wakae , 1976) продукты omp.p и omp с генов. Эти белки имеют ряд общих химических и функциональных свойств и прочно связаны с пептидогликаном (Rosen -bush , 1974; bugtenberg , 1977), будучи изолированными, они также взаимодействуют с ним. Белки имеют сходный аминокислотный состав (Henning et al. , 1977). Матриксные белки участвуют в образовании пор для пассивной диффузии гидрофильных веществ (Hancock et al. , 1975; Пакае et al. , 1979) , а также в рецепции фагов (Poulds , Chai , 1978; Luckey , Hikado , 1980).
Структура и свойства щелочной фосфатази
Всестороннему изучению структуры и функции фермента способствовал тот факт, что щелочная фосфатаза оказалась локализованной в периплазматическом пространстве клетки ( Heppel , 1971), расположенном между плазматической мембраной и клеточной стенкой (маїащу , Horecker , 1961). Такая локализация обеспечивала сравнительно легкую очистку фермента.
Структура и свойства щелочной фосфатазы E.coli в настоящее время довольно хорошо изучены. Щелочная фосфатаза обладает четвертичной структурой и состоит из двух идентичных субъединиц (Rothman , Byrne , 1968), с молекулярной массой 43000 каждая (Schiesinger , Barrett , 1965). Фермент активен только в состоянии димера и при разрушении четвертичной структуры полностью
ИНактИВИруется (Schiesinger ,Levithal , 1963). Конформация фермента определяется целым рядом факторов: величиной рН, концентрацией цинка, действием различных химических соединений (Reid , Wilson , 1971).
В активной молекуле щелочной фосфатазы присутствуют цинк (4+0,3 г- а/молекулу), магний (1,3+0,2 г-а/молекулу) (Bosran et» al., 1975), а также железо (Simpson et al. , 1968). Два прочно связанных иона пинка, так называемые "каталитические", по одному на каждую из идентичных субединиц, требуются для связывания ортофосфата и образования ковалентного фосфопротеинового интер-медиата (Appiebury , Coleman , 1969). Фермент способен также специфически связывать дополнительную пару "структурного" цинка, который, как предполагают, стабилизирует третичную или четвертичную структуру фермента ( Harris, Coltman , 1968; Reynolds, Schiesinger , 1969) и от одного до двух ионов магния, которые необходимы для поддержания структурной стабильности и каталитической активности фермента ( Simpson et al, 1968). Последовательность аминокислот в активном центре щелочной фосфатазы -Asp -Ser Р-АЗа.Считают, что серии, входящий в активный центр, при низких значениях рН фосфорилируется в присутствии неорганического фосфата ( Sonwartz, 1963; Zweig , Milstein , 1964).
Используемый штамм и его свойства
Объект нашего исследования - клетки Escherichia coli.
В работе использовали штамм E.coliC-90 ( pho т ), который осуществляет не репрессируемый синтез щелочной фосфатази, т.е. синтезирует большое количество фермента при избытке ортофосфата, имеет мутацию в гене, ответственном за транспорт ортофосфата ( Kida, 1974). Этот штамм любезно предоставлен д-ром А.Торриани (Массачусетский технологический институт, США.).
Выбор оптимальных условий для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы
Как указывалось выше, небольшая часть щелочной фосфатази была обнаружена в прочно связанной с мембранами форме, так что фермент не освобождался из мембран при гельфильтрации и центрифугировании в градиенте сахарозы (Несмеянова и др., 1966). Для выбора условий его солюбилизации мы сравнили действие целого ряда агентов, широко используемых для выделения различных мембраносвя-занннх ферментов: 0,5$ дезоксихолата натрия, 0,1$ и 0,2$ тритона Х-100, 0,002 М ЭДТА И I М ХЛОРИСТОГО магния (Yamamoto, Lampen, 1967; Ghosh, Ghosh, 1972; llelson et al , 1974).
Как видно из таблицы 3, все испытанные агенты вызывают незначительную солюбилизацию мембранных белков: от 0,2$ - 0,002 И ЭДТА до 8$ - 0,5$ дезоксихолат натрия и в различной степени действуют на активность мембраносвязанного фермента. Наиболее сильный эффект оказывает 0,2$ тритон Х-100, понижая активность мембраносвязанной щелочной фосфатази до 22$ от исходной.
Молекулярная масса
Одной из важнейших характеристик белков является молекулярная масса. Для многих предшественников прокариотических секретируемых белков показано, что они синтезируются в форме, которая на 2000-3000 дальтон превышает по молекулярной массе соответствующие растворимые белки, причем дополнительная последовательность находится на и -конце полипептидной цепи ( Hardy, Randall, 1978).
Ранее было показано, что предшественник щелочной фосфатазы, синтезированный в системе in vitro , также превышает растворимую форму на несколько тысяч дальтон (inouye , Beckwith, 1977). В задачу нашей работы входило изучение молекулярной массы мембра-носвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы.
Молекулярную массу определяли гельфильтрацией на сефадексе G -200 и электрофорезом в ІШГ по методу Вебера и Осборн (Weber, ОаЪогп , 1968), как описано в Методах исследований.
При гельфильтрации на сефадексе G -200 различий в молекулярной массе мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы обнаружено не было. В данных условиях определения молекулярная масса этих форм фермента не отличалась от молекулярной массы продажной щелочной фосфатазы ("Sigma ") и была равна 196000 .
