Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА І. Структурные основы механизм активности аспартатных протеиназ (литературный обзор) 7
1.1. Аспартатные протеиназы. Основные характеристики различных представителей этого класса ферментов
1.1.1. Аминокислотный состав и сравнительный анализ первичных структур 8
1.1.2. Сравнительная характеристика пространственных структур 9
1.1.3. Некоторые представления об эволюционном развитии ферментов этого класса на основе сведений об их трехмерной структуре 17
1.2. Общие представления о строении активного центра аспартатных протеиназ 21
1.2.1. Специфические ингибиторы 22
1.2.2. Каталитически активные остатки 26
1.3. Структурные особенности изменения протеолити-ческой активности аспартатных протеиназ при различных химических модификациях функционально важных групп фермента 28
1.4. Специфичность аспартатных протеиназ 36
1.5. Рентгеноструктурные подходы к выяснению механизма действия аспартатных протеиназ 42
1.5.1. Изучение фермент-субстратных взаимодействий на основе исследований комплексов с ингибиторами и модельных построений с гипотетическими субстратами 42
1.5.2. Конформационная подвижность некоторых сегментов молекул аспартатных протеиназ
1.5.3. Некоторые представления о возможных механизмах действия аспартатных протеиназ 48
ГЛАВА II. Экспериментальная часть 52
2.1. Получение необходимого набора фаз для расчета разностных синтезов Фурье 52
2.1.1. Поиски новых тяжелоатомных производных пепсина 52
2.1.2. Получение трехмерного набора рентгеновских дифракционных данных для производного пепсина с соединением Pt (hi%)2 (лг 60
2.1.3. Определение координат тяжелых атомов для производного пепсина с соединением Финальный синтез Зурье пепсина, рассчитанный по фазам, полученным методом изоморфных замещений . 69
2.2. Получение рентгеновских экспериментальных данных для кристаллов комплексов пепсина с различными ингибиторами 72
2.2.1. Получение комплексов пепсина с соединениями: пара-бромфеноцилбромидом, 1,2-
эпокси-3-пара-изофеноксипропаном (Э1Ш1), метиловым эфиром дииод~-тирозил-дииодгирозина (ТирІ2~ТирІ2~0Ме), метиловым эфиром фенилаланил-дииод-^рирозина (Фен-Тир12-0Ме) 72
2.2.2. Сбор рентгеновских дифракционных данных для кристаллов комплексов пепсина с ингибиторами. Построение разностных синтезов Фурье 74
ГЛАВА III. Активный центр и сравнение его с другими активными центрами аспартатных протеиназ 78
3.1. Описание структуры активного центра пепсина 78
3.2. Сравнение структур активных центров пепсина и аспартатных цротеиназ из Rkisopus Ck'uiensis и Penlciltum Jantineftum . 83
3.3. Связывание этанола в активном центре пепсина 88
ГЛАВА ІV. Рентгеноструктурные исследовании комплексов пепсина с ингибиторами 93
4.1. Интерпретация разностных синтезов электронной плотности, рассчитанных по фазам, полученным методом изоморфных.замещений, для комплексов пепсина с ингибиторами 93
4.1.1. Комплексы пепсина с ЭПИП, п-бромфено-цилбромидом, ТирІ2-ТирІ2~0Ме 93
4.1.2. Комплексы пепсина с Фен-Тир-ОМе 96
4.2. Использование уточненных фаз для построения разностного синтеза электронной плотности ингибитора и уточнение модели ингибитора в молекуле пепсина 102
ГЛАВА V. Структурные аспекты ингибирования пепсина малыми молекулами и изменения его каталитических свойств в зависимости от длины субстрата 109
5.1. Ингибирувдие свойства этанола 109
5.2. Структурные особенности строения первичных мест связывания аспартатных протеиназ, определяющие их каталитические свойства по отношению к дипептидным субстратам 115
5.3. Структурные аспекты изменения каталитических свойств пепсина в зависимости от длины субстрата 121
Выводы 125
Литература 127
- Некоторые представления об эволюционном развитии ферментов этого класса на основе сведений об их трехмерной структуре
- Получение рентгеновских экспериментальных данных для кристаллов комплексов пепсина с различными ингибиторами
- Сравнение структур активных центров пепсина и аспартатных цротеиназ из Rkisopus Ck'uiensis и Penlciltum Jantineftum
- Структурные особенности строения первичных мест связывания аспартатных протеиназ, определяющие их каталитические свойства по отношению к дипептидным субстратам
Введение к работе
Исследование методами рентгеноструктурного анализа коми-* лексов ферментов с ингибиторами позволяет определить особенности фермент-субстратных взаимодействий и понять механизмы функционирования этих систем. Данные рентгеноструктурного анализа являются наиболее твердым фундаментом для построения теорий каталитической активности ферментов различных классов.
К аспартатным протеиназам относится группа ферментов, выполняющих важные функции в организме, начиная от метаболизма клеточных белков (катепсины), кончая такими физиологическими процессами, как пищеварение (пепсин, химозин), регуляция давления крови (ренин) . Последние годы ознаменовались интенсивным развитием исследований различных представителей этого класса. Для пяти из них, с помощью методов рентгеноструктурного анализа, установлены трехмерные структуры высокого разрешения, две из них - пепсин и химо-зин решены в лаборатории рентгеноструктурного анализа ИМБ АН СССР. Естественным продолжением этих исследований являются рентгено-структурные исследования комплексов пепсина с субстратоподобными ингибиторами, позволяющие установить стереохимические параметры ферментативной реакции, катализируемой аспартатными протеиназами. Для ферментов этого класса установлено, что они осуществляют общий основной катализ присоединения молекулы воды к гидролизуемой связи. Однако для построения точной теории о механизме действия ферментов необходимо прежде всего знание структуры активного центра фермента в терминах атомных координат и представления о количественных характеристиках фермент-субстратных взаимодействий.
В задачу данной работы входило выявление особенностей структуры активного центра пепсина, определяющих его специфич-ность и каталитические свойства по отношению к пептидным субстратам. Для этого проводились рентгеноструктурные исследования комплексов пепсина с ингибиторами и сравнение трехмерных струк^ тур активных центров нескольких представителей этого класса ферментов, а также установление структурных основ ингибирования пепсина малыми молекулами.
Некоторые представления об эволюционном развитии ферментов этого класса на основе сведений об их трехмерной структуре
Как уже отмечалось, активный центр аспартатных протеиназ расположен во впадине между доменами, поскольку именно здесь с помощью данных рентгеноструктурного анализа зафиксировано положение ингибиторов в молекуле белка: в пепсине - этилового эфира дииод-тирозил-дииод-тирозина /46/, в пенициллопепсине, эндотиапепсине, ризопуспепсине - 1,2-эпок-си-З(п-нитрофенокси) пропана (ЭПНП) /35,47,34,48/, а также специфического ингибитора аспартатных протеиназ - пепстатина /34,48, 49/.
Впадина активного центра довольно обширна, имеет трапецевидную форму, сужающуюся к спинке молекулы. Размеры ее вполне соответствуют биохимическим данным о связывании пентапептида в активном центре аспартатных протеиназ. Участок контакта двух доменов - А/«концевого и С-концевого образуют петли Bj и Bg, свисающие со стороны кавдого из доменов. На вершине каждой из петель находится по остатку каталитически активной аспарагиновой кислоты (Асп 32 и Асп 215).
Участие карбоксильных групп в функционировании ферментов этого класса предполагалось давно /50,51,52/. Во-первых, было известно, что все эти ферменты имеют оптимум каталитической активности в области кислых значений рН, в связи с чем существует альтернативное название для представителей этого класса ферментов - "кислые протеиназы". Попытки модифицировать каталитические активные группы специфическими реагентами для групп серина, цис-теина или ионов металла оказались безуспешными /53,54,55/. Однако, абсолютно все протеиназы этого класса ингибируются соединениями, взаимодействующими с карбоксильными группами - диазо- (реакция I) и эпокси- (реакция 2) соединениями. При взаимодействии свиного пепсина с дифенилдиазометаном /56/ происходила быстрая инактивация фермента. Изучение взаимодействия куриного пепсина /57/ с диазосоединениями: этиловый эфир диазоацетилглицина (ИЕТ), І-диазо-3-динитрофениламинопропанол-2 (ЙКГ), У1/-диазоацетил N -динитрофенил этилендиамин (ДЦЭ) - показало, что эти соединения алкилируют СООН группу пепсина с образованием сложнозфирной связи. Реакция обратима для соединений ЖГ и ДДЭ, то есть после отщепления ингибитора активность восстанавливается. В работе /58/ свиной пепсин инактивировался метиловым эфиром диазоацетилнорлейцина. Был выделен пептид Иле-Вал-Асп-Тре, содержащий этерифицированный остаток аспараги-новой кислоты.
Подобный пептид был получен и описан авторами /59,60/. После обработки диазосоединениями свиного пепсина был выделен пептид: Иле«Вал-Асп-Сер-Гли-Тре-Оер-, содержащий остаток активной аспара-гиновой кислоты. Такие же пептиды были выделены из хшлозина /61/, пенициллопепсина /62/, ризопуспепсина /63/ и некоторых других протеиназ. Оказалось, что диазосоединения реагируют с Асп 215.
Изучение взаимодействия пепсина с 1,2-эпокси-3-(п-нитрофен-окси) пропаном (ЭПНП) показало, что две молекулы ЭПНП ковалентно связаны с каждой молекулой фермента /64/. В присутствии дипептид-ного субстрата инактивация происходит значительно слабее, при этом модифицируется только одна карбоксильная группа активного центра пепсина. В работе /65/ был выделен пептид с модифицированной группой:
содержащий активную аспарагиновую кислоту 32. Интересные результаты получились в работе Танга и Чена /66/ по определению аминокислотной последовательности вокруг эпокси-реактивных участков в пепсине. Были выделены несколько пептидов, содержащих модифицированные каталитически активные группы бежа:
Получение рентгеновских экспериментальных данных для кристаллов комплексов пепсина с различными ингибиторами
Конформационная подвижность некоторых сегментов молекулы аспартатных протеиназ в области активного центра или в местах связывания субстрата, наблюдаемая при различных модификациях фермента или при исследовании кинетических параметров фермент-субстратных взаимодействий, отмечалась во многих исследованиях /128/. При связывании во вторичных местах активирующего трипептида Лей-Гли-Лей, наблюдались изменения в спектрах КД пенщиллопепси-на в области, характерной для остатков лизина и триптофана, что говорит о конформационных изменениях, затрагивающих эти остатки /129/. Такие же изменения происходят, по-видимому, при связывании дипептидных субстратов /130/.
При взаимодействии пенициллопепсина с ЭПНП изменяется положение Тир 75 /47/. Плоскость ароматического кольца Тир 75 становится параллельной плоокости р-нитрофенокси группе молекулы ЭПНП, связанной с Асп 32. В этом случае кольцо вращалось вокруг связи 0 -. Тир 75 расположен в петле (остатки 71-83), нависающей над активным центром фермента. Значительно более сильные движения этой петли были замечены при исследовании комплексов пеницилло-пепсина с пепстатином /127/. Перемещение атомов в районе остатков о Гли 76 и Асп 77 составило около 2,2 А. Боковая цепь Асп 77 и часть основной цепи в этой области сближаются с атомами, принадлежащими молекуле пепстатина, образуя с некоторыми из них водородные связи. Авторы работы предполагают, что движение петли необходимо для усиления фермент-субстратных взаимодействий в Pj положении субстрата.
Существование таких подвижных областей структуры в молекуле фермента, участвующих в связывании субстрата, может объяснить реакции амино- и ацил-транспептидации, катализируемые аспартатны-ми цротеиназами без образования ковалентного промежуточного соединения /ІЗІ-ІЗЗ/. Большую разницу между пепсином и пенициллопепсином (низкий выход продуктов реакции) в осуществлении реакций аминотранспептидации Джеймс и соавторы /127/ объясняют наличием вставки в пепсине четырех остатков в районе остатка Асн 290 по сравнению с пенициллопепсином, поскольку конформационные движения этой петли могут усиливать /От место связывания субстрата, аналогично тому, как движение петли 71-83 в пенициллопепсине при связывании пепстатина училивает место связывания A5J , образуя новые дополнительные фермент-субстратные взаимодействия. Однако, следует отметить, что данные Джеймса о подвижности петли 71-83 и тирозина 75 не находят подтверждения в работах.других исследователей. При изучении комплексов аспартатной протеиназы из Sndohia раіа$іііш с ЭПНП никаких движений Тир 75 обнаружено не было /36/. Также не были замечены движения петли 71-83 при исследовании комплексов пепстатина с ризопуспепсином /49/. По-видимому, существуют определенные различия в структурах и особенностях фермент-субстратных взаимодействий различных аспартатных протеиназ.
Многочисленные биохимические исследования специфичности, кинетических особенностей катализируемых реакций гидролиза, транс-пептидации, влияния химических модификаций различных функциональных групп на протеолитическую активность аспартатных протеиназ проводились с целью выяснения механизма действия ферментов этого класса. Этими исследованиями занимались во многих лабораториях /9,51,72,74,105-107,131,134/, однако единого мнения по этому вопросу пока нет. Данные рентгеноструктурного анализа о трехмерных структурах высокого разрешения некоторых представителей этого класса ферментов свидетельствуют о высокой степени гомологии пространственных структур этих молекул, что позволяет думать о едином механизме функционирования аспартатных протеиназ. Однако некоторые различия в имеющихся сейчас сведениях о взаимном расположении и взаимодействии групп в активных центрах ферментов могут быть связаны не только с особенностями их строения, но и с недостаточной точностью определения координат атомов. Поэтому пока можно говорить лишь о предполагаемых схемах каталитического процесса, осуществляемого карбоксильными протеиназами.
В работе /135/ Антоновым и соавторами было доказано, что пепсин функционирует по механизму общего основного катализа. Основной атакующей группой в механизме этого типа является вода, а карбоксилат-ион способствует отщеплению протона от молекулы воды. Эффективная атака водой может происходить в том случае, если карбонильная группа сильно поляризована. В работах /44,102,132, 49,127/ предполагается осуществление этой поляризации в аспартатных протеиназах за счет эффективного протонирования карбонильного атома кислорода протоном Асп 215. Этот протон, как показано в работах /102,127,126/, располагается между fi «карбоксильными группами Асп 32 и Асп 215.
Сравнение структур активных центров пепсина и аспартатных цротеиназ из Rkisopus Ck'uiensis и Penlciltum Jantineftum
Во-первых, времена экспозиции существенно уменьшаются, вследствие малых углов прецессии, используемых при съемке этим методом ( 2-3 вместо 21). Соответственно меньшее количество кристаллов требуется для получения полного экспериментального набора. Кроме этого, не требуется точная юстировка кристалла при без экранной съемке. Все это существенно ускоряет ход эксперимента. К недостаткам этого метода съемки следует отнести то обстоятельство, что из всех отражений, присутствующих на одной рентгенограмме, только часть может быть использована при формировании трехмерного массива данных. Во-первых, на рентгенограмме присутствует большой процент перекрывающихся отражений, принадлежащих разным плоскостям обратной решетки. Чтобы уменьшить количество перекрывающихся отражений кристалл нужно ориентировать таким образом, чтобы самая длинная его ось была направлена вдоль оси головки прецессионной камеры. Во-вторых, отражения от ненулевых плоскостей обратной решетки будут расщепляться, регистрируясь на рентгенограмме дважды, тем самым увеличивая процент перекрывающихся отражений /147/. И, наконец, некоторая часть отражений лишь частично регистрируется на рентгенограмме. Это происходит с узлами обратной решетки не пересекающими полностью сферу отражения. Частичные отражения отбрасываются при формировании трехмерного массива данных.
Впоследствии был разработан другой метод без экранной съемки - метод Арндта-Вонакотта, в котором недостатки метода без экранной прецессии устранены /148/.
Для обработки рентгенограмм, полученных прецессионным методом, с помощью имеющегося в нашей лаборатории автоматического денситометра фотоскана Р-1000, записывающего на магнитную ленту сведения об оптических плотностях почернения рентгенограммы, мы воспользовались комплексом программ, любезно предоставленным нам проф. Хубером / I49-I5I /. Этот комплекс программ был поставлен нами на вычислительной машине 1СL 4-10 и адаптирован для работы с нашим объектом, а затем успешно использован при обработке некоторой части рентгенограмм нативного фермента и производных, полученных методом экранной прецессии /40,152/.
Чтобы ускорить процесс получения экспериментального набора рентгеновских дифракционных данных для производного пепсина с соединением Pt(/\fW5)z Ctz мы решили использовать метод безэкранной прецессии. Процент полезной информации при съемке кристаллов белка этим методом в первую очередь зависит от параметров элементарной ячейки исследуемого объекта, а также от условий съемки. Нами были рассчитаны оптимальные параметры съемки для наших кристаллов (угол прецессии /И , расстояние кристалл-пленки в зависимости от начальной ориентации кристалла, угол поворота вокруг оси головки прецессионной камеры). Весь набор был получен с пяти кристаллов производного. Угол прецессии /U равнялся 3, угол & - 5, начальные ориентации ос - о, а@ - 0. При этом перекрывалось 3/4 независимой части дифракционного поля кристаллов производного. На рис. 10,II представлены рентгенограммы, полученные методом без экранной прецессии. На рис. 12 приведены распечатки программы по измерению интенсивностей отражений, на которых показано расположение и соотношение пика и фона некоторых отражений. Качество измеряемых интенсивностей определялось следующими R- факторами:
Приведение к единой шкале экспериментальных данных по производному пепсина с соединением P"t (И/Н3)2 проводилось методом Гамильтона-Роллера-Спаркса по соответствующей программе /153,154/. Входной информацией к программе являются величины г [nUj для отражений, общих в некоторой группе массивов. При этом не обязательно, чтобы каждая рентгенограмма имела перекрывающиеся отражения со всеми другими. На выходе этой программы были получены индивидуальные шкалы для всех снимков, и интенсивности отражений каждого из них подправлялись на соответствующий коэффициент.
Приведение к единой шкале трехмерных наборов производного и нативного белка проводилось по программе " /Scacfe-г " /154/. В результате расчетов были получены структурные амплитуды экспериментального набора производного Pt(/l/H3) C , подправленные на относительный шкальный множитель и на разницу в относительных температурных факторах двух наборов.
Для локализации мест присоединения тяжелых атомов был по строен трехмерный разностный синтез Фурье с коэффициентами - соответственно, модули струк турных амплитуд производного и нативного фермента, и с исполь зованием фаз рентгеновских отражений кристаллов нативного белка, найденных ранее /155,156,31,40/. Расположение пиков на этом разностном синтезе соответствовало трем главным местам присоеди нения тяжелых атомов в производном пепсина с ионом [ Pt (N0 J и новому месту присоединения , не наблюдавшемуся в ранее использовавшихся производных. Использование техники разностных и двойных разностных синтезов с одновременным исключе нием некоторых производных из расчета фаз подтвердило присутствие трех общих мест связывания соединения с ранее использованными тяжелоатомными добавками и наличие нового места связывания со значительным коэффициентом заполнения. Исключение любого из указанных мест присоединения из процесса совместного трехмерного уточнения параметров тяжелых атомов значительно ухудшало его показатели: ошибки замкнутости фазовых треугольников, величины стандартного и краутовского R -факторов. Параметры тяжелых атомов в производном пепсина с соединением Pt (/1/ Н3)г 11г , уточненные по программе Х.Мьюрхед /157/, приведены в таблице 5 . Как видно из таблицы, кроме наличия дополнительного места присоединения тяжелых атомов в новом производном имеется существенное перераспределение коэффициентов заполнения общих мест связывания с ионами платиновых реагентов (табл. 5 ив /40 ./ табл. 5 ).
Структурные особенности строения первичных мест связывания аспартатных протеиназ, определяющие их каталитические свойства по отношению к дипептидным субстратам
Ферменты, принадлежащие к семейству аспартатных протеиназ, имеют определенные особенности протеолитической активности по отношению к пептидным субстратам.
Аспартатные протеиназы из высших организмов способны гидро-лизовать дипептидные субстраты, обнаруживая при этом некоторую избирательность. Например, свиной пепсин проявляет высокую про-теолитическую активность по отношению к дипептидному субстрату Ац-Фен-ТирІ2 /177/. Куриный пепсин, гастриксин и химозин не гид-ролизуют этот субстрат, но обнаруживают активность к КБЗ-Глу-Тир /5,1 8,179/. Аспартатные протеиназы из низших организмов, в основном, не гидролизуют дипептидные субстраты, за исключением протеиназ из RhijSopus chinensi , Иисог miekei и Giacfosporium. Эти ферменты осуществляют гидролиз некоторых дипептидных субстратов, в частности субстрата Ац-Фен-ТирЪ,, со скоростью в 3 раза меньшей, чем пепсин /115/. Знание трехмерной структуры активного центра пепсина и комплексов его с ингибиторами дает возможность высказать некоторые предположения, объясняющие эти особенности функционирования ферментов.
Разница в способности аспартатных протеиназ из высших и низших организмов гидролизовать дипептидные субстраты, по-видимому, связана в значительной степени со структурными особенностями пакетов р и Si . Поскольку на сегодняшний день не существует прямых данных о структуре комплексов аспартатных протеиназ с истинными субстратами, нам кажется, что следует подробнее остановиться на современных представлениях об остатках, формирующих эти участки структуры, принимая во внимание и результаты, полученные в данной работе.
Как уже указывалось в гл. I (I.5.I), рентгеноструктурные исследования комплексов аспартатных протеиназ из Rkijgopus cki-nenSiS и PenicLuium lantinmum с пепстатином /49,127/, комплексов пенициллопепсина с ингибитором Ац-Про-Ала-Про-Ала-Фен /102/ показали, что молекула ингибитора располагается во впадине активного центра в вытянутой конформации. Предполагаемое положение расщепляемой связи - над остатками активных аспарагиновых кислот. Первичные места связывания образованы следующими остатками: $[ -Тир 189, Иле 213, Иже 301, Лей 299; - Лей 120, Тир 75, Трп 39. Необходимо обратить внимание на то обстоятельство, что связывание одного из остатков пепстатпна и молекулы ЭПИП в области 5 участка структуры пенициллопепеина приводило к значительным конформационннм движениям петли, содержащей остаток Тир 75. В кристаллах пепсина упаковка молекул такова, что значительные конформационные движения участка петли 71-83, происходящие при образовании комплекса пепсина с пепстатином, должны приводить к нарушению кристаллической структуры, что и подтверждалось экспериментально. Связывание молекул эпоксисоединения и дипептида TnpIgHpIg-OMe в структуре пепсина сопровождалось нарушением изоморфизма. Поскольку на обеих проекциях разностных синтезов электронной плотности, построенных для этих соединений, наблюдались максимумы в области (xz. ) проекции петли 71-83 и, учитывая результаты исследования комплексов пенициллопепсина с ЭПНР и пепстатином, можно предположить, что изменения в трехмерной структуре, обусловленные связыванием малых молекул именно в этой области молекулы пепсина, приводят к нарушению изоморфизма.
В кристаллах комплекса пепсина с дипептидом Фен-ТирIg-ЧШе не наблюдалось существенных отклонений от изоморфизма. Особенности связывания этого соединения в структуре пепсина подробно изложены в главе ІУ, 4.2. При наблюдаемой посадке дипептида предполагаемый S участок связывания субстрата остается свободным. Результаты этих экспериментов позволяют объяснить необычное положение, которое занимает остаток фенилаланина ингибитора Фен-npIg-OMe, при связывании его в моноклинных кристаллах пепсина. Расположение этого остатка в предполагаемом S месте привело бы к значительным конформационннм изменениям, обусловленным упаковкой молекул в кристаллах пепсина, в то время как существует другая возможность его размещения, обеспечивающая гидрофобные и другие электростатические взаимодействия без особых нарушений кристаллической структуры. В то же самое время очевидно, что гидрофобный пакет, вмещающий остаток фенилаланина при связывании Фен-Тир -ОМе, не может вместить кольцо иодированного тирозина, так как эта область структуры обладает существенно меньшей подвижностью, чем область петли 71-83.
Расположение молекул этанола в активном центре фермента свидетельствует в пользу продуктивного связывания субстрата с положением расщепляемой пептидной группы над остатками активных аспарагиновых кислот. Известно, что этанол является конкурентным ингибитором для дипептидных субстратов пепсина с ароматическими боковыми группами. В этой связи особое значение приобретают гидрофобные взаимодействия первой и второй молекул спирта с Иле 301 и Лей 120, которые входят в состав остатков, формирующих предполагаемые пакеты S{ и S{ . Учитывая все вышесказанное, в своих дальнейших рассуждениях мы будем придерживаться мнения, что истинный дипептидный субстрат связывается в ферменте над остатками активных аспарагиновых кислот в соответствующих гидрофобных карманах 5 и S± , описанных выше. Рассмотрим особенности их строения.
