Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 9
Часть 1. Характеристика нуклеозидфосфорилаз из различных видов организмов 9
1. Введение 9
2.1. Нуклеозидфосфорилазы, мономер которых состоит из одного домена 12
2.1.1. Общая характеристика 12
2.1.2. Аминокислотные последовательности 15
2.1.3. Рентгеноструктурные исследования 19
2.1.4. Активный центр 23
2.2. Нуклеозидфосфорилазы, мономер которых состоит из двух доменов 30
2.2.1. Общая характеристика 30
2.2.2. Аминокислотные последовательности 34
2.2.3. Рентгеноструктурные исследования 36
2.2.4 Активный центр 39
3. Заключение 42
Часть 2. Методы кристаллизации белков 44
1. Введение 44
2.1. Кристаллизация в объеме 46
2.2. Кристаллизация диализом 47
2.3. Кристаллизация методом диффузии паров растворителя 48
2.4. Кристаллизация на подложке 50
2.5. Кристаллизация в геле 51
2.6. Кристаллизация в невесомости 53
2.7. Кристаллизация в центрифуге 56
3. Автоматизация экспериментов по кристаллизации 57
Экспериментальная часть 59
1. Материалы 59
1.1. Химические материалы 59
1.2. Биологические материалы 59
2. Методы 59
2.1. Выделение и очистка уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium 59
2.2. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium 62
2.3. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов 63
2.4. Получение наборов дифракционных данных 64
2.5. Определение структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium 66
2.6. Определение структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium вкомплексес аналогами субстратов 70
2.6.1. Комплекс уридинфосфорилазы S. typhimurium с урацилом и ионом сульфата 70
2.6.2. Комплекс уридинфосфорилазы S. typhimurium с уридин- 5-монофосфатом и ионом сульфата 71
Результаты и их обсуждение 72
1. Получение гомогенного препарата уридинфосфорилазы S. typhimurium 73
2. Кристаллизация уридинфосфорилазы 5. typhimurium 76
3. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов 77
4. Сбор дифракционных данных с кристаллов уридинфосфорилазы S. typhimurium и определение пространственной структуры фермента 79
5. Структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium 82
6. Активный центр фермента 87
6.1. Место связывания урацила 90
6.2. Место связывания иона фосфата 92
6.3. Место связывания рибозы 93
5. Выводы 95
6. Список литературы 96
Благодарности 110
- Аминокислотные последовательности
- Кристаллизация методом диффузии паров растворителя
- Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов
- Сбор дифракционных данных с кристаллов уридинфосфорилазы S. typhimurium и определение пространственной структуры фермента
Введение к работе
Способность клеток поддерживать постоянный запас пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов зависит от процесса синтеза нуклеотидов из имеющихся готовых продуктов или de novo. Относительная важность любого из этих двух синтезов в сохранении нуклеотидного запаса различна и зависит от клеток и типов тканей. Нуклеозидфосфорилазы обеспечивают клетку пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, которые могут использоваться альтернативно синтезу de novo.
Биомедицинский интерес к нуклеозидфосфорилазам возник из их ключевой роли в нуклеотидном метаболизме и их необходимости для нормальной клеточной функции. Нуклеозидфосфорилазы привязаны к клеточному уровню свободных оснований и нуклеозидов, катализируя их взаимопревращение. Они участвуют в метаболизме противораковых и противовирусных препаратов, являющихся аналогами нуклеозидов. Было предположено, что ингибиторы специфичные к нуклеозидфосфорилазам могут усиливать действие определенных нуклеозидных аналогов при химиотерапевтическом воздействии, предотвращая их разрезание и последующую инактивацию.
Нуклеозидфосфорилазы разделяют на два семейства: пуриновые нуклеозидфосфорилазы, расщепляющие как гуаниновый, так и адениновый нуклеозиды, и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы, которые делятся на два типа: уридинфосфорилазу и тимидинфосфорилазу. Расщепление цитидина не описано до сих пор. К настоящему моменту наиболее изученными являются пуриновые нуклеозидфосфорилазы и тимидинфосфорилазы. Последние данные об исследованиях нуклеозидфосфорилаз приведены в первой части литературного обзора данной диссертации.
Существование уридинфосфорилаз впервые было установлено в 1952 году (1), но до сих пор эти ферменты остаются наименее изученными. Одним из подходов к установлению механизма действия ферментов является сравнительное изучение особенностей структурно-функциональной организации этих белков, выделенных из различных организмов. До настоящего момента была известна только пространственная структура уридинфосфорилазы Escherichia coli. Это была первая пространственная структура для ферментов данного типа. Было показано, что фермент состоит из шести одинаковых мономеров молекулярной массой 27 кДа. Каждый мономер представляет собой однодоменный белок а/р типа. В настоящей диссертации изучалась структура уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium. При сходстве аминокислотных последовательностей уридинфосфорилаз S. typhimurium и Е. coli, тем не менее, наблюдается существенное отличие в их ферментативных свойствах. В частности, уридинфосфорилаза S. typhimurium обладает более широкой субстратной специфичностью в отношении природных нуклеотидов и их аналогов по сравнению с ферментом из Е. coli. Кроме того, уридинфосфорилаза S. typhimurium обладает более высоким, чем ее аналог из Е. coli, сродством ко всем исследованным субстратам. Например, уридинфосфорилаза S. typhimurium связывается с тимидином в 4 раза сильнее, чем уридинфосфорилаза Е. coli (2).
Целью настоящей работы являлось определение пространственной структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium и комплексов этого фермента с аналогами субстрата уридин-5'-моно фосфатом и урацилом. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
- разработка методики выделения и очистки гомогенного препарата фермента уридинфосфорилазы S. typhimurium;
поиск условий кристаллизации и выращивание пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов нативного фермента и его комплексов с аналогами субстратов;
получение экспериментальных наборов рентгеновских интенсивностей с выращенных кристаллов с использованием синхротронного излучения;
~ определение и уточнение пространственной структуры нативного фермента и его комплексов с аналогами субстратов;
- анализ пространственной структуры активного центра
фермента.
Ранее в научно-исследовательском институте генетики и селекции
промышленных микроорганизмов была создана плазмида, несущая ген
уридинфосфорилазы S. typhimurium, и получен штамм-суперпродуцент
фермента. Используя этот продуцент, в данной работе была разработана
методика получения высокоочищенных препаратов уридинфосфорилазы
S. typhimurium в препаративных количествах. Полученный белок был
охарактеризован по подвижности в гель-электрофорезе в присутствии SDS и
в неденатурирующих условиях. Был проведен поиск условий кристаллизации
и получены пригодные для рентгеноструктурного анализа две
кристаллические формы фермента уридинфосфорилазы S. typhimurium. А
также были получены кристаллы комплексов уридинфосфорилазы S.
typhimurium с аналогами субстратов: ионом фосфата, урацилом и уридин-5 '-
монофосфатом. С полученных кристаллов были собраны наборы
дифракционных данных:
для нативного фермента — с разрешением 2.9 А и 1.7 А;
для комплекса с ионом фосфат - с разрешением 2.5 А;
для комплекса с урацилом и ионом сульфата - с разрешением 2.5 А;
для комплекса с уридин-5*-фосфатом и ионом сульфата - с разрешением 2.3 А
С использованием полученных наборов дифракционных данных были определены пространственные структуры нативного фермента и его комплексов с перечисленными выше соединениями. Полученные структуры позволили охарактеризовать активный центр фермента. Литературный обзор данной работы состоит из двух частей. Первая часть посвящена общей характеристике нуклеозидфосфорилаз. Подробно описана история открытия этих ферментов, первые исследования механизма катализа, а также новые данные о пространственных структурах нуклеозидфосфорилаз из различных организмов. Вторая часть литературного обзора посвящена методам кристаллизации.
Аминокислотные последовательности
К настоящему моменту именно этот тип нуклеозидфосфорилаз наиболее изучен. Ферменты, мономеры которых состоят из одного домена, обладают ос/р субъединичной укладкой белковой молекулы и, как правило, образуют четвертичную структуру, состоящую из трех или шести одинаковых субъединиц. Наиболее исследованными ферментами этого типа являются пуриновые нуклеозидфосфорилазы.
Впервые пуриновые нуклеозидфосфорилазы были выделены из тканей печени крысы в 1945 году, ферменты были охарактеризованы (10 - 13). Теперь описаны пуриновые нуклеозидфосфорилазы как из тканей млекопитающих, так и из различных бактериальных видов (14 - 21). Различают два вида пуриновых нуклеозидфосфорилаз. Трех субъединичные (рис.За), в которых каждая субъединица имеет молекулярную массу 31 кДа, такие фосфорилазы специфичны для гуанин и гипоксантин (2 -дезокси) рибонуклеозидов. И шести субъединичные пуриновые нуклеозидфосфорилазы (рис.3 б), которые имеют субъединицы с молекулярной массой -26 кДа и взаимодействую как с аденин, так и с гуанин и гипоксантин (2 -дезокси) рибонуклеозидами. нуклеозидфосфорилаза Plasmodium falciparum (PDB ГО: 1Q1G). К нуклеозидфосфорилазам, мономеры которых состоят из одного домена, можно также отнести уридинфосфорилазы и 5 -дезокси-5 -метилтиоаденозинфосфорилазы. Были описаны свойства уридинфосфорилаз из различных организмов. Показано, что эти ферменты специфичны к уридину, но также способны взаимодействовать с 2 -дезоксипиримидиновыми нуклеозидами в низших организмах. Бактериальные уридинфосфорилазы функционируют как гексамеры с идентичными субъединицами молекулярной массой -27 кДа (22). Исследования уридинфосфорилаз из различных организмов показали, что существуют два типа уридинфосфорилаз, которые отличаются рН оптимумом, 6.5-6.7 и 7.9-8.1, соответственно (23).
Для различных видов бактерий и млекопитающих были выделены и охарактеризованы ферменты специфичные для аналога пуринових нуклеозидов 5 -дезокси-5 -метилтиоаденозина (19, 24, 25). 5 -дезокси-5 -метилтиоаденозинфосфорилазы функционируют как тримеры во всех видах, за исключением Sulfolobus solfataricus, в котором фермент представляет собой гексамер (19). 5 -дезокси-5 -метилтиоаденозинфосфорилазы состоят из одинаковых субъединиц с молекулярной массой -30 кДа, за исключением фермента из Архей, в котором субъединицы немного меньше —27 кДа. Для нуклеозидфосфорилаз было предположено несколько различных механизмов фосфоролизной реакции. Ранние кинетические данные на примере пуриновых нуклеозидфосфорилаз из человеческих эритроцитов и бычьей селезенки показали, что катализ осуществляется через тройственный комплекс фермента, иона фосфата и нуклеозида, и что реакция происходит предпочтительнее по Пинг-Понг механизму (26, 27), т.е. стадии взаимодействия субстратов с активным центром фермента разделены необратимым химическим превращением (28). При изучении пуриновых нуклеозидфосфорилаз из бычьей щитовидной железы был описан упорядоченный Би-Би механизм (29), т.е. активный центр фермента последовательно образует, комплексы с одним и вторым субстратом и лимитирующая реакция протекает в тройном комплексе (28). Для фермента из щитовидной железы быка было показано, что сначала связывается фосфат, а потом нуклеозид, а для фермента из мозга быка была описана обратная последовательность (14), Кинетические исследования для пуриновой нуклеозидфосфорилазы из бычьей селезенки согласуются с упорядоченно-последовательным механизмом при расщеплении нуклеозида, при котором сначала связывается ион фосфата, а потом нуклеозид, и случайно-последовательным механизмом при синтезе (14). Исследования, основанные на сайт направленном мутагенезе, пространственных структурах и кинетических данных обеспечили детальными моделями переходного состояния пуриновых нуклеозидфосфорилаз (14, 30, 31). Последующие структурные исследования механизма действия пуриновых нуклеозидфосфорилаз быка и Cellulomonas предположили первичную роль воды в стабилизации переходного состояния (32, 33). Для уридинфосфорилаз из различных видов кинетические исследования показали как случайно-последовательный механизм (34), так и упорядоченно-последовательный механизм, в котором ион фосфата, являясь первым субстратом, связывается, и урацил - первый продукт, покидает фермент (35). Кинетические исследования 5 -дезокси-5 -метилтиоаденозинфосфорилазы описывают как случайно-последовательный (36), так и упор яд оченно-последовательный механизм (37, 38), в котором 5 -дезокси-5 -метилтиоаденозин связывается первым с ферментом и 5 -метилтиорибоза-Г-фосфат первым покидает фермент.
При поиске по базам данных аминокислотных последовательностей и сравнении с последовательностями белков, принадлежащих к известным семействам, последовательности описанных выше нуклеозидфосфорилаз не обнаружили значительной взаимосвязи, с какой либо группой белков. При сравнении между собой последовательностей нуклеозидфосфорилаз состоящих из трех и шести субъединиц наблюдается низкая гомология (таб.1).
Кристаллизация методом диффузии паров растворителя
Наиболее полно активный центр нуклеозидфосфорилаз этого типа исследован на примере тимидинфосфорилазы Е.соїї и пиримидиновой нуклеозидфосфорилазы В. stearothermophilus. Фосфат связывающий карман располагается между двумя (5 тяжами рядом с С-концом центрального р-листа в а/р домене. Аминокислотные остатки, связывающие фосфат, располагаются в этих двух тяжах и в близлежащей петле. Связывание фосфата приводит к тому, что петля, в состав которой входят аминокислотные остатки 115-120 в Е.соїі тимидинфосфорилазе, становиться упорядоченной и в результате формирует ключевую водородную связь между Hisl 19 и Gly208. Этот шаг предположительно и приводит к повороту а/р домена на 8е. Пиримидин-связывающий карман сформирован аминокислотными остатками из двух спиралей на поверхности а домена со стороны углубления. Первоначальное взаимодействие включает связывание двух карбонильных групп пиримидинового кольца положительно заряженными аргинином и лизином, и стекинг взаимодействие между пиримидиновым основанием и тирозином. Связывание примидинового основания в а домене, предположительно, прерывает солевой мостик между Lysl87 и Aspl61 в пиримидиновой нуклеозидфосфорилазе В. stearothermophilus. Это позволяет сформировать р-поворот в одной из соединяющих домены петель и как результат, поворот а/р домена на дополнительные 20 в его полностью закрытую конформацию (68). Кристаллическая структура пиримидиновой нуклеозидфосфорилазы В. stearothermophilus позволила определить аминокислотные остатки активного центра, вовлеченные в связывание субстрата (рис 13).
Аминокислотные остатки активного центра, показанные на рисунке 13 высоко консервативны среди всех последовательностей нуклеозидфосфорилаз, состоящих из двух доменов.
Кристаллическая структура пиримидиновой нуклеозидфосфорилазы В. stearothennophilus является примером нуклеозидфосфорилаз, что взаимодействует как с тимидином так и с уридином. Сравнение активных центров структур E.coli тимидинфосфорилазы и пиримидиновой нуклеозидфосфорилазы 5. stearothennophilus предположило одно возможное объяснение для этого различия. Как у E.coli так и у человеческой тимидинфосфорилазы была описана специфичность к 2 -дезоксирибозной компоненте, с которой взаимодействует остаток метионина, а в пиримидиновой нуклеозидфосфорилазе он заменяется на Lysl08. Эта замена может создать различные схемы водородных связей с кислородом фосфата, что связывается с 2 -гидроксильной группой рибозной компоненты и может объяснять различие в субстратной специфичности (68). Кристаллическая структура примидиновой нуклеозидфосфорилазы в закрытой конформации позволяет предположить, что пиримидиновый нуклеозид в высоко энергетичной конформации с гликозидным торсионным углом, что классифицируется как положительный антиперипланарный угол, связывается с рибозой в редкой 4 -эндо конформации. Похожая высоко энергетичная конформация первоначально была обнаружена в структурах пуриновых нуклеозидфосфорилаз. В целом, ориентация нуклеозидов и иона фосфата также очень схожа, с описанным расположением в структурах нуклеозидфосфорилаз, мономеры которых состоят из одного домена. Несмотря на то, что каталитический механизм для пиримидиновых нуклеозидфосфорилаз не был изучен в таком объеме как для пуриновых нуклеозидфосфорилаз, вероятно, что он очень похож по сущности с тем, что предполагался для человеческой пуриновой нуклеозидфосфорилазы. М. J. Pugmire и S. Е. Ealick предполагают, что для нуклеозидфосфорилаз состоящих из двух доменов, возможен механизм, схематически изображенный на рисунке 14.
Последовательность этого механизма аналогична описываемой выше для нуклоезидфосфорилаз первого типа, и начинается с ослабления гликозидной связи через высоко энергетичные конформации, связывающие пиримидиновый нуклеозид. Гликозидная связь ослабляется, далее электроны перетекают из 04 -рибозы, где формируется ион карбения, в пиримидиновое кольцо и стабилизируются через взаимодействие с положительно заряженным лизином и аргинином. Ион фосфата, который связывается на а стороне рибозного кольца, затем атакует С1 -положение рибозы, получается а-рибоза-Г-фосфат и свободное пиримидиновое основание. Роль His82, который абсолютно консервативен среди нуклеозидфосфорилаз этого типа, в механизме не ясна, но он потенциально может быть вовлеченным в стабилизацию переходного состояния или в передачу протона к С1-положению пиримидинового кольца, сопровождающую гликозидное разрезание.
Нуклеозидфосфорилазы, мономеры которых состоят из одного или двух доменов, представляют собой два структурно индивидуальных семейства ферментов, что катализируют похожие фундаментальные биохимические реакции. Наиболее вероятно, что произошли они от разных предшественников и эволюционировали независимо. Несмотря на это, нуклеозидфосфорилазы имеют только два способа укладки белковой молекулы, вовлеченные в фосфоролнз большого количества пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Анализ последовательностей нуклеозидфосфорилаз в сочетании с известными пространственными структурами обеспечил информацией относительно структурно -функциональной взаимосвязи в обоих этих семействах и помог объяснить различия и схожесть, что существует среди принадлежащих им ферментов. В то время как укладка белковой молекулы в первом и втором типах не похожа, положение субстратов в активном центре и конформация связанных нуклеозидов, оказалась подобной. К тому же, хотя механизм катализа для тимидинфосфорилаз не изучен так, как для пуриновых нуклеозидфосфорилаз, он возможно очень похож на предполагаемый механизм катализа для ферментов первого типа.
Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов
Метод искусственной эпитаксии представляет собой новое направление в кристаллизации белков. В этом случае ориентированный рост кристаллов белков происходит на произвольных (обычно аморфных) подложках, имеющих кристаллографически симметричный рельеф. Ранее метод неоднократно использовался для получения ориентированных неорганических пленок (94). При эпитаксиальном росте регулярность поверхности используемых минеральных матриц облегчает образование кристаллических зародышей. Частным случаем эпитаксиальной нуклеации является зарождение кристаллов на волокнах целлюлозы, случайно попавших в раствор (90).
Кристаллизация белков на ориентированных подложках, являющаяся более сложным процессом в сравнении с ростом кристаллов малых молекул, обсуждается в работе Feigelson (95). McPherson с соавторами изучали ориентированный рост лизоцима на апофеллите (96). Фундаментальное исследование кристаллизации каталазы, канавалинна и лизоцима на ориентированных поверхностях проведено в работе Givargizov (97). Было изучено влияние симметрии и профиля микрорельефа и детергентов на ориентированный рост белковых кристаллов. Для кристаллизации использовали метод диффузии паров растворителя в варианте лежачей капли на матрицах кремния. Для каталазы PeniciUum vitale рост кристаллов на подложках из монокристаллических пластин кремния, на которых методами фотолитографии создан полосчатый микрорельеф, приводил к ориентированному расположению выросших кристаллов. Авторы предложили возможные механизмы такого роста, а также показали, что микрорельеф можно считать своего рода катализатором процесса образования зародышей, сокращающим инкубационный период появления кристаллов и понижающим величину степени насыщения, необходимого для нуклеации.
Метод эпитаксиального выращивания кристаллов, обеспечивающий высокую их упорядоченность, пока ограниченно применяется в кристаллизации биологических макромолекул из-за трудности подбора подходящих минеральных матриц. Дело в том, что многие подложки способствуют адгезии белков. Иногда сила взаимодействия с подложкой оказывается больше силы, связывающей молекулы в кристаллическую решетку. Применение эпитаксиальных субстратов полезно в тех случаях, когда образуются несовершенные кристаллы, надо уменьшить количество зародышей или когда кристаллы вообще не растут.
Этот метод вошел в практику кристаллизации белков сравнительно недавно. Гели, используемые в кристаллизации, являются гидрогелями и представляют собой двухкомпонентные системы, в которых кристаллизационный раствор (жидкая фаза) пропитывает микропористую гибкую полимерную сетку (твердая фаза). В процессе образования геля происходит его структурирование, приводящее к возникновению полимерного кластера во всем объеме раствора. Этот процесс может быть обратимым в случае физических гелей (желатин, агароза), которые состоят из свободных полимерных цепей и получаются понижением температуры полимерного раствора, или необратимым в случае химических гелей (силиконовых, полиакриламидных), получаемых образованием прочных связей между полимерными цепями (98).
Использование гелей способствует более равномерной встречной диффузии осадителя и белка и созданию плавного градиента концентраций. Кроме того, гель предотвращает появление конвекционных потоков в кристаллизационной среде (99). Для кристаллизации в геле применимы все классические методы кристаллизации из растворов. Процесс роста кристаллов белка в геле определяется теми же факторами, что и рост из раствора. Чистота и гомогенность белкового препарата также необходимы. Существует несколько способов кристаллизации с применением гелей. При кристаллизации лизоцима с использованием в качестве осадителя NaCl осадитель помещали в слои геля, а белковый раствор наносили на него (99). Условия для роста кристаллов возникали в результате встречной диффузии ионов осадителя и молекул белка, а кристаллы образовывались в слое раствора над гелем, на границе раздела гель - раствор, т.к. коэффициент диффузии белка существенно ниже, чем соли. В другом способе, напротив, раствор белка наносится в слои геля, а раствор соли - сверху (90). В этом случае кристаллы вырастают в геле. Недостатком этого способа является необходимость извлечения хрупких кристаллов белка из геля. Кристаллизация белка в геле может происходить, когда слой геля, содержащий только буферный раствор, помещен между растворами белка и осадителя. В этом случае диффузия через слой геля смягчает любые резкие изменения в окружающей среде, что способствует росту более совершенных кристаллов. Наконец, можно проводить кристаллизацию диффузией жидкость - жидкость в каплях, содержащих одновременно белок, буфер, осадитель и агарозу. Оптимальная концентрация агарозы в каплях определяется в предварительных экспериментах. Так, Provost и Robert (98) показали, что более совершенные по форме кристаллы лизоцима вырастают только при концентрациях агарозы 0.1% и выше. При кристаллизации в геле время роста белковых кристаллов увеличивается, поэтому иногда наблюдается нежелательное "старение" белка. Чтобы избежать его рекомендуется увеличить степень пересыщения, что при обычных условиях роста в свободных растворах является невозможным. Метод полезно применять, если в обычных условиях появляются мелкие кристаллы с дефектами, делающими их непригодными для рентгеноструктурного исследования.
Поскольку рост кристаллов в гелях имеет ряд общих черт с кристаллизацией в условиях микрогравитации и при макрогравитации, использование гелей помогает осуществить предварительный поиск условии, после чего целесообразно применять эти перспективные и развивающиеся методы кристаллизации.
Сбор дифракционных данных с кристаллов уридинфосфорилазы S. typhimurium и определение пространственной структуры фермента
Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии паров в висящей капле с использование набора условий для кристаллизации Crystal Screen Hampton Research (85). Раствор белка, содержащий 10 мМ Трис-НС1 рН 7.3, 0.4% NaN3, с концентрацией белка 20 мг мл"1 , смешивался с раствором из набора условий для кристаллизации в соотношении 1:1 и помещался на силиконированное стекло, в противорастворе находился 1 мл соответствующего раствора осадителя. Кристаллизационная плашка инкубировалась при температуре 2 ГС. Первые кристаллы уридинфосфорилазы S. typhimurium были получены в растворе, содержащем 0.1М Na-ацетат, рН 4.6 и 8% полиэтиленгликоля 4000, в качестве осадителя. Кристаллы отражали рентгеновские лучи с разрешением 5А. Оптимизация условий кристаллизации позволила получить кристаллы пригодные для рентгеноструктурного анализа, отражающие рентгеновские лучи с разрешением 2.9А. Кристаллы были получены в условиях: ЮОмМ Na-ацетат, рН 5.0, 7% полиэтил енгликоль 8000 в противорастворе. Объем кристаллизационной капли составлял 5 мкл, соотношение белка и противораствора в капле 1:1. Был подобран раствор для замораживания этих кристаллов в жидком азоте, для сбора дифракционных данных в криоусловиях 100К. Наиболее оптимальным оказался раствор, содержащий 0.1М Na-ацетат, рН 5.0, 10% полиэтил енгликоль 400, 20% глицерин. С этих кристаллов на рентгеновском дифрактометре Института белка РАН при температуре 100 К был получен первый набор дифракционных данных с разрешением 2.9А, с пространственной группой Рбі и параметрами элементарной ячейки: а=92.3 А, Ь=92,3 А, с=267.5. Этот набор дифракционных данных позволил впервые определить структуру уридинфосфорилазы S. typhimurium. При съемке кристаллов, выращенных в тех же условиях, на синхротроне в Гамбурге удалось получить набор дифракционных данных с более высоким разрешением 2.5 А, позволивший уточнить структуру уридинфосфорилазы S. typhimurium до разрешения 2.5 А. Повышение разрешения позволило локализовать ион фосфата в одном из активных центров уридинфосфорилазы S. typhimurium.
Получение комплексов фермента с аналогами субстрата: урацилом и уридин-5 -монофосфатом, с сульфат и фосфат ионами, также производилось методом диффузии паров в висящей капле. Для получения кристаллов комплексов были оптимизированы условия кристаллизации нативного белка, а также несколько изменена методика кристаллизации. В итоге кристаллы комплексов получались при использовании противораствора, содержащего бОмМ Na-ацетат, рН 5.2, 20% полиэтиленгликоль 4000. Состав кристаллизационных капель для комплексов уридинфосфорилазы S. typhimurium с аналогами субстратов был следующий: с урацилом и сульфат ионом: 3 мкл раствора белка (20 мг мл-1), 3 мкл противораствора, 0.5 мкл урацила (50 мМ) и 0.5 мкл сульфата аммония (10 мМ); с уридин-5 -монофосфатом и сульфат ионом: 3 мкл раствора белка (20 мп-мл"1), 3 мкл противораствора, 0.5 мкл уридин-5 -монофосфата (10 мМ) и 0.5 мкл сульфата аммония (10 мМ);
Для получения крупных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа, использовалась следующая методика. Раствор белка смешивался с противораствором, как описано выше, при смешивании в капле образовывался кристаллический осадок и пленка. Капля уравновешивалась в течение 12 часов против противораствора, затем стеклышко с каплей переносилось на резервуар с 400 мкл НгО. Через 1-3 суток в капле образовывались крупные кристаллы размером 100x50x40 мкм. Все кристаллы комплексов были схожей формы. Для сбора дифракционных данных в криоусловиях был подобран раствор для замораживания этих кристаллов в жидком азоте. Криораствор содержал бОмМ Na-ацетат, рН 5.2, 10% полиэтиленгликоль 4000, 30% полиэтиленгликоль 400.
При кристаллизации нативного белка с использованием этой методики кристаллизации удалось получить другую форму кристаллов. При этом были несколько изменены условия кристаллизации. Противораствор содержал бОмМ Na-ацетат, рН5.2, 20% полиэтиленгликоль 6000, объем кристаллизационных капель составлял 7 мкл, соотношение белка и протораствора в капле было 1:1. Раствор для замораживания этих кристаллов в жидком азоте содержал 60 мМ Na-ацетат, рН 5.2, 10% полиэтиленгликоль 6000, 30% полиэтиленгликоль 400. Полученные кристаллы уридинфосфорилазы S. typhimurium отражали рентгеновские лучи с разрешением 1.77 А.
Первый сбор дифракционных данных для нативного белка проводился при температуре 100 К на рентгеновском дифрактометре Института белка РАН. Основными компонентами системы являются: генератор (GX-6, Эллиот, Англия) с вращающимся медным анодом и фокусом 0,2 х 0,2 мм, работающий в режиме 35кВ х 35 мА; рентгенофокусирующее устройство на основе поликапилярной линзы Кумахова (Институт рентгеновской оптики РАН), позволяющее увеличить на порядок интенсивность пучка, падающего на кристалл; детектор рентгеновского излучения MAR-345(MAR Research, Германия) и криоустановка, создающая струю газообразного азота с температурой около 100 К (CryoJet, Oxford Instruments, Великобритания).
Дифракционный набор был получен методом вращения с одного кристалла. Расстояние от кристалла до детектора было 280 мм. Общий угол поворота во время сбора дифракционных данных составил 43, угол осцилляции - 0.5, время съемки одной рентгенограммы - 20 минут. Полное время съемки составило 29 часов. Величина мозаичности кристалла не превышала 0.6. Обработка набора проведена программой "XDS" (118) до разрешения 2.9 А (таб.3). Полнота набора составила 93.0%, фактор слияния рефлексов Rmerge =15.4%. Коэффициент Метьюза (119) VM=2.0A3 Da"1 соответствует шести молекулам в асимметричной части ячейки, содержание растворителя 38.9%. Этот набор был использован для получения первой структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium с разрешением 2.9 А.
