Введение к работе
Актуальность проблемы.
Лактоіньш опсрон Е coh один из первых и любимых объектов современной молекулярной биологии и генетики Именно на примере изучения этой генетической структуры были установлены и впервые сформулированы основные принципы генетической регуляции транскрипции прокариот, наполнены молекулярным содержанием понятия грочотор, оператор, репрессор, оперпн Не удивительно, что с моменіа начала генпо-инженерпых экспериментов по обеспечению эффективной экспрессии гомо- и гетеролої ичных генов в клетках Е coh для регулируемой транскрипции целевых цистронов широко используются элементы лактозного оперона Несмотря на то, что в пракгике современных исследований по молекулярной биологии, биотехнологии, генной и метаболической инженерии для этих же целей используется достаточно болыпое число прокариотических промоторов с известными механизмами регуляции инициации транскрипции применение элементов лактозного оперона Е coh не потеряло своей актуальности и практической значимости Действительно, по эффективности репрессии и по специфичности индукции система лактозного оперона превосходит подавляющее большинство других прокариотических систем регуляции транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой Ecoh
Однако, специфические особенности регуляции транскрипции лактозного оперона дикого типа и его наиболее часто используемого мутантної о (UV5) варианта приводят к двум принципиальным недостаткам при практическом применении элементов системы для транскрипции целевых генов Уровень инициации транскрипции в условиях максимальной дерепрессии оказываегся недостаточно высок по сравнению с использованием других прокариотических промоторов, и, в то же время, лактозный промотор полностью дерепрессируется уже при относительно невысоких концентрациях индуктора в среде, что в совокупности не позволяет проводить исследования влияния различной эффективности транскрипции находящихся под котпропеч лактозного промотора генов в широком диапозоне. варьируя концентрацию индуктора в среде Фактически, система лактозного оперона может быть использована для регулируемой транскрипции генов в тригерном режиме (репреесия/дерепрессия;, и при лом максимальный уровень транскрипции относительно невысок Если в эпоху создания «ппазмидных» штаммов-продуцентов биологически активных веществ последний недостаток (относительно слабая транскрипция) лактозного промотора мог быть легко компенсирован за счет использования мульти-копийной рскомбинан і ной плазмиды его содержащей, то в случае создания безнлазмидньгх штаммов-продуцентов нового поколения, в которых усиление экспрессии одной копии целевот о гена, локализованного в составе бактериальной хромосомы, осуществляется заменой его промотора - ('слабость» лактозного (UV5) промотора становится весьма серьезным недостатком его практического использования
Таким образом, значительное увеличение «силы» лактозного промотора с одновременным сохранением эффективности его регуляции, а также обеспечение плавной регуляции силы промотора в широком диапазоне концентраций добавляемого индуктора, безусловно, являются актуальными направлениями современного этапа исследований этой генетической системы, а создаваемые при этом новые элементы могут найти достаточно широкое практическое применение.
s OS viPmdfO ,
2 Цель и задачи работы.
Диссертационная рабо і а посвяшена конструированию и исследованию свойств новых строго регулируемых генетических систем на основе хорошо швейных регуляторных элементов лактоіною оперона и структурной части гена /ас-рспрессора Е coh, позволяющих оптимизировать экспрессию цетевых генов
В процессе работы решались следующие задачи
создание авторегулирусмой и строю репрессируемой системы, способной к плавному изменению экспрессии в зависимости от концентрации добавленною в среду индуктора;
создание модифицированных вариантов 0/ос-содержащих промоторов, способных, при сохранении с грог ой регуляции, обеспечивать более эффективную транскрипцию в условиях потной индукции
Научная новизна и практическая значимость.
В ходе работы создан новый искусственный гене-] ический элемент QzlVtacL\slOiac^lacl, на основе промоторно-операторной области мутантного (UV5) лактозного оперона Ecoli, Oj^P/aruWCW, и сгруктурной части гена lad с модифицированным участком связывания рибосом, способный осуществлять плавную регуляцию экспрессии целевых іенов, находящихся под контролем 0;„с-содержаіцих промоторов и расположенных как in січ. так и in trans.
Высокий уровень репрессии нового элемента, в отсутствии индуктора, позволил с его помощью осуществить клонирование и иселедоваїь экспрессию структурных областей некоторых генов и оперонов, которые ранее, из-за токсичности их белковых продуктов не удавалось клонировать в других 0;ис-содержащих векторных системах.
С использованием нового генетического элемента, впервые сконструирован вариант вектора RSF1010, обладающий регулируемой (добавлением ИП'ГУ) копийностью, не содержащий каких-либо участков ответственных за мобилизацию, а также не имеющий в своем составе генов устойчивости к антибиотикам.
Созданы и охарактеризованы новые эффективно реіулируемьіе 0/ос-содержащие
ГибрИДИЫе ПрОМОТОрЬГ Pn-c-ldeal 2> P»r-ideal-3 И P/rc-ideal-4, ПрЄВОСХОДЯЩИЄ В 4 раза ПО «СИЛЄ»
P/D6UV5 и, в отличие от предшественников (Р/гс и Pirc-iituO, не уступающие ему по уровню репрессии
Апробация рабоїьі.
Диссертационная работа была апробирована на семинаре ЗЛО «АГРИ» в июле 2004 г и на семинаре Секции Ученого Совета «Молекулярная Биология» ФГУП ГосНИИгснетика в декабре 2004 г Магериалы диссертации были представлены па «The 2001 Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (University of Wisconsin-Madison, USA, 31 07-5 08 2001), на конференции, посвященной 50-летию кафедры «Дозиметрия и защита» Московскої о Инженерно-физического Института (Москва, январь, 2002 г), на «The Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting» (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 20-25 08 2002), на «Conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to the 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine» (Ukraine, Kiev, 25-27 09 03), на Всероссийском симпозиуме «Биотехнология Микробов», посвященный 120-летию со дня рождения академика В II Шапошникова (Моеква, МГУ 21-24 10 04)
Сіруктура и объем работы.
Диссертация сосюит иі 6 разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы» Работа изложена на ]Ъ2> страницах, включая _ty рисунков и 3 таблиц Список нитруемой литературы содержи іІЄ5 источников, в юч числе _S_ на русском языке
Похожие диссертации на Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli
