Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Микрочипы в диагностике и научных исследованиях 12
1.1.1 Нанотехнологии на основе биологических микрочипов 12
1.1.2 Перспективные методы анализа генетического полиморфизма 15
1.1.3 Биочипы для изучения генетической предрасположенности 21
1.2 Изучение генетического полиморфизма ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой системы 23
1.2.1 Генетический полиморфизм и сердечно-сосудистая система 23
1.2.1.1 Определение генетического полиморфизма. Его значение в современной медицинской генетике 23
1.2.1.2 Сердечно-сосудистые заболевания 24
1.2.1.3 Гены «предрасположенности» к сердечно-сосудистым заболеваниям 24
1.2.2 Артериальная гипертензия 31
1.2.2.1 Этиология и патогенез 31
1.2.2.2 Формирование представлений о генетической природе артериальной гипертензии 34
1.2.3 Ренин-ангиотеюиновая и кинин-брадикининовая системы 38
1.2.4 Гены «предрасположенности» к артериальной гипертензии 40
1.2.4.1 Ренин 40
1.2.4.2 Ангиотензиноген 40
1.2.4.3 Ангиотензинпревращающий фермент 41
1.2.4.4 Рецептор 1 к ангиотензину II 43
1.2.4.5 Рецептор 2 к ангиотензину II 44
1.2.4.6 Рецептор 2 к брадикинину 44
1.2.5 Комплексное изучение ассоциации полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы с предрасположенностью к артериальной гипертензии 45
2 Материалы и методы 48
2.1 Характеристика исследуемых групп 48
2.2 Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов 50
2.3 Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия 54
2.4 Проведение полимеразной цепной реакции 55
2.4.1 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом ПААГ 56
2.4.2 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе 57
2.5 Анализ ПЦР продуктов методом ПААГ 62
2.6 Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле 63
2.7 Гибридизация меченого продукта на микрочипе 63
2.8 Регистрация изображения и его обработка 64
2.8.1 Анализ "фармакогенетического биочипа" 65
2.8.2 Анализ "кардиочипа" 66
2.9 Статистическая обработка данных 67
3 Результаты и обсуждение 68
3.1 Разработка алгоритма создания биочип-тест-систем для анализа ге нетического полиморфизма человека 68
3.1.1 Создание "фармакогенетического биочипа" 68
3.1.1.1 Выбор генов и полиморфных вариантов 68
3.1.1.2 Выбор нуклеотидных последовательностей и длин ПЦР продуктов, последовательностей концевых праимеров и последовательностей иммобилизованных олигонуклеотидных зондов... 69
3.1.1.3 Особенности проведения мультиплексной ПЦР и гибридизации 74
3.1.1.4 Конструирование биочипа. Блочный подход 75
3.1.1.5 Блочная организация микрочипа 76
3.1.1.6 Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода 82
3.1.1.7 Алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма 84
3.2 Создание "кардиочипа" 86
3.2.1 Выбор генов и полиморфных вариантов 86
3.2.2. Схема и структура микрочипа 87
3.2.3 Анализ контрольных и диагностических образцов 89
3.3 Сравнение метода гибридизации на биочипах с классическими методами анализа генетического полиморфизма 89
3.4 Применение биочипов в медицине и биологии 91
3.5. Анализ полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикиншювой систем у больных артериальной гипертензией и в контроле 92
3.5.1 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле 92
3.5.1.1 Анализ соответствия распределений закону Харди-Вайнберга 92
3.5.1.2 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов 93
3.5.2 Анализ ассоциации показателей ИМТ, САД, ДАД и генотипов изученных генов у детей, больных артериальной гипертонией 108
3.5.3 Корреляционный анализ взаимосвязи генотипов изученных генов, ИМТ, САД и ДАД у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле 111
3.5.4 Комплексный анализ ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле 115
Заключение 121
- Изучение генетического полиморфизма ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой системы
- Ангиотензинпревращающий фермент
- Анализ ПЦР продуктов методом ПААГ
- Создание "кардиочипа"
Введение к работе
Лавинообразное нарастание интереса к изучению генетической предрасположенности требует разработки новых подходов к идентификации и анализу ДНК-полиморфизма. Современное развитие науки невозможно без создания новых технологий, позволяющих-проводить анализ множества генетических изменений одновременно. Одним из наиболее перспективных методов для решения этой задачи является метод мультиплексной ПЦР с дальнейшей гибридизацией на олигонуклеотидпой матрице (Kolchinsky and Mirzabekov, 2001; Nasedkina et al, 2003; Колчинский и др., 2005; Wang et al, 2005).
Сердечно-сосудистая патология является самой распространенной причиной смертности во всем мире. Изучение патогенеза и диагностика генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям имеет большое значение не только для фундаментальной медицинской науки, но и становиться важным инструментом, для решения задач профилактической (предиктивной) медицины. Уже на сегодняшний день для многих социально-значимых заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз и другие, показана ассоциация определенных полиморфных вариантов некоторых генов с данными болезнями (Нефедова и Шварц, 1998, Баранов и др., 2000, 2003; Иващенко и др., 2004, Babunova et al, 2003). Очевидно, что для более точной оценки роли генетического полиморфизма в этиологии заболевания необходимо использование системного подхода, заключающегося в выборе и анализе генов, продукты которых находятся в биохимически последовательно связанных реакциях. В связи с чем, особый интерес представляет изучение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, принимающих участие в регулировании артериального давления и обмене электролитов. Показано, что генетический по-
диморфизм данных систем существенно меняет их активность, что и является зачастую причиной сердечно-сосудистой патологии (Пузырев, 2003; Chistiakov et al, 1998, 2000; Rupert et al, 2003; Zhu et al, 2003; Naber et al, 2004a,b). С другой стороны большое значение имеет анализ генетического полиморфизма у больных в детском возрасте, где значительно сильнее проявляются внутренние - генетические факторы, накладывающиеся на факторы внешней среды во взрослом состоянии (Obraztsova et al, 1998).
Таким образом, разработка методических (биочипы) и методологических основ современного анализа генетического полиморфизма человека является актуальной проблемой современной молекулярной биологии и медицинской генетики.
Цель работы заключается в разработке тест-систем на основе гелевых биочипов для анализа генетического полиморфизма человека и их использование при изучении генетической предрасположенности к артериальной гипертензии у детей.
Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:
Разработать алгоритм создания биочип-тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека на примере детекции мутаций в генах CYP1A1 (48870А, 4889A>G и 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A и 2637delA), GSTM1 (деле-ция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G), MTHFR (6770Т), CYP2C9 (430ОТ и 1075ОТ) и CYP2C19 (681G>A).
Разработать биочип для анализа генетического полиморфизма генов REN (19-
83G>A), Л<7Г(М235Т), AGTR1 (1166А>С), AGTR2 (31230А), BKR2 (-58Т>С),
MTHFR (6770Т), ADRB2 (48A>G и 810G) ("кардиочип").
I 3. Проанализировать полиморфные варианты генов REN (I9-83G>A), AGT > V
(М235Т), АСЕ (I/D), AGTR1 (1166А>С), AGTR2 (31230А), BKR2 (-58Т>С и I/D)
у детей, больных артериальной гипертензией, и в популяционном контроле.
Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем в подгруппах больных артериальной гипертензией с различными клиническими проявлениями.
Провести комплексную оценку влияния полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем на развитие артериальной ги-
ПерТеНЗИИ у Детей. y.^Y .-';'' ' ' ' г
Изучение генетического полиморфизма ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой системы
Генетический полиморфизм определяется как наличие двух и более альтернативных вариантов гена, встречающихся в популяции с частотой не менее 5%. Первоначально понятие "генетического полиморфизма" применялось в большей степени для характеристики фенотипических особенностей организма. И только после массового внедрения новых методов молекулярной биологии (особенно ПЦР) и начала программы "ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА" это понятие стали относить непосредственно к молекуле ДНК. Генетический полиморфизм в геноме человека в 95% случаев связан с однонук-леотидными заменами - SNP (от англ. single nucleotide polymorphism - полиморфизм одного нуклеотида). На сегодняшний день известно более 4 млн. SNPs (Вторая конференция "Biologie Prospective", Санторини, Греция, 2004). Наиболее важной особенностью этих замен является то, что некоторые из них могут быть ассоциированы с генетической предрасположенностью человека к тому или иному заболеванию. Поэтому проблема генетического полиморфизма ДНК является одной из актуальнейших проблем в современной медицинской генетике. В связи с этим, количество исследований, связанных с анализом генетической предрасположенности, интенсивно увеличивается (Баранов и др., 2000,2003). Причем большое количество работ в данной области сосредоточено на изучении сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Болезни сердца и сосудов - главные причины заболеваемости, инвалидизации и преждевременной смертности в России. По данным эпидемиологов в России ежегодно от сердечно-сосудистых заболеваний умирает более 1,2 млн. человек (Александров, 1997). Наиболее распространенный диагноз - ишемическая болезнь сердца (ИБС) и артериальная гипертензия (АГ). Среди причин сердечно-сосудистых заболеваний можно выделить как «внешние» факторы, так и «внутренние». К «внешним» факторам риска можно отнести курение, злоупотребление алкоголем, ожирение, большое количество соли, употребляемое с пищей, диабет, гиподинамия, стрессовые ситуации и др.
К «внутренним» факторам - индивидуальную наследственную предрасположенность. Причем известно, что риск развития таких заболеваний, как ИБС и инфаркта миокарда (ИМ) значимо возрастает при неблагоприятном сочетании «внешних» и «внутренних» факторов. 1.2.1.3 Гены «предрасположенности» к сердечно-сосудистым заболевани ям. На данный момент известно более полутора сотен генов, полиморфные варианты которых связывают с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям (Нефедова и Шварц, 1998; Шляхто и Конради, 2002; Пузырев, 2003; Cheng et al, 1999; Liljedahl et al, 2003; Zateishchikov et al, 2004). Стоит отметить, что одними из первых в мире подобные исследования были проведены в начале 90-х годов прошлого века в Санкт-Петербурге под руководством проф. Е.И. Шварца. Было показано, что полиморфизм генов метаболизма липидов и ренин-ангиотензиновой системы ассоциированы с предрасположенностью к артериальной гипертензии, ИБС, инфаркту миокарда и другим заболеваниям (Нефедова и Шварц, 1998; Akhmedova et al, 1996; Popov et al, 1996; Volkova et al, 1996, 1997; Obraztsova et al, 1998;Fomichevae/fl/., 2000). В настоящее время все гены-кандидаты можно подразделить на несколько групп: 1. Гены, кодирующие белки метаболизма липидов. 2. Гены, продукты которых вовлечены в регуляцию артериального давления. 3. Гены, контролирующие выработку факторов свертывания крови и фибрино-лиз. 4. Гены молекулярных мессенджеров (сигнальных белков). 5. Гены, кодирующие факторы пролиферации клеток. 6. Гены ионных каналов. 7. Гены, кодирующие белки метаболизма гомоцистеина. 8. Гены, кодирующие белки структурной и функциональной организации миокарда. 9. Другие гены. В табл. № 1 приведены полиморфные варианты наиболее изученных на сегодняшний день генов, полиморфизм которых может влиять на развитие сердечно-сосудистой патологии. Артериальная гипертензия (АГ) относится к мультифакториальным заболениям сердечно-сосудистой системы. Клинической характеристикой артериальной гипертен-зии является стойкое повышение артериального давления: систолического 140 мм.рт.ст. и/или диастолического 90 мм.рт.ст., зарегистрированных не менее чем при двух врачебных осмотрах, при каждом из которых артериальное давление (АД) измеряется, по крайней мере, дважды (Ратова и др., 2001; Образцова и др., 2005). Артериальная гипертензия или гипертония относится к числу главных факторов риска развития ишемической болезни сердца (ИБС). Наряду с атеросклерозом, она является основной причиной инвалидизации населения и преждевременной смертности. Согласно многочисленным данным, гипертонией страдает до 20% взрослого населения высокоразвитых стран. Однако в последнее время большинство ученых склоняются к тому, что значительная часть взрослого контингента больных гипертонической болезнью формируется из детей и подростков с повышенным артериальным давлением (Доклад экспертов ВОЗ №792, 1992). Распространенность АГ в детском и подростковом возрасте, по данным разных авторов, составляет от 14 до 17%. В Санкт-Петербурге в 1997 г. при обследовании подростков в возрасте 15-17 лет повышенный уровень артериального давления (АД) был обнаружен у 33% обследованных детей.
Установлено, что у 44% детей, имеющих АД выше нормы, в последующие годы уровень давления остается стабильно повышенным, а в 12% случаев отмечают про-грессирование артериальной гипертензии (Образцова и др., 2005). В большей степени повышенное АД фиксируют у мальчиков, чем у девочек (на три мальчика приходится одна девочка). Факторы риска артериальной гипертензии у детей и подростков подразделяют на наследственные и ненаследственные. К первым относят: наследственную отягощенность по гипертонической болезни у близких родст венников, генетическую предрасположенность. Ко вторым относят: избыточную массу тела, патохарактерологические особенности личности, нарушение липидного обмена, недостаточную двигательную активность, высокий порог чувствительности к поваренной соли, симпатикотонию и недостаточное вегетативное обеспечение, частые обострения очаговой инфекции, раннее наступление физической и половой зрелости, повышенное содержание мочевой кислоты в сыворотки крови (гиперурике-мия) Значимость критериев риска артериальной гипертензии различна. Наиболее высокую сопряженность с ней имеют наследственные факторы, а также гиперурикемия, высокий уровень личностной тревожности и тип вегетативной дистопии. Кроме того, факторы риска делят на модифицируемые и немодифицируемые. Модифицируемыми факторами риска являются избыточная масса тела, гиподинамия, нервно-психическое напряжение и избыточное потребление соли натрия (Брязгунов, 2002). Артериальную гипертензия относят к так называемым "болезням регуляции", при которой нарушается активность и взаимодействие нейрогуморальных систем регуляции артериального давления, приводящих к структурным изменениям сосудов, особенно клеточных мембран. Это отражается на нарушении трансмембранных потоков ионов натрия, калия и кальция. Кальций активнее связывается саркоплазматическим ретикулумом, накапливается внутри клеток и служит для обеспечения повышенной активности контрактильыого аппарата мышечных клеток сосудов и сердца. Что в свою очередь отражается в утолщении стенок сосудов и гипертрофии левого желудочка (Брязгунов, 2002). Лечение детей и подростков, больных гипертонией в большой степени зависит от стадии заболевания. При первичной гипертензии возможно использование различных профилактических средств. К ним относят: нормализацию массы тела, увеличение физической активности (предпочтительны динамические нагрузки), ограничение потребления соли, исключение стрессовых ситуаций. Кроме того, в начальной (лабильной стадии) широко используют фитотерапию (Брязгунов, 2002).
Ангиотензинпревращающий фермент
Ген ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) локализован на длинном плече 17-ой хромосомы в локусе 17q23. Он содержит 26 экзонов, и его размер составляет 45 т.п.о. Ген ангиотензинпревращающего фермента эспрессирует мажорный транскрипт размером около 5 т.п.о. Молекулярный вес белкового продукта гена составляет 150 кДа. Его первичная структура состоит из 1306 а.к. ("GeneCards"; "NCBI"; Hubert et al, 1991; Tanaka et al, 2003). Ангиотензинпревращающий фермент кодирует два изозима. Соматический АСЕ экспрессируется во многих тканях, включая эндотелий, эпителий почек и другие, тестикулярний - только в сперме. АСЕ превращает ангиотензин І в ан-гиотензин II, а также шіактивирует брадикинин. Полиморфизм в гене А СЕ обусловлен, прежде всего, инсерциоино-делеционным (I/D) ДНК-полиморфизмом в 16-ом интроне - наличие/отсутствие Alu повтора (хотя в настоящий момент известно более 20-ти полиморфных вариантов в этом гене). Показано, что уровень АСЕ в сыворотке у здоровых людей, гомозиготных по D-аллели (30% людей имеют DD генотип) в два раза выше, чем у гомозиготных по /-аллели (23% людей) и имеет среднее значение у гетерозигот (47%). То есть инсерция Alu повтора приводит к пониженной экспрессии гена АСЕ. Однако I/D полиморфизм не является гТ / Г Ї/Г Av:- r( функциональным. Показано его сцепление с полиморфизмом G2350A в 17 экзоне, влияющим на уровень белка в плазме крови (Igbal et al, 2004). Изучению I/D полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента у больных артериальной гипертен-зии посвящено значительное число работ, и результаты их неоднозначны (Popov et al, 1996; Obraztsova et al, 1998; Chistiakov et al, 1998; O Donnel et al, 1998; Fornage et al, 1998; Dzida et al, 2001; Tamaki et al, 2002; Yu et al, 2003; Brazhnik et al, 2003; Tsai et al, 2003; Safar et al, 2004; Minushkina et al, 2005). В большинстве исследований достоверных различий в частоте аллелей и генотипов этого полиморфизма у больных АГ по сравнению с лицами контрольной группы не обнаружено (Popov et al, 1996; Tamaki et al, 2002; Yu et al, 2003). Однако в ряде исследований показано, что у лиц с генотипом D/D уровень АД несколько выше по сравнению с носителями генотипа I/I. Все эти данные относятся к мужчинам. У женщин ассоциации I/D полиморфизма с уровнем АД показано не было (Obraztsova et al, 1998; O Donnel et al, 1998; Fornage et al, 1998). Ин- тересно отметить, что лица с D/D генотипом преобладают среди спортсменов, занимающихся силовыми видами спорта (Montgomery et al, 1998; Nazarov et al, 2001; Jones et al, 2003b). 1.2.4А Рецептор 1 к ангиотензину II. Ген рецептора 1 к ангиотензину II (AGTR1) локализован на длинном плече 3-й хромосомы в локусе 3q21-q25.
Он содержит 5 экзонов, и его размер составляет 55 т.п.о. Первые четыре экзона кодируют 5 -некодирующую последовательность. Кодирующая последовательность в 2 т.п.о. ограничена 5-м экзоном. Молекулярный вес белкового продукта гена рецептора 1 к ангиотензину II составляет 41 кДа. Его первичная структу-pa состоит из 359 а.к. ("GeneCards"; "NCBI"; Su et al, 2004). Существует два подтипа рецепторов: ATI а и ATlb, имеющих 98% гомологию по аминокислотному составу. Если AT 1а экспрессируется во всех тканях и органах, то ATlb - только в плаценте, легких, печени, но не в сердце (Haywood et al, 1997). Основная функция обоих подтипов рецептора - связывание ангиотензина II и передача сигнала вазоконстрикции и пролиферации гладкомышечным клеткам (Benetos and Safar, 1996). Существует около 20-ти полиморфных вариантов гена ангиотензиногена (Su et al, 2004). Наиболее изученным вариантом является замена аденина на цитозин в позиции 1166 (1166А С) (Hilgers et al, 1999; van Geel et al, 2000; Nalogowska-Glosnicka et al, 2000; Chistiakov et al, 2000). Показано, что С-аллель и С/С генотип ассоциированы с повышенным уровнем артериального давления (Spiering et al., 2000). Однако данный полиморфизм не является функционально значимым - он сцеплен с -810Т А вариантом в промоторной области, влияющим на присоединение GATA связывающих транскрипционных факторов (Su et al., 2004). Во многих исследованиях была показана ассоциация С/С генотипа по гену A GTR1 с предрасположенностью к артериальной гипертензии (Nalogowska-Glosnicka et al., 2000; Dzida et al, 2001; Jones et al, 2003; Henskens et al, 2003). И только в незначительном количестве исследований таких закономерностей не удалось выявить (Kikuya et al, 2002). 1.2.4.5 Рецептор 2 к ангиотензину П. Ген рецептора 2 к ангиотензину II (AGTR2) локализован на длинном плече X хромосомы в локусе Xq22-q23. Он содержит 3 экзона размером в 3,8 т.п.о. Кодирует мРНК рецептора только третий экзон. AGTR2 экспрессирует транскрипт около 1 т.п.о. Молекулярный вес белкового продукта гена составляет 41 кДа. Его первичная структура состоит из 363 а.к. ("GeneCards"; "NCBI"; Herrmann et al, 2002; Jin et al, 2003). Рецептор 2 к ангиотензину II экспрессируется главным образом в сердце, под контролем эстрогенов. AGTR2 также как и AGTR1 участвует в ангиотензин II опосредованных реакциях, но является его антагонистом - опосредует вазодилататорную функцию: на-трийуретическое действие, высвобождение NO и простациклина и антипролифератив-ное действие. На данный момент описано пять полиморфных вариантов в гене AGTR2 (Herrmann et al., 2002; Jin et al., 2003; Jones et al., 2003a). Наиболее изученным является 31230A вариант. Он сцеплен с вариантом +1675G A в интроне 1, влияющим на старт транскрипции. Показана ассоциация 3123А варианта с гипертензией у женщин (Jones et al, 2003а). 1.2.4.6 Рецептор 2 к брадикинину. Ген рецептора 2 к брадикинину (BKR2) расположен на длинном плече 14-й хромосомы в локусе 14q32.1-q32.2.
Он содержит 3 экзона, и его размер составляет 39,5 т.п.о. BKR2 экспрессирует транскрипт около 1,2 т.п.о. Молекулярный вес белкового продукта гена BKR2 составляет 55 кДа. Его первичная структура состоит из 391 а.к. Брадикининовыи рецептор экспрессируется в различных органах и тканях, в том числе и в эндотелии. Он участвует в вазорелаксации сосудов, стимулируя выработку эндоте-лиальной NO-синтазы и последующую генерацию NO ("GeneCards"; "NCBI"; Lung et al, 1997; Mukae et al, 2002; Dhamrait et al, 2003; Williams et al, 2005). На сегодняшний день известно два полиморфных варианта в гене брадикинино-вого рецептора: это замена в -58 позиции тимина на цитозин (-58Т С) и инсер-ция/делеция 9-ти нуклеотидов в 1-ом экзоне (I/D полиморфизм). Показано, что у носителей как Т, так и D-аллели экспрессия гена выше, чем у носителей С или /-аллели. Высокая экспрессия гена обуславливает появление большего числа рецепторов на клетку, а значит и более выраженную вазодилатацию. В связи, с этим ряд авторов полагает, что аллели С и I могут быть ассоциированы с артериальной гипертензией, а также с повышенными характеристиками выносливости у спортсменов (Mukae et al, 2002; Dhamrait et al, 2003). 1.2.5 Комплексное изучение ассоциации полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы с предрасположенностью к артериальной гипертензии. В настоящее время известно, что в большинстве случаев мультифакториальная природа артериальной гипертензии обусловлена генетическим полиморфизмом ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем. Эти заключения основываются на многочисленных исследованиях проведенных при изучении ассоциации АГ с полиморфными вариантами генов этих систем (Naber et al, 2004a,b). Рядом авторов обнаружена связь данного заболевания с некоторыми другими генами, например, метилен-тетрогидрофолатредуктазой, бэта-адренорецептором, рз-субъединицей G-белка и дру- гими (Шляхто и Конради, 2002; Пузырев, 2003; Bray et al, 2000; Heux et al, 2004). Однако большинство исследований, не касающиеся ренин-ангиотензинового каскада, либо слишком малочисленны, либо затрагивают лишь отдельные этапы биохимических цепочек, и на основе их нельзя судить о вовлеченности данного гена (полиморфизма) в этиологию артериальной гипертензии. Поэтому для анализа сложных признаков многие исследователи используют новейшие методические подходы, такие как мета-анализ, анализ гаплотипов и изучение ген-генных взаимодействий. Мета-анализ подразумевает под собой количественный анализ объединенных данных нескольких исследований одного и того же полиморфизма при одном и том же заболевании. Такой подход обеспечивает большую статистическую мощность, чем каждое отдельное исследование, за счет увеличения размера выборки.
Анализ ПЦР продуктов методом ПААГ
Продукты амплификации (фрагментов генов АСЕ и BKR2) разделяли в 6% геле, приготовленном на 1х трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикального электрофореза, с длиной стекла 15-20см. Исходные растворы для приготовления 30% ПААГ на 100 мл водного раствора: 29 г акриламида (Sigma ,USA), 1г 1,М-метил - бисакриламида ("Sigma", США); 10х ТБЕ на 500 мл водного раствора: 54 г Tris ("Serva, Германия"), 27.5г борной кислоты ("Serva", Германия), 20 мл 0.5 М ЭДТА ("Serva", Германия) рН 8.0. Для приготовления 50 мл 6% геля смешивали 10 мл 30% акриламида, 5 мл 10х ТВЕ, 35 мл дистиллированной воды, 50 мкл тетраэтилендиамина, 500 мкл персульфата аммония. Перед заливкой раствор тщательно перемешивали. После амплификации 10 мкл ПЦР продукта непосредственно перед нанесением смешивали с 2 мкл буфера для нанесения проб (состав 6-кратного буфера для нанесе-ния проб: 0,25% бромфенола и 0,25% ксиленцианола, 15% фикола) и аккуратно помещали в лунки геля под буфер. Электрофорез проводили при напряжении 80 вольт в течение первых 15 минут. В дальнейшем напряжение увеличивали до 250 вольт. За ходом разделения фрагментов следили по миграции красителей (движение бромфенола в 6% ПААГ эквивалентно миграции фрагмента ДНК размером 65 п.о., а ксиленцианола - 260 п.о). Заканчивали электрофорез при выходе бромфенола из геля. Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл). Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК регистрировали при фотографировании геля, помещенного на трансиллюминатор Macrovue (LKB, Великобритания). 2.6 Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле. Наличие ПЦР продуктов, необходимых для гибридизации на олигонуклеотид-ном биочипе анализировали в 2 % геле, приготовленном на 1х трис-ацетатном буфере (ТАЕ) в аппарате для горизонтального электрофореза. Исходные растворы для приготовления 2% агарозного геля на 100 мл водного раствора: 2 г агарозы (DNA Grade, "Bio Rad", США), 2 мл 50хТАЕ; 50хТАЕ на 100 мл водного раствора: 24.2 г Tris ("Serva", Германия), 5.7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0.5 М ЭДТА ("Serva", Германия) рН 8.0. После амплификации 10 мкл ПЦР продукта непосредственно перед нанесением смешивают с 2 мкл буфера для нанесения проб (состав 6-кратного буфера для нанесения проб: 0,25% бромфенола и 15% фикола) и аккуратно помещали в лунки геля под " буфер- IЭлектрофорез проводили при напряжении 170 вольт в течение 20 минут.
Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК регистрировали при фотографировании геля, помещенного на трансиллюминатор Macrovue (LKB, Великобритания). 2.7 Гибридизация меченого продукта на микрочипе. Гибридизацию на микрочипах проводили с использованием флуоресцентно меченых образцов, полученных на второй стадии мультиплексной ПЦР, в 32 мкл смеси следующего состава: 8 мкл формамида ("Serva", Германия), 8 мкл 20х SSPE На основе анализа многочисленных данных зарубежной и отечественной литературы для определения индивидуальной чувствительности к фармацевтическим препаратам и изучения генетической предрасположенности к некоторым мультифакториальным заболеваниям, в том числе и онкологическим, наибольший интерес представляют аллельные варианты следующих генов: CYP1A1 (48870А, 4889A G и 6235Т С), CYP2D6 (1934G A и 2637delA), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481Т С, 590A G и 857A G), MTHFR (6770Т), CYP2C9 (430ОТ и 1075ОТ) и CYP2C19 (681G A) (Akhmedova et al., 1996; Sachse et al, 1997; Баранов и др., 2000, 2003; Krajinovic et al, 2002; Meyer and Ginsburg, 2002; Ляхович и Вавилин, 2003; Коваленко, 2003; Иващенко и др., 2004; Глотов и др., 2005). Эти гены кодируют белки, участвующие в метаболизме (дезактивации и детоксикации) ксенобиотиков. Совместное функционирование ферментов данной системы обеспечивает обезвреживание десятков тысяч ксенобиотиков различной химической природы. Изменение активности ферментов системы детоксикации и несбалансированность работы ее отдельных фаз приводит к повышенной восприимчивости организма к вредным воздействиям и, как следствие, к увеличению риска развития различных заболеваний. Для изучения нами выбраны функционально значимые аллели, встречающиеся с наибольшей частотой. Более того, в биочип включены только те гены, полиморфизм которых уже изучен в ряде популяций России (Баранов и др., 2000, 2003; Ляхович и Вавилин, 2003; Коваленко, 2003; Иващенко и др., 2004). 3.1.1.2 Выбор нуклеотидных последовательностей и длин ПНР продуктов, последовательностей концевых (F & R) праймеров и последовательностей иммобилизованных олигонуклеотидных зондов. Для поиска нуклеотидных последовательностей и идентификации полиморфных вариантов, интересующих нас генов, были использованы следующие стратегии: 1. поиск SNP в интернет-базах данных; 2. анализ данных литературы.
После идентификации SNP для дальнейшего подбора праймеров и олигонуклеотидных зондов мы использовали нуклеотидную последовательность в пределах 1000 п.н. (по 500 п.н. в обе стороны от полиморфного нуклеотида). Последовательности праймеров выбирали с учетом того, что ПЦР продукт, полученный в первом раунде амплификации должен обеспечивать специфичность наработки фрагмента (который может быть длиной до 700-800 п.н. для каждого гена), а ПЦР продукт во втором раунде - необходимое для анализа количество этого продукта (оптимальный размер (100-300 п.н.) (Kolchinsky and Mirzabekov, 2002; Грядунов, 2003; Mitiaeva et al, 2004; Глотов и др., 2005). Известно, что эффективность ПЦР во многом зависит от правильного выбора праймеров, принимающих участие в амплификации исследуемого фрагмента ДНК. В связи с этим, подбор праймеров проведен согласно следующим критериям: отсутствие внутренней вторичной структуры; сбалансированный состав и равномерное распределение G/C и А/Т пар по всей последовательности; отсутствие комплементарности между 3 -концами, что может быть причиной образования димеров праймеров; наличие единой температуры плавления (разброс температур плавления праймеров не более 1С от среднего значения); отсутствие комплементарности последовательностей праймеров для 1-го раунда с последовательностями других генов в геноме человека. На рис. 10 приведен интерфейс программы "Oligo 6", используемой при подборе праймеров первого раунда для гена MTHFR. Показан этап анализа по выявлению наличия/отсутствия димеров между праймерами (F и R). При выборе иммобилизованных олигонуклеотидных зондов мы руководствовались подходами, определенными как на основании информации, доступной из источников литературы (Fotin et al, 1998; Грядунов, 2003), так и из собственных эмпирических наблюдений: зонд должен обладать высокой специфичностью к ПЦР продукту 2-го раунда, содержащему точечную мутацию, и высокой дискриминирующей способностью. Вышеуказанным требованием в общем случае удовлетворяет длина зондов от 15 до 24 нуклеотидов. Вариабельный нуклеотид должен находиться в серединной области зонда. Такое положение в большинстве случаев позволяет добиться большей дискриминации между "совершенными" и "несовершенными" дуплексами, поскольку терминальные "мисматчи" более стабильны, чем "мисматчи", находящиеся в середине олигонуклеотида.
Создание "кардиочипа"
При создании "кардиочипа" был использован разработанный нами алгоритм. Для выявления генетической предрасположенности к артериальной гипертензии были выбраны полиморфные варианты следующих генов: REN (19-83G A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166А С), AGTR2 (31230А), BKR2 (-58Т С), MTHFR (6770Т), ADRB2 (48A G и 810G). Белковые продукты генов ренин-ангиотензиновой системы (REN, AGT, AGTR1, AGTR2) являются одними из наиболее важных регуляторов кровяного давления и гомеостатической функции почки, обеспечивая поддержание жизненно необходимых процессов в организме. Брадикининовый рецептор II участвует в вазорелаксации сосудов, стимулируя выработку эндотелиальной NO-синтазы и последующую генерацию N0, метилентетрогидрофолатредуктаза участвует в обмене гомоцистеина, катализируя превращение 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилентетрагидрофолат - субстрат для реметилирования гомоцистеина в метионин, ADRB2 активирует аденилатциклазу через G-белок, влияя, таким образом, на артериальное давление. Популяционные частоты аллелей генов предложенные для их включения в «кардиочип» известны и они функционально значимы (смотреть п. 1.2.4). Микрочип был протестирован на 20-ти контрольных и более 50-ти клинических образцах. Результаты тестирования контрольных образцов (идентификация мутаций в них проводили другими методами - ПДРФ, секвенирование и другие) показали полное совпадение. Анализ клинических образцов выявил одно расхождение из 400 проанализированных полиморфных вариантов. Таким образом, точность (специфичность) метода составила 99,8%. Чувствительность данного биочипа была сопоставима с таковой для "фармакогенетического биочипа" и составила Юнг геномной ДНК. 3.3 Сравнение гибридизации на биочипах с классическими методами анализа генетического полиморфизма. На сегодняшний день существует огромное количество разнообразных методов анализа генетического полиморфизма (интернет-сайт: www.molbiol.ru). К ним относятся и ПДРФ-анализ, и анализ длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ), и методы, основанные на лигазной реакции, аллель-специфичная ПЦР (АС-ПЦР), анализ конформациошюго полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP), гетеродуплексный анализ, секвенирование ДНК и многие другие.
Однако в клинической практике наибольшее распространение получил только метод ПДРФ, благодаря своей простоте и низкой стоимости. Технология микрочипов обладает рядом преимуществ по сравнению с классическими методами анализа. Основные среди них - это низкая себестоимость анализа (проведение реакции в микрообъеме), увеличение чувствительности, уменьшение числа параллельных реакций, возможность увеличения информационной емкости системы без существенного усложнения методики (анализ большого числа локусов одновременно), снижение трудоемкости, и возможность автоматизации процедуры анализа. Сравнительные характеристики технологии микрочипов и метода ПДРФ приведены в таблице 10. Как уже упоминалось ранее, большой интерес представляет создание "тематических" биочипов с определенным набором генов и мутаций (Labuda et al, 1999; Wen et al, 2003; Liljedahl et al, 2003; Глотов и др., 2005). Разработанные нами биочипы для анализа генетического полиморфизма можно отнести к последней группе. Они заметно ускоряют процедуру анализа по сравнению с методом ПДРФ (табл. 10), снижают себестоимость анализа и трудозатраты (в полтора-два раза), позволяя анализировать не менее 14-ти мутаций одновременно. Изучение генетической предрасположенности к многофакторным и инфекционным заболеваниям, фармакогенетика, создание "генетического паспорта", все это немыслимо без разработки новых методов исследования. На сегодняшний день наиболее подходящим методом для этих развивающихся направлений медицины и биологии является анализ, основанный на диагностике с помощью биочипов. Биочипы, в отличие от "Realime" технологий, позволяют анализировать множество мутаций у одного человека одновременно, что абсолютно необходимо для создания персонифицированной медицины. С помощью разработанного нами биочипа на гены системы биотрансформации можно проводить исследования не только по изучению генетической предрасположенности к раку легкого, лейкозу, эпилепсии, эндометриозу, псориазу и многим другим заболеваниям, но и использовать полученные с его помощью результаты по генотипированию для коррекции дозы лекарственных препаратов. "Кардиочип" подходит не только для изучения предрасположенности к артериальной гипертензии (об этом будет сказано в последующих главах), но и в сочетании с "фармакогенетическим биочипом" может быть использован для тестирования генов при создании "генетического паспорта". Кроме того, примененный нами блочный подход конструирования биочипа позволяет достаточно легко модифицировать биочипы: заменять и добавлять новые блоки и гены в зависимости от конкретной исследовательской или диагностической задачи. 3.5. Анализ полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем у больных артериальной гипертензией и в контроле.
Для изучения комплексного влияния генетических факторов на предрасположенность того или иного индивидуума к артериальной гипертензии мы выбрали ренин-ангиотензиновый и, примыкающий к нему, кинин-брадикининовый каскады. Данные каскады представляют собой целостную систему последовательно и параллельно связанных биохимических реакций. Такая особенность данной системы создает возможность анализа влияния не только каждого отдельно взятого полиморфного варианта на предрасположенность к заболеванию, но и позволяет проанализировать и разработать подходы комплексной оценки взаимодействия этих вариантов. 3.5.1 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле. 3.5.1.1 Анализ соответствия распределений закону Харди-Вайнберга. Нами был проведен анализ наблюдаемых и ожидаемых частот генотипов генов REN (I9-83G A), AGT (М235Т), АСЕ (I/D), BKR2 (-58Т С и I/D) AGTR1 (И66А С), AGTR2 (31230А), в группе детей, больных артериальной гипертонией, и в контрольной группе. Для полиморфизма гена REN было показано, что распределение генотипов в контрольной группе детей школьного возраста (как среди мальчиков, так и среди девочек) соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р 0.05, 2.65). Однако анализ наблюдаемых и ожидаемых частот данного гена в группе детей, больных гипертонией выявил отклонение от распределения Харди-Вайнберга (р 0.01,3 =8.05). Данные отличия были связаны с особенностями распределения генотипов для больных мальчиков (рО.01, х2=8-52, для мальчиков и р 0.05, =0.34, для девочек, соответственно). Для полиморфизма гена AGT анализ ожидаемых и наблюдаемых частот генотипов не выявил различий как в группе детей больных артериальной гипертензией, так и в контроле (р 0.05, 0.22). Аналогичные результаты были показаны для полиморфизма гена АСЕ (р 0.05, х О-29), двух полиморфных вариантов гена BKR2 (р 0.05, x O.SS), а так же для полиморфизма гена AGTR1 (р 0.05, х2 0.53). При анализе полиморфизма гена AGTR2 распределение генотипов не соответствовало распределению Харди-Вайнберга как для больных гипертонией (рО.0001, х бО.68), так и для контроля (рО.001, 22.94). Несоответствие ожидаемых частот наблюдаемым связано с тем, что данный ген локализован на длинном плече X хромосомы в локусе Xq22-q23: отличие между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами было показано только для мальчиков (рО.0001, %2 51.23), тогда как для девочек такого отличия выявлено не было (р 0.05, х О.Зб). 3.5.1.2 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов. Для выявления возможной взаимосвязи генотип-фенотип мы провели сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов между выборкой детей, больных гипертонией, и контролем, а также между подгруппами больных. При сравнении анализируемой группы и группы сравнения учитывали различия по полу, если распределение генотипов для мальчиков и/или девочек было различно.
