Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и методы
1.1. Вирусы, клеточные культуры, лабораторные животные, препараты 49
1.2. Методы исследования 50
1.2.1. Реакция нейтрализации 50
1.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител (МФА) 50
1.2.3. Метод бляшкообразования 51
1.2.4. Получение антигенов вируса ЛДР 51
1.2.5. Получение гипериммунной асцитной жидкости к ВЛДР. 52
1.2.6. Выделение специфических IgG-антител на протеин А-сефарозе 52
1.2.7. Конъюгирование специфических IgG-антител с пероксидазой хрена 52
1.2.8. ИФА для выявления специфического антигена ВЛДР 53
1.2.9. Выделение РНК вируса ЛДР из различных образцов 53
1.2.10. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса ЛДР 54
1.2.11. Анализ результатов ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени 56
1.2.12. Конструирование генно-инженерного положительного контроля 57
1.2.13. Определение первичной нуклеотидной последовательности генаОпВЛДР 59
1.2.14. Построение филогенетического дерева 60
Результаты исследований
Глава 2. Культивирование и идентификация штамма Entebbe вируса ЛДР 62
Глава 3. Филогенетический анализ штамма Entebbe вируса ЛДР
3.1. Определение полной нуклеотидной последовательности гена Gn вируса ЛДР 64
3.2. Построение филогенетического дерева 65
3.3. Определение различий в антигенных детерминантах гена Gn у близких штаммов ВЛДР 67
Глава 4. Разработка тест-систем «гнездовой» ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса ЛДР
4.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР 68
4.2. Определение специфичности ПЦР тест-систем 73
4.3. Определение чувствительности ПЦР тест-систем 74
4.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-систем ПЦР 76
Глава 5. Разработка и характеристика тест-системы ИФА для выявления антигена вируса ЛДР
5.1. Антигены, иммуноглобулины, конъюгаты 78
5.2. Определение специфичности метода ИФА 80
5.3. Определение чувствительности метода ИФА 81
Глава 6. Изучение действия рибавирина и его производных на цитопатогенную активность вируса ЛДР 82
Обсуждение результатов 86
Выводы 95
Список литературы
- Непрямой метод флуоресцирующих антител (МФА)
- Построение филогенетического дерева
- Определение специфичности ПЦР тест-систем
- Определение специфичности метода ИФА
Введение к работе
Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - это зоонозная, особоопасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока. Вирус ЛДР относится к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridae. Он обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. В эндемичных регионах заболеваемость ЛДР регистрируется в виде спорадических случаев, эпидемических вспышек крупных эпидемий и эпизоотии.
У человека болезнь в основном проявляется как гриппоподобная лихорадка и в большинстве случаев заканчивается выздоровлением. Средний уровень летальности составляет приблизительно 3%, однако развитие отягченных форм заболевания, сопровождающихся геморрагическим синдромом, некрозом печени и менингоэнцефалитами, приводит к резкому увеличению летальности (до 30%). Такие осложненные формы ЛДР наиболее часто наблюдаются во время эпидемий, которым предшествовали эпизоотии среди домашних животных [63].
Лихорадка передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. По этим причинам, группу наибольшего риска заболевания ЛДР составляют фермеры, ветеринары, пастухи, работники скотобоен и лабораторный персонал, осуществляющий манипуляции с вирусом [47].
Развитие эпизоотии и эпидемий, интервал между которыми составляет несколько лет, связано с выпадением обильных осадков, когда происходит массовое размножение комаров [55].
Крупные эпидемии и эпизоотии были* зарегистрированы в ЮАР (1974-75 гг.), Египте (1977-78 гг.), Мавритании (1987 г.), на Мадагаскаре (1991 г.), в Кении (1997 г.), в Саудовской Аравии и Йемене (2000-01 гг.) [14]. Во время
масштабной эпидемии в Египте в 1977-78 годах было зарегистрировано 18000 случаев ЛДР с 600 летальными исходами [63]. В Саудовскую Аравию и Йемен, впервые за пределы Африки, вирус распространился, вероятно, с инфицированным домашним скотом из Восточной Африки или был перенесен комарами [59].
Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, так как обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных [63].
Наряду с другими нозологическими формами вирусных геморрагических лихорадок ЛДР относится к категории карантинных инфекций и требует особого внимания к завозу этого заболевания из эндемичных регионов инфицированными лицами. Импорт копытных животных также может быть причиной интродукции вируса ЛДР на неэндемичные территории. Наконец, вирус ЛДР рассматривается (наряду с вирусами других геморрагических лихорадок) в качестве агента высшей категории «А» для применения в биотеррористических целях [29].
В связи с вышеперечисленными обстоятельствами разработка и совершенствование методов специфической диагностики и средств лечения ЛДР на основе всестороннего изучения свойств вируса ЛДР представляются актуальными направлениями для науки и практики, учитывая факт отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов.
Цели и задачи исследования
Цели настоящего исследования заключались:
в проведении филогенетических исследований референтного штамма Entebbe вируса ЛДР;
в создании отечественных тест-систем на основе совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), и иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики ЛДР;
- в изучении действия лекарственных препаратов на цитопатогенную активность вируса ЛДР.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
1. Культивировать и идентифицировать штамм Entebbe вируса ЛДР из
коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов.
2. Определить полную нуклеотидную последовательность гена Gn
референтного штамма вируса ЛДР. Определить филогенетические связи
референтного штамма Entebbe вируса ЛДР с другими штаммами этого вируса
на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Gn.
Проанализировать аминокислотные замены в антигенных эпитопах
гликопротеина Gn у близких к референтному штаммов;
3. Разработать тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в
реальном времени для диагностики ЛДР, отработать условия ПЦР на
референтном штамме. Определить чувствительность и специфичность
разработанных тест-систем.
4. Сконструировать генно-инженерный положительный контроль для
использования в тест-системах ПЦР.
Разработать тест-систему ИФА для выявления антигена вируса ЛДР, определить ее чувствительность и специфичность. Сравнить чувствительность ИФА и ПЦР тест-систем.
Изучить действие отечественного препарата «рибавирин», синтезированного в Институте биоорганической химии с помощью нового биотехнологического метода, и производных данного препарата на цитопатогенную активность вируса ЛДР.
Научная новизна и практическая значимость
1. Проведены филогенетические исследования референтного штамма
Entebbe вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации
арбовирусов. Установлены значимые различия в аминокислотных
последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn у двух линий
штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn вируса ЛДР, что можно объяснить различиями в условиях культивирования этих штаммов.
2. Созданы отечественные тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР
и ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики ЛДР с использованием
оригинальных праймеров. Тест-системы для диагностики лихорадки долины
Рифт могут быть использованы в диагностических лабораториях и
ветеринарных хозяйствах. Разработанные тест-системы прошли
сертификацию во Всероссийском Государственном центре качества и
стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ).
Подготовлены проекты стандартов организации (СТО) и наставления для
данных тест-систем.
Сконструирован генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР.
Разработана .и охарактеризована тест-система ИФА для выявления антигена вируса ЛДР. Подготовлены компоненты, необходимые для создания тест-систем ИФА для выявления антител классов М и G к вирусу ЛДР.
В опытах in vitro на модели вируса ЛДР впервые проведено изучение противовирусной активности отечественного препарата «рибавирин» и его производных, полученных в Институте биоорганической химии при помощи нового биотехнологического метода. Отечественный рибавирин, в отличие от тестированных серий его производных, обладал выраженным противовирусным действием.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участка гена Gn (736 нуклеотидных оснований) штаммов вируса ЛДР показал, что наиболее близким к штамму Entebbe является штамм Lunyo. Показано различие аминокислотных последовательностей антигенных эпитопов гликопротеина Gn у двух линий штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn.
Разработаны чувствительные и специфичные тест-системы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса ЛДР. Чувствительность обоих диагностикумов составила 7 БОЕ.
Сконструирован генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР, представляющий собой бактериальную плазмиду со вставкой фрагмента гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР.
Разработана и охарактеризована высокоспецифичная тест-система ИФА для выявления антигена вируса ЛДР. Ее чувствительность составила 2,1x10 БОЕ, то есть оказалась на порядок ниже чувствительности тест-систем ПЦР.
Исследована (противовирусная, активность отечественного препарата «рибавирин», синтезированного с использованием нового биотехнологического метода. Показано, что данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса ЛДР в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 4,0 lglin^o при максимальной концентрации препарата (1000 мкг/мл). Наряду с этим, испытанные серии производных рибавирина не обладали противовирусной активностью в отношении вируса ЛДР.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение заболеваний, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г.) и на расширенном пленуме проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября 2006 г.).
Материалы диссертации были доложены и рассмотрены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 13 сентября 2007 г.
Публикации
По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в центральных научных журналах и 3 тезисов докладов в сборниках конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, 6 глав Собственных исследований, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы (10 отечественных, 97 зарубежных авторов). Объем работы составляет 108 страниц машинописного текста, иллюстрированного 8 таблицами и 11 рисунками.
Непрямой метод флуоресцирующих антител (МФА)
Лунки 96-луночных панелей (Dynatech, Германия) сорбировали мышиными поликлональными антителами против ВЛДР, разведенными карбонатным-бикарбонатным буфером (из расчета 1 мкг белка на лунку). Затем вносили мозговые или печеночные антигены, разведенные в фосфатном буфере (рН=7,2), а после инкубации - мышиные поликлональные антитела против ВЛДР, меченные пероксидазой хрена. Проявление реакции осуществляли добавлением в каждую лунку 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора: 0,4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,1М цитратно-фосфатном буфере рН=5,0 с добавлением 0,002 мкл/мл 3% перекиси водорода. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре (Flow, США) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали нормальные контрольные антигены. Положительной считали реакцию, когда значение ОП450 исследуемого образца составляло не менее 0,300. :;
Выделение РНК ВЛДР из различных образцов
Выделение РНК ВЛДР из различных образцов (зараженные клетки, органы, ткани) проводили двумя способами: с использованием реагента "Тризол" (Trizol Reagent, Gibco BRL) для выделения преимущественно из жидких образцов, и неорганического сорбента (НПО «НАРВАК», Россия).
При выделении с помощью "Тризола" к 250 мкл жидкого образца добавляли 250 мкл тризола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли 100 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали на 13000 об/мин при +4С в течение 15 минут. Затем отбирали верхнюю фазу и добавляли к ней равный объем изопропанола. Инкубировали при -20С в течение 20 минут. Затем центрифугировали 15 минут при 13000 об/мин при +4С. Образовавшийся осадок РНК промывали дважды 75% этанолом. Затем осадок подсушивали при 37С в течение 20-30 минут и растворяли в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом.
При выделении с использованием неорганического сорбента к 200 мкл образца добавляли 600 мкл лизирующего буфера (5М гуанидинтиоцианат, 50мМ Tris-HCl рН=6,4, 22мМ ЭДТА рН=8,0, 0,01% Triton Х-100), перемешивали и инкубировали в течение 10 минут. Затем переносили надосадок в новую пробирку, добавляли 20 мкл сорбента и инкубировали 10 минут при комнатной температуре, периодически перемешивая. Центрифугировали 30 секунд при 13000 об/мин и удаляли надосадок. Затем промывали осадок сорбента 2 раза с использованием 200 мкл промывочного буфера (5М гуанидинтиоцианат, 50мМ Tris-HCl рН=6,4), и 2 раза с использованием 70% этилового спирта. Осадок подсушивали в течение 10 минут при 56С и затем элюировали РНК с сорбента в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом [2].
«Гнездовую» ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в тонкостенных пробирках объемом 0,5 мл и тонкостенных пробирках с оптически прозрачными крышками объемом 0,2 мл соответственно.
Первый раунд ПЦР, совмещенный с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) проводили .в конечном, объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 0,5 ед. M-MLV ревертазы, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin, 10 мМ Tris-HCl (рН=9.0), 50 мМ КС1, 0,1% Triton X-100, l,5MMMgCl2. Второй раунд ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ Tris-HCl (рН=9,0), 50 мМ КС1, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCl2.
ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 пМ каждого праймера, 10 пМ зонда, 0,25 мМ каждого dNTP, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 0,5 ед. M-MLV ревертазы, 10 мМ Tris-HCl (рН=9,0), 50 мМ КС1, 0,1% Triton Х-100,1,5 мМ MgCl2.
«Гнездовую» ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на приборе ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, США). Последовательности специфических олигонуклеотидов разрабатывали в программе Oligo 4,0 (США) на основе консенсусной последовательности гена нуклеокапсидного белка N референтных штаммов вируса ЛДР, представленных в базе данных GenBank.
Построение филогенетического дерева
Для филогенетического анализа были использованы нуклеотидные последовательности участка гена Gn размером 736 нуклеотидных оснований. Для исследования были взяты последовательности Gn 40 штаммов вируса ЛДР, размещенные в базе данных GenBank (Табл. 5).
Результаты филогенетического анализа показали, что референтный штамм Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов (изолирован из комаров в Уганде в 1944 году) наиболее близок штамму Lunyo (изолирован из комаров в Уганде в 1955 году) (Рис. 4). Несмотря на дистанцию во времени, изоляции,, нуклеотидные .последовательности выбранного участка гена Gn этих двух штаммов оказались гомологичными на 99,5%.
Гораздо более существенными оказались различия нуклеотидных последовательностей участка гена Gn у двух линий штамма Entebbe. Штамм Entebbe из GenBank оказался ближе штамму Smithburn, который представляет собой аттенуированный вариант штамма Entebbe. Гомология нуклеотидных последовательностей двух линий штамма Entebbe составила 97,9%, а гомология последовательностей штамма Entebbe из GenBank и штамма Smithburn - 99%. 30 95
Филогенетические взаимосвязи различных штаммов вируса ЛДР, определенные на основе анализа участка гена Gn размером 736 нуклеотидных оснований. Числа обозначают вероятность ветвления в данной позиции. Рамкой отмечен штамм Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов. Филогенетический анализ проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 3.1).
Определение различий в антигенных детерминантах гликопротеина Gn у близких штаммов вируса ЛДР
Следующей задачей явилось определение различий в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина Gn у близких штаммов вируса ЛДР. В пределах гликопротеина Gn находятся 4 антигенных детерминанты. Эпитопы I, II и IV являются мишенью для вируснейтрализующих антител, а с эпитопом III взаимодействуют антитела, не обладающие нейтрализующей активностью. Эпитопы I, II и III являются линейными, а эпитоп IV - конформационный. Эпитопы I и IV частично перекрываются [51].
Было показано, что аминокислотные последовательности нейтрализующих эпитопов I и IV гена Gn штамма Smithbum отличаются от последовательностей эпитопов двух линий штамма Entebbe (Рис. 5).
1 - штамма Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов; 2 - штамма Entebbe из GenBank; 3 - штамма Smithbum. Римскими цифрами обозначены антигенные эпитопы. У штамма Smithburn в эпитопе I тирозин в положении 131 заменен на гистидин, а в эпитопе IV лизин в положении 150 заменен на глутаминовую кислоту. Данные замены существенны, так как замещающие аминокислоты обладают противоположным зарядом. Вследствие этого конформация эпитопа IV может быть изменена. Вероятно, именно эти замены являются причиной снижения вирулентности штамма Smithburn.
У штамма Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов треонин в положении 246 заменен на изолейцин (Рис. 5). Данная замена также существенна, так как изолейцин, в отличие от треонина, является гидрофобной аминокислотой. Эпитоп III идентичен у всех представленных штаммов.
Тест-система на основе «гнездового» варианта ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса ЛДР была разработана на базе лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ вирусологии.
Олигонуклеотидные праимеры для проведения «гнездовой» ОТ-ПЦР были подобраны на основе сравнительного анализа последовательностей генома следующих штаммов вируса ЛДР: В Egy 93, клон 13, Н Egy 93, Smithburn, MP 12, ZH 548. Праимеры были комплементарны последовательности гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР и амплифицировали фрагменты длиной 405 пар нуклеотидов (п.н.) после первого раунда ПЦР и 203 п.н. (после второго раунда ПЦР) (Рис. 6.А).
Подбор олигонуклеотидных праймеров и зонда для тест-системы ОТ-ПЦР не представлял трудностей, так как последовательности генов нуклеокапсидного белка N представленных штаммов отличались высокой консервативностью (Рис. 6.Б).
В результате были подобраны олигонуклеотиды со сходными температурами плавления (Тт). Температура плавления праймеров различалась не более чем на 1UC. Температуру отжига праймеров вычисляли по упрощенной формуле: 4GC+2AT)-5C, где AT - суммарное содержание нуклеотидов А и Т, GC - суммарное содержание нуклеотидов G и С в праймере. Расчетная температура отжига составила 57С. При подборе пар праймеров особое внимание обращали на то, чтобы последние 3-4 нуклеотида на З -конце праймера были комплементарны консервативной области генома вируса (Рис. 6.Б).
Определение специфичности ПЦР тест-систем
Тест-система ИФА для выявления антигена ВЛДР была создана на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Для получения антигена проводили внутримозговое заражение новорожденных белых мышей дозой вируса 4,0 lgTjTmso. Источником антигенов являлись мозг и печень больных животных. Приготовление антигенов в обоих случаях проводили методом сахарозо-ацетоновой экстракции с последующей инактивацией вируса 0,01% раствором Р-пропиолактона.с- Предварительно нами; было установлено, что после экстракции мозговой суспензии ацетоном инфекционная активность вируса ЛДР сохраняется. Все новорожденные белые мыши, зараженные полученным сахарозо-ацетоновым антигеном (без добавления в него р-пропиолактона) заболели и погибли.
После добавления р-пропиолактона и инкубации суспензий в течение 7 дней антигены оказались инактивированными: клинические признаки заболевания у зараженных н.б.м. отсутствовали.
Специфичные к ВЛДР IgG получали из иммунных асцитных жидкостей мышей методом аффинной її-хроматографии при помощи протеин А-сефарозы. Для работы были использованы иммунные асцитные жидкости с титром специфических антител не ниже 1:320. Иммуноглобулины IgG к вирусу ЛДР были конъюгированы с пероксидазой хрена.
На следующем этапе проводили определение оптимальных рабочих разведений полученных компонентов. Иммуноглобулины использовали в четырех концентрациях: 10, 20, 30 и 40 мкг/мл. Было показано, что реакция проходит одинаково хорошо при любой из указанных концентраций. Исходя из этого, в дальнейшем для сорбирования на планшеты использовали иммуноглобулины в концентрации 10 мкг/мл.
В результате титрования в ИФА мозгового и печеночного антигенов было установлено, что они имеют различную специфическую активность. Печеночный антиген оказался намного активнее (1:102400), чем мозговой (1:400) (Рис. 10).
Положительными считали такие пробы, значение оптической плотности (ОП450) которых было не ниже 0,300. Для контроля реакции использовали нормальные глобулины, полученные из асцитных жидкостей неиммунизированных мышей, а также нормальные антигены, приготовленные из мозга незараженных мышей. В лунках планшеты с контрольными глобулинами и антигенами положительные сигналы не отмечались, что свидетельствовало о специфичности выявляемых результатов ИФА.
Для исследования специфичности метода использовали мозговые суспензии и сахарозо-ацетоновые антигены вирусов рода Phlebovirus из группы москитных лихорадок (Кандиру, Арбия, Салехабад, Каримабад, Тоскана, вирусы неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок), а также сахарозо-ацетоновые антигены вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила (семейство Flaviviridae). В качестве отрицательного контроля использовали антиген, полученный из мозга незараженных мышей, в качестве положительного - печеночный антиген ВЛДР.
Результаты опыта показали отсутствие перекрестной реактивности у иммуноглобулинов к ВЛДР в том случае, когда антигены титровали начиная с разведения 1:100. При разведении антигенов 1:20 в лунке, содержащей антиген вируса Неаполитанской москитной лихорадки, регистрировали положительный сигнал (ОІІ450=0,511). Значения величин оптической плотности для остальных антигенов, кроме антигена ВЛДР, оставались отрицательными.
Таким образом, иммуноглобулины к вирусу ЛДР не взаимодействовали с антигенами вирусов москитных лихорадок, клещевого энцефалита, Западного Нила и нормальным антигеном, что свидетельствует о высокой специфичности метода и компонентов, используемых в реакции. Исключение составил лишь антиген вируса Неаполитанской москитной лихорадки, в отношении которого обнаружилась небольшая перекрестная реактивность с антигеном ВЛДР.
Для определения чувствительности метода ИФА проводили тестирование мозговой суспензии, которая была использована при титровании вируса ЛДР методом бляшек. Реакцию проводили параллельно на планшетах с сорбированным специфическим к ВЛДР иммуноглобулином и контрольным глобулином, полученным из АЖ нормальных, неиммунизированных мышей. В качестве положительного контроля использовали печеночный антиген ВЛДР, в качестве отрицательного - антиген, полученный из мозга незараженных мышей. Титровать антиген и мозговую суспензию начинали с разведения 10"2 и заканчивали разведением 10"13.
Наличие положительного сигнала было зарегистрировано в тех лунках, которые содержали мозговые суспензии в разведениях 10 2 - 10 4. Антиген в мозговых суспензиях более высоких разведений при помощи данного метода не был выявлен. В планшете с сорбированным контрольным глобулином не было обнаружено ни одной положительной пробы.
Определение специфичности метода ИФА
Что касается специфичности, то разработанные отечественные тест-системы не уступают в этом отношении зарубежным аналогам. Тестирование родственных вирусов показало высокую специфичность подобранных праймеров, отсутствие перекрестной реактивности с другими представителями рода Phlebovirus; \ І t І І Г Л М
Создание генно-инженерного положительного контроля, несомненно, очень важно при производстве тест-систем. Наличие такого неинфекционного, стабильного контроля позволяет комплектовщикам тест-систем избежать риска заражения ЛДР при альтернативном использовании термолабильного вируссодержащего материала. Неинфекционная плазмида же является наиболее стабильной молекулой, поэтому наличие генно-инженерного контроля всегда предпочтительнее.
Титрование рекомбинантной плазмиды показало, что разработанные тест-системы позволяют выявлять.5,5x10 копий плазмиды. Такой порог детекции следует считать высоким, если принять во внимание то, что с помощью тест-систем ПНР удается выявлять 7000-21000 копий РНК-геномов.
Разработка тест-системы ИФА для обнаружения антигена ВЛДР также была обусловлена необходимостью ранней диагностики ЛДР. В связи с тем, что антитела к ВЛДР не удается обнаружить в течение первых нескольких дней болезни, а вирусемия за это время достигает высоких значений, применение данного метода является целесообразным. Метод ИФА для обнаружения антигена, применяемый в комплексе с ПЦР, позволит с большей точностью диагностировать ЛДР.
Метод ИФА для детекции антигена позволил выявить антиген ВЛДР во всех образцах суспензий органов (легких, печени, мозга, почек) и крови. Этот факт свидетельствует о том, что антиген вируса может быть обнаружен в любых образцах, полученных от больных животных.
В качестве положительного контроля в реакции использовали антигены, приготовленные путем сахарозо-ацетоновой экстракции из мозга и печени зараженных мышей. Как показали результаты титрования, печеночный антиген оказался гораздо активнее мозгового. Это объясняется тем, что ВЛДР является преимущественно гепатотропным вирусом, поэтому концентрация вируса в печени зараженных животных гораздо выше, чем в мозге.
Чувствительность метода,4 определенная по результатам реакции бляшкообразования, составила 2,1x10 БОЕ. Сравнив этот показатель с чувствительностью молекулярно-биологических методов, можно сделать вывод, что он оказался в 30 раз ниже чувствительности "гнездовой" ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени. Такой результат является закономерным, учитывая то, что в процессе амплификации первоначальное количество молекул нуклеиновой кислоты увеличивается в тысячи раз.
Специфичность ИФА оказалась высокой: было показано отсутствие перекрестной реактивности для всех родственных флебовирусов, кроме антигеннородственного вируса неаполитанской москитной лихорадки только при использовании минимального разведения антигена данного вируса (1:20).
Специфические реагенты, приготовленные в процессе разработки ИФА тест-системы для индикации антигена вируса ЛДР (иммуноглобулин, антигены, пероксидазный конъюгат, нормальный глобулин и антиген), являются достаточной основой для конструирования ИФА-диагностикумов, предназначенных для выявления IgM и IgG антител в сыворотках крови людей и животных. Возможность их применения зависит только от наличия позитивных контролен IgM и IgG.
Одной из задач настоящего исследования было изучение в опытах in vitro на модели ВЛДР эффективности рибавирина (виразола), недавно синтезированного в Институте биоорганической химии (Москва) на основе принципиально нового метода [3, 4]. Как установлено зарубежными авторами в клинических испытаниях, этот препарат высокоэффективен при терапии ЛДР [16, 94]. Кроме того, на модели вируса ЛДР in vitro были протестированы производные рибавирина (метилрибавирин и метил-2 -дезоксирибавирин), также ..синтезированные в Институте биоорганической химии.
Результаты исследований показали, что отечественный рибавирин эффективно предотвращает развитие цитопатического действия (ЦПД) вируса ЛДР в клетках Vero Е6, при этом эффективность препарата возрастает пропорционально его концентрации, и препарат не обладает цитотоксическим действием. Результаты опыта показали, что производные рибавирина не проявляют противовирусной активности даже при максимальной концентрации и, кроме того, они обладают выраженным цитотоксическим действием в отношении клеток Vero Е6.
