Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 11
1.1. Характеристика вирусов гриппа 11
1.1.1. Классификация 11
1.1.2. Организация вириона и функции вирусных белков 11
1.1.3. Клинические признаки и патогенез 17
1.1.4. Эпизоотология и эпидемиология гриппа А 21
1.2. Диагностика гриппа А 26
1.2.1. Вирусологичекая диагностика 27
1.2.2. Серологическая диагностика 29
1.2.3. Обнаружение вирусного антигена 34
1.2.4. Молекулярная диагностика 37
1.3. Заключение по литературному обзору 46
II. Материалы и методы 48
2.1. Материалы 48
2.1 Л. Штаммы и изоляты вирусов гриппа А 48
2.1.2. Химические реагенты 50
2.1.3. Реагенты и наборы для молекулярной биологии 51
2.1.4. Оборудование 52
2.1.5. Расходные материалы и лабораторная посуда 53
2.2. Методы 53
2.2.1. Вьщеление РНК вирусов гриппа из культуральных и полевых образцов 53
2.2.2. Постановка ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А 54
2.2.3. Постановка ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А и дифференциации его подтипов Н5 и Н7 56
2.2.4. Постановка ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 в реальном времени 56
2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле 57
2.2.6. Анализ результатов ОТ-ПЦР в реальном времени 57
2.2.7. Конструирование рекомбинантных положительных контролен 58
III. Результаты 61
3.1. Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе "гнездовой" ПЦР 61
3.2. Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе "гнездовой" ПЦР 68
3.3. Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени 73
3.4. Определение распространенности вируса гриппа А на территории Российской Федерации 77
IV. Обсуждение 88
V. Выводы 96
VI. Приложения 97
VIII. Библиографический список 103
- Организация вириона и функции вирусных белков
- Серологическая диагностика
- Реагенты и наборы для молекулярной биологии
- Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе "гнездовой" ПЦР
Введение к работе
Актуальность темы.
Вирусы гриппа А распространены по всему миру, заражают многие виды диких и домашних птиц, большое количество различных видов млекопитающих и человека. Вследствие особенностей генома вирусам гриппа А свойственна чрезвычайно высокая изменчивость. Это позволяет им вызывать сезонные эпидемии среди людей, вспышки с высоким процентом смертности среди животных и птиц и иногда являться причиной пандемий [107].
Вирусы гриппа А согласно номенклатуре представлены сочетаниями 16 подтипов гемагглютинина (НА) и 9 подтипов нейраминидазы (NA) [34]. Естественным резервуаром вирусов гриппа А считаются птицы водного и околоводного комплексов. От птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков: НА и NA. Среди людей обычно циркулируют вирусы с 3 подтипами гемагглютинина (Н1-НЗ) и двумя нейраминидазы (N1, N2). Иногда возникают случаи заражения вирусами гриппа А других подтипов (H5N1, H7N3, H7N7, H9N2) [108].
В настоящее время существует серьезная угроза возникновения новой пандемии среди людей, которая может быть вызвана вирусом гриппа А подтипа H5N1. В 1997 году в период вспыхнувшей эпизоотии в Гонконге впервые были зафиксированы случаи заражения человека вирусом гриппа подтипа H5N1, сопровождаемые высоким уровнем летальности: из 18 зараженных погибло 5 человек. Этот вирус, так называемый вирус "птичьего гриппа", в 2004 году стал причиной новых случаев заболевания в странах Азии, гибели 60 человек во Вьетнаме, Таиланде, Камбодже, Индонезии, и уничтожения 150 миллионов домашних птиц. В 2005 во время миграции диких птиц он распространился в северный Китай, Монголию, Тибет, Казахстан и Россию. В настоящее время вирус "птичьего гриппа" обнаруживается в странах Европы (Румыния, Греция), Ближнего Востока, Кавказского региона [108].
Необходимость мониторинга вируса гриппа А у птиц, человека и животных чрезвычайно велика. Вирусологические методы обнаружения вируса гриппа А (пассирование на куриных эмбрионах или на культуре клеток с последующей идентификацией в реакции гемагглютинации (РГА) или реакции торможения гемагглютинации (РТГА)) надежны и чувствительны, однако они довольно трудоемки и на их выполнение требуется от 1 до 2 недель [112].
За последнее десятилетие широкое распространение получили молекулярные методы диагностики гриппа А. Наиболее известные и эффективные - это методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Принцип их работы основан на многократном умножении части генома инфекционного агента с последующей его идентификацией. Время анализа инфекционного материала такими методами снижается до одного дня, их чувствительность не уступает чувствительности традиционных методов [75]. В рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения о диагностике гриппа А метод полимеразной цепной реакции приравнен к традиционным методам и рекомендован для использования [113].
В настоящее время в мире существует ряд диагностических систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа типа А на основе метода полимеразной цепной реакции. Недавно и в России начали появляться подобные наборы [7]. Однако вариабельность генома вируса гриппа вызывает серьезные проблемы при диагностике и иногда является причиной появления ложно отрицательных результатов. В связи с этим увеличение количества разработанных диагностикумов для обнаружения РНК вируса гриппа А увеличивает вероятность правильной и надежной диагностики. Цель и задачи исследования.
Целью работы являлась разработка на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени диагностических наборов для обнаружения и типирования вируса гриппа А и апробация их с образцами, полученными от различных видов птиц, животных и человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Разработать детекционную систему ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена нуклеопротеина.
2. Разработать детекционную систему ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина.
3. Разработать систему ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени.
4. Сравнить чувствительность разработанных детекционных систем с традиционными методами обнаружения вируса гриппа и провести их тестирование с использованием имеющихся эталонных штаммов вируса гриппа А и полевых образцов от птиц.
5. С помощью разработанных тест-систем выявить распространенность вируса гриппа А на территории Российской Федерации в период с 2003 по 2006 гг..
Научная новизна и практическая значимость.
1. Разработана и внедрена детекционная система на основе ПЦР (ТУ 9388-004-42418073-05 от 06 декабря 2005 г.), позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А любого подтипа и дифференцировать их от вирусов гриппа В и С, а также от других патогенов.
2. Разработана и внедрена детекционная система на основе множественной дифференцирующей ПЦР, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н7 (ТУ 9388-002-42418073-05 от 06 декабря 2005 г.).
3. Разработана и внедрена детекционная система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая обнаруживать вирусы гриппа А подтипа Н5 (ТУ 9388-003-42418073-05 от 06 декабря 2005 г.).
4. Сравнительные результаты использования тестов для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР с вирусологическими методами свидетельствуют о возможности использования разработанных тест-систем для быстрого обнаружения вирусов гриппа А как в культуральном материале, так и в полевых образцах от птиц.
5. Выявлена распространенность вируса гриппа А на территории Российской Федерации и определена доля вирусов гриппа подтипов Н5 и Н7 в период с 2003 по 2006 гг..
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Возможность обнаружения вируса гриппа А с помощью разработанного теста на основе ПЦР.
2. Возможность обнаружения вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 и одновременной их дифференциации с помощью разработанного теста на основе ПЦР.
3. Возможность обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с помощью разработанного теста на основе ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности метода по сравнению с "гнездовой" ПЦР при сохранении достаточной чувствительности для детекции вируса в образцах от клинически больных птиц.
4. Чувствительность разработанных тестов на основе ПЦР соответствует чувствительности методов изоляции вируса гриппа; возможность применения разработанных тестов для обнаружения вируса гриппа А в образцах от диких и домашних птиц. 5. Возможность использования детекционных систем на основе "гнездовой" ПЦР для мониторинга вируса гриппа А с определением доли вирусов гриппа подтипов Н5 и Н7.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 21 июня 2007 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезисов.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на страницах машинописного тескта. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 119 источников. Работа содержит 10 таблиц и 12 рисунков.
Организация вириона и функции вирусных белков
Вирусы гриппа А обол очечные и могут иметь различную форму вириона. Вирусы, выделенные из клеточной культуры, обычно сферические, около 100 нм в диаметре. Однако вирион также может иметь филаментозную форму, вирусные частицы остаются около 100 нм в диаметре, но различаются по длине, достигая иногда нескольких микрометров [65]. Каждый вирион вируса гриппа А окружен липидной мембраной клеточного происхождения. Два поверхностных гликопротеина
Поверхностные белки и соответствующие им гены представлены в цвете (синий, красный и зеленый), остальные гены изображены серым цветом. Внутренние белки (матриксный белок, нуклеопротеин и белки полимеразного комплекса не изображены). Вирусы гриппа А и В содержат восемь сегментное РНК, в то время как вирусы гриппа С содержат только семь сегментов. Вирусы гриппа С имеют единственный поверхностный гликопротеин (haemagglutinin-esterase-fusion, или гликопротеин HEF, изображен голубым цветом), который функционально заменяет два поверхностных гликопротеина, найденные у вирусов гриппа А и В (белки гемагглютинин, изображен синим цветом, и нейраминидаза, изображена красным цветом). Оболочки трех вирусов также содержат различные ионные каналы, которые образуются либо белком гена М (белки М2 или СМ2, изображены как зеленые овалы), либо белком гена NA (белок изображен как красные овалы). Геном вируса гриппа состоит из 8 фрагментов одноцепочечной (-)-РНК [1]. Размер генома составляет 10,0-14,6 тысяч нуклеотидов. Величины каждого из сегментов варьируют от 874 до 2396 нуклеотидов [32]. На концах сегментов находятся от 20 до 45 некодирующих нуклеотидов на 3 -конце, и от 23 до 61 нуклеотида на 5 -конце, в зависимости от сегмента. Эти терминальные регионы имеют обращенные короткие повторы, образующие двуспиральную "шпильку", и абсолютно необходимы для репликации сегментов и их интеграции в вирусные частицы [1].
Первые три сегмента генома вируса гриппа А, РВ2, РВ1 и РА, кодируют субъединицы вирусной полимеразы. Сегмент 2 до недавнего времени относился к сегментам вирусного генома, кодирующий только один белок РВ1. Однако в 2001 году при исследовании иммунного ответа на отдельные эпитопы белка РВ1 был выявлен новый белок PB1-F2. Этот белок интегрируясь в митохондриальные мембраны, вызывает образование пор, что способствует выбросу в цитоплазму цитохрома С, что, в свою очередь, является сигналом к апоптозу. Важным обстоятельством в действии гена PB1-F2 является его высокий уровень экспресии в макрофагах. Активная экспрессия гена PB1-F2 и накопление этого белка в митохондриях и индукция апоптоза инфицированных моноцитов и макрофагов клинически проявляется прогрессирующей лейкопенией и присоединением вторичных бактериальных инфекций [89].
Четвертый сегмент генома кодирует гликопротеин гемагглютинин, который ответственней за связывание вируса с клеточными рецепторами, содержащими сиаловую кислоту, и за слияние мембран во время проникновения вируса в клетку. Он также является основной мишенью для нейтрализующих антител [1]. Патогенность вирусов гриппа строго коррелирует со скоростью протеолиза гемагглютинина и активацией пептида слияния, обеспечивающего проникновение вируса в клетки. Ген НА вирусов гриппа А является наиболее вариабельным. Мутации в гене НА приводят к изменениям его антигенных свойств как поверхностного антигена и способности к эффективной адсорбции на клетках-мишенях и рецептор-зависимому эндоцитозу.
Установлено, что различные по структуре НА отличаются по способности к распознаванию и связыванию с рецептором - сиаловои кислотой, которая связана в олигосахариде клеточных мембран с галактозой. Гемагглютинин вирусов гриппа человека связывается с остатками сиаловои кислоты, связанной 2,6- связью с галактозой, а гемагглютинин птичьих вирусов распознает сиаловую кислоту в 2,3- связи с остатками галактозы. Тип связи концевой сиаловои кислоты и конформационная подвижность олигосахаридов поверхностных лектинов является основным элементом межвидового барьера для вирусов гриппа птиц и человека. Лектины эпителиальных клеток трахеи человека содержат олигосахариды с типом связи - (2,6)- и не содержат олигосахаридов с типом связи - (2,3)-, характерных для эпителиальных клеток кишечного тракта и дыхательных путей птиц. Для свиней характерны лектины с тем и другим типом связи, что, по мнению специалистов, и определяет их положение в экологической цепи передачи вирусов гриппа в качестве промежуточного хозяина между птицами и человеком, или наоборот. Более того, именно свиньи представляют собой промежуточного хозяина, в котором с высокой вероятностью "встречаются" штаммы вирусов птиц и человека [24]. Одновременная репликация в одном хозяине этих вирусов неизбежно приводит к реассортации и появлению нового межвидового реассортанта, антигенно отличающегося от своих предшественников [4].
Серологическая диагностика
Серологическая диагностика гриппа обеспечивает точное определение этиологии его путем выявления увеличения количества специфических антител в крови в динамике заболевания. Серологическая диагностика особенно незаменима при атипичном или бессимптомном течении гриппозной инфекции. В таких случаях, независимо от результатов вирусологического исследования, обнаружение в крови обследуемых противогриппозных антител в динамически нарастающей концентрации является единственным доказательством участия вируса гриппа в возникновении заболевания, его взаимодействия с организмом.
Методы серологической диагностики широко применяют для выяснения источников инфекции, природы массовых вспышек, подтверждения циркуляции среди людей вирусов гриппа, которые не удается выделить, а также оценки эффективности профилактических средств и изучения коллективного иммунитета. Серологическую диагностику проводят путем сравнительного исследования в одном опыте одновременно двух проб сыворотки крови, полученных от одного и того же человека (парные сыворотки), первая из которых взята в начале заболевания или обследования (1-3-й день), вторая - спустя 12-30 дней. Взятие первой пробы крови в более поздние сроки, например, на 5-7-й день болезни, может отразиться на результатах диагностики, так как в остром лихорадочном периоде увеличивается количество неспецифических сывороточных антигемагглютининов. Интервал между получением первой и второй проб крови должен быть не менее 8-14 дней. Оптимальный срок взятия второй пробы крови - 3-4-я неделя от начала болезни или обследования. Диагноз гриппа подтверждается при выявлении увеличения количества антител по их титру во второй пробе сыворотки в 4 раза и более по сравнению с количеством антител к тому же типу возбудителя в пробе первой сыворотки.
Повторные заболевания гриппом способствуют образованию антител широко спектра. Установлено, что инфекция или иммунизация стимулирует образование антител не только к вирусу-возбудителю, но и к другим близкородственным серотипам вируса гриппа А, с которыми человек встречался в прошлом. При таких обстоятельствах следует помнить, что достоверную диагностику гриппа А, вызванного вирусом того или иного сероподтипа, прежде всего обеспечивает диагностический прирост содержания антител к АГ, полученному из штамма вируса, вызвавшего эпидемию гриппа.
Для правильного проведения серологического анализа следует учитывать и ряд других обстоятельств. Комплементсвязывающие антитела появляются в крови и исчезают из нее раньше, чем антигемагглютинины. Характер иммунологических реакций организма зависит от возраста, состояния здоровья, питания, имеют значение индивидуально-генетические особенности. Известно, что интенсивность образования противогриппозных антител снижена в грудном и старческом возрасте, при повреждении иммунной системы, нарушениях питания, у лиц, ослабленных хроническими заболеваниями. У заболевших гриппом после вакцинации прирост антител обычно менее выражен по сравнению с непривитыми больными. В некоторых случаях могут отмечаться неспецифические сероконверсии, обусловленные другими заболеваниями, вызвавшими резкие изменения в составе белков сыворотки крови. С другой стороны, иммунные реакции могут отсутствовать у больных с клинически выраженными формами гриппа. Кроме того, на результаты серодиагностики влияют сроки получения парных сывороток, наличие неспецифических ингибиторов и способы их удаления, погрешности в хранении исследуемого материала и постановке серологических реакций.
Изложенные выше факторы нередко обусловливают вариабельность результатов, получаемых в разных лабораториях. Таким образом, диапазон антител, выявляемых с помощью серологических реакций, может значительно варьировать, особенно при одновременной циркуляции двух и более дрейфовых антигенных подтипов вируса гриппа А. Поэтому для подтверждения этиологии свежих заболеваний необходимо использовать в серологических реациях как стандартные АГ, так и АГ, получаемые из эпидемически актуальных штаммов вируса, обладающих широким антигенным спектром. Правильность серологического диагноза при массовых заболеваниях должна подтвердиться выделением вируса с учетом клинико-эпидемиологических данных.
Среди методов серологической диагностики гриппа наибольшее распространение получили РТГА и РСК. Реакция нейтрализации и ряд других методов (реакция радиального гемолиза, реакция непрямой гемагглютинации, реакция ингибиции элюции вируса гриппа с эритроцитов) ретроспективной диагностики гриппа имеют ограниченное применение.
Единого мнения о диагностической ценности РТГА и РСК нет. Обе реакции имеют свои достоинства и недостатки. Большинство исследователей считают РСК более надежным методом диагностики гриппа. Эта реакция одинаково чувствительна как в эпидемическом, так и в межэпидемическом периодах. С помощью РСК диагноз гриппа удается подтвердить в 60-85% случаев, по РТГА - в 40-54%. Целесообразность применения обеих реакций заключается в том, что РТГА обеспечивает точный этиологический диагноз, позволяя дифференцировать различные разновидности (штаммы) вируса гриппа внутри его сероподтипа, а с помощью РСК различают вирусы гриппа, аденовирусы, PC- и микоплазменной инфекции.
Реагенты и наборы для молекулярной биологии
Пробирки объемом 0,6 мл тонкостенные для ПЦР (QSP, США), 1,6 мл и 2 мл микроцентрифужные пробирки с градуировкой (Eppendorf, Германия), микронаконечники на 0,5-10 мкл, микронаконечники на 0,1-2,5 мкл, микронаконечники на 1-200 мкл желтые (Greiner, Австрия), желтые с фаской (Treff), наконечники на 100-1000 мкл голубые (Greiner, Австрия), микронаконечники с фильтром на 1-20, 1-200 и 100-1000 мкл (QSP, США), насадки к дозатору Eppendorf на объемы 1 мл, 2,5 мл и 5 мл, пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой на 15 и 50 мл, культуральные флаконы, чашки Петри 90 мм (Greiner, Австрия), центрифужные пробирки (Nalgene, Италия), стеклянная лабораторная посуда с градуировкой и пластиковыми завинчивающимися крышками (Scott Duran), конические колбы на 100, 250 и 500 мл, мерные цилиндры на 50, 250, 500 и 1000 мл, фотопленка листовая PalopanProlOO (Polaroid), пробирки оптические на 200 мкл "MicroAmp", оптические крышки "Optical Caps", 96-луночные оптические плашки "96-Well Optical Reaction Plate", оптическая пленка "Optical Adhesive Cover Starter Kit" (Applied Biosystems, США), кюветы для спектрофотометра 50-2000 мкл, свободные от ДНКаз, РНКаз, протеиназ, кюветы для электропорации, объемом 400 мкл, диаметром 2 мм и 1 мм (Eppendorf, Германия).
Для выделения РНК вирусов гриппа из аллантоисной жидкости, клинических и полевых образцов для проведения диагностических исследований использовали методику выделения с использованием неорганического сорбента. Для этого к 200 мкл образца добавляли 600 мкл раствора L6 (лизирующий буфер с гуанидинтиоционатом) и инкубировали 10 минут. Затем центрифугировали и в случае присутствия осадка, надосадочную жидкость переносили в свежие пробирки. К надосадочной жидкости добавляли 40 мкл сорбента, перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая на шейкере. Центрифугировали 15 секунд, при 13000 об/мин при, удаляли надосадок. Затем промывали осадок сорбента 2 раза с использованием 200 мкл раствора L2 (промывочный буфер), и 2 раза с использованием 70% спирта этилового. Осадок подсушивали в течение 10 минут при 56С и элюировали РНК с сорбента в 30 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом.
ОТ-ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РЖ, 10 пмоль каждого праймера, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 0.5 ед. M-MLV ревертазы, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin, 10 ммоль Tris-HCl (рН=9.0), 50 ммоль КС1, 0.1% Triton Х-100, 1.5 ммоль MgCl2..
Вторую амплификацию проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл смеси первой амплификации, 20 пмоль каждого праймера, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 10 ммоль Tris-HCl (рН=9.0), 50 ммоль КС1, 0.1% Triton Х-100, 1.5 ммоль MgCl2..
Праймеры. Набор специфических олигонуклеотидов для обнаружения вируса гриппа А был разработан на основании известных последовательностей генов NP и НА, полученных из банков данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) и ISD (www.flu.lanl.gov), при помощи программ AssemblyLign, Oligo 4.0-s, Amplify 1.0 (Accelrys Inc., США), BioEdit 7.0.1 [39]. ОТ-ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, 10 пмоль каждого праймера, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 0.5 ед. M-MLV ревертазы, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin, 10 ммоль Tris-HCl (рН=9.0), 50 ммоль КС1, 0.1% Triton Х-100, 1.5 ммоль MgCl2..
Вторую амплификацию проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл смеси первой амплификации, 10 пмоль каждого праймера (кроме праймера Н7 Rint, которого добавляли 20 пмоль), 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 10 ммоль Tris-HCl (рН=9.0), 50 ммоль КС1, 0.1% Triton Х-100,1.5 ммоль MgCl2..
Для проведения ОТ-ПЦР использовались температурно-временные режимы, указанные в таблице 4. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, 10 пмоль каждого праймера, 2 пмоль зонда, 0.25 ммоль каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 0.5 ед. М-MLV ревертазы, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin, 10 ммоль Tris-HCl (рН=9.0), 50 ммоль КС1,0.1% Triton Х-100,1.5 ммоль MgCl2..
Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 на основе "гнездовой" ПЦР
Наибольшее значение среди всех подтипов вируса гриппа А, циркулирующих у диких водоплавающих птиц, имеют подтипы Н5 и Н7. В основном, вспышки гриппа среди домашней птицы, сопровождающиеся высокой контагиозностью и падежом, вызываются вирусами этих двух подтипов [18]. Недавние доказательства также укрепляют гипотезу о том, что вирусы группы HPAI в норме отсутствуют в популяции диких птиц [9, 10, 60, 78] и возникают как результат мутаций вирусов группы LPAI после заноса их в стада домашней птицы [35, 72]. Поэтому нашей следующей задачи явилась разработка теста, позволяющего обнаружить вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н7.
Для подбора олигонуклеотидов, специфических гену НА вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7, были использованы нуклеотидные последовательности различных подтипов вирусов, размещенные в банке данных www.flu.lanl.gov. Всего было использовано около 1400 последовательностей гена НА вирусов гриппа А, относящихся ко всем 16 подтипам по гену гемагглютинин. Анализировались по 500 последовательностей вирусов гриппа с гемагглютинином НІ, по 250 последовательностей - НЗ и Н5, по 100 последовательностей - Н6, Н7, Н9 и по 50 последовательностей - Н2 и Н4. Также для анализа было использовано около 50 последовательностей вирусов гриппа А с гемагглютининами, относящимися к подтипам Н8, Н10-Н16. Данные вирусы гриппа были выделены от человека, диких и домашних птиц, свиней, лошадей, тюленей, китов, норок, леопардов. Диапазон времени изоляции штаммов вирусов гриппа А, последовательности которых были взяты для анализа, был максимально широким: от 1918 до 2005 года.
Затем для каждого подтипа были созданы "консенсусные" последовательности. Далее был проведен сравнительный компьютерный анализ этих последовательностей между собой. После этого осуществляли поиск участков гена НА, где последовательности подтипов Н5 и Н7 были достаточно консервативны для создания специфических олигонуклеотидов и одновременно были отличны от последовательностей других подтипов. Такие последовательности были найдены (рис. 7). С целью повышения специфичности и удобства для проведения первого раунда ПЦР была разработана одна пара праймеров, с помощью которой успешно амплифицировались фрагменты гена ПА подтипов Н5 и Н7. Для проведения второго раунда ПЦР были разработаны две различные пары праймеров, где одна пара была специфична вирусам подтипа Н5, а вторая -вирусам подтипа Н7. Вследствие большой вариабельности вирусов внутри подтипа Н7 один из праймеров для второй амплификации имел вырожденную последовательность.
Эталонные штаммы вирусов гриппа типов А и В (табл. 2) были использованы для оценки специфичности разработанного теста и оптимизации условий амплификации. При помощи разработанного теста специфически обнаруживались только подтипы Н5 и Н7 вирусов гриппа А. На рис. 8 видно, что образцы 12-14, содержащие три различных вируса гриппа А подтипа Н5, имеют специфические фрагменты ДНК, соответствующуие 274 пн, а образцы, 15 и 16, содержащие вирусы гриппа А подтипа Н7, имеют специфические фрагменты ДНК, соответствующие 170 пн. 20-24 - результаты анализа образцов, содержащих вирусы гриппа В, треки М - маркер молекулярного веса маркер молекулярного веса GeneRuler 100 bp. Номера треков совпадают с порядковыми номерами вирусов, представленных в таблице 2. При оптимизации условий амплификации фрагмента гена НА было определено, что они сходны с условиями, применяемыми в тесте для обнаружения вируса гриппа А.
Чувствительность тест-системы на основе "гнездовой" ПЦР для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7.
Треки М - маркер молекулярного веса. Верхний ряд. Треки 1-16 -результаты анализа образцов, содержащих пятикратные разведения препарата вируса A/Mallard Duck/Pensylvania/102I8/84(H5N2), с праймерами для обнаружения РНК вируса триппа А/Н5. Нижний ряд. Треки 1-16 - результаты анализа образцов, содержащих пятикратные разведения препарата вируса A/FPV/Rostock/34(H7Nl), с праймерами для обнаружения РНК вируса гриппа А/Н7. Затем была определена чувствительность разработанного теста. Были использованы эталонные штаммы вируса гриппа A A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84(H5N2) и A/FPV/Rostock/34(H7Nl). Определение инфекционных титров препаратов вирусов, а также их разведение описано выше. Пределом чувствительности тест-системы при обнаружении вируса гриппа А подтипа Н5 оказался титр вируса 101 5 ЭИД50/Мл, а при обнаружении вируса гриппа А подтипа Н7 - 102 ЭИД50/Мл (рис. 9).
Создание рекомбинантных положительных контролем для разработанного теста осуществлялось так же, как описано в предыдущем пункте с использованием праймеров, разработанных для амплификации фрагмента гена НА.
Разработка детекционной системы ОТ-ПЦР для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5 с режимом получения результатов в реальном времени
В настоящее время все более широко начинает применяться модификация метода ПЦР - ПЦР в реальном времени. Перед стандартной ПЦР эта модификация имеет преимущества в сокращенном времени анализа и уменьшении вероятности контаминации [86].
В настоящем исследовании был разработан тест на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения вируса гриппа А подтипа Н5.
Для подбора олигонуклеотидов, специфических гену НА вирусов гриппа А подтипа Н5, были использованы те же нуклеотидные последовательности различных подтипов вирусов, размещенные в банке данных www.flu.lanl.gov, что и для разработки тест-сиетемы для обнаружения и дифференциации вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н7. Области гибридизации специфических праймеров и зонда изображены на рисунке 10.
