Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
Характеристика вирусов гриппа А 9
Классификация 9
Структура вириона 10
Организация генома и функции вирусных белков 11
Жизненный цикл вируса гриппа А 14
Особенности патогенеза и клиники 22
Эпидемиология вирусов гриппа А и межвидовая трансмиссия 24
Методы определения подтипа вируса гриппа А 29
Иммунологические методы 29
Молекулярно-генетические методы 33
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и «real-time» ПЦР 33
Изотермальная реакция транскрипционно-опосредованной амплификации нуклеиновых кислот (NASBA)
Петлевая изотермальная амплификация (LAMP) 38
Чувствительность и специфичность амплификационных методов 39
ДНК микрочипы 42
Заключение по обзору литературы 48
Материалы и методы 50
Результаты и обсуждение 57
Анализ вариабельности генов поверхностных гликопротеинов вируса гриппа А.
Выбор праймеров и олигонуклеотидных зондов 62
Разработка биологического микрочипа для определения подтипа вируса гриппа А
Структура и принципы работы биочипа 62
Оптимизация условий анализа 64
Оценка чувствительности и специфичности метода 69
Анализ штаммов ВГА, выделенных у диких и домашних птиц, на биочипе 74
Анализ штаммов ВГА, выделенных у человека, на биочипе 79
Заключение 82
Выводы 83
Благодарности 84
Библиографический список 85
- Организация генома и функции вирусных белков
- Эпидемиология вирусов гриппа А и межвидовая трансмиссия
- Чувствительность и специфичность амплификационных методов
- Разработка биологического микрочипа для определения подтипа вируса гриппа А
Введение к работе
Вирусы гриппа типа А (ВГА) активно циркулируют в природных резервуарах, вызывая инфекцию у человека, диких и домашних птиц, многих видов млекопитающих. Для человека опасность этой инфекции обусловлена существованием множества подтипов ВГА и его чрезвычайной изменчивостью. Основными факторами, определяющими патогенность и вирулентность вирусов гриппа, являются поверхностные антигены -гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA).
К настоящему моменту серологически выделяют 16 вариантов НА (НІНІ 6) и 9 вариантов NA (N1-N9). Вирусы с различными сочетаниями НА и NA могут быть обнаружены в популяциях диких водоплавающих птиц, являющихся естественным резервуаром инфекции. В отличие от птиц, в человеческой популяции до недавнего времени^ циркулировали, штаммы, ассоциированные лишь с тремя вариантами гемагглютинина (НІ, Н2, НЗ) и двумя вариантами нейраминидазы (N1, N2). Однако в последнее десятилетие отмечены случаи заражения человека не свойственными для человеческой популяции подтипами ВГА: H7N7, H7N3, H9N2 и H5N1. Ранее считалось, что эти подтипы не представляют серьезной опасности для людей и в случае заражения могут вызвать у них лишь конъюнктивит и легкое недомогание, в редких случаях - слабовыраженный респираторный синдром. Однако в 1997 г. вирусы подтипа H5N1 явились причиной чрезвычайно тяжелых форм заболевания среди людей - в Гонконге из 18 заболевших человек шестеро погибли, причем, все они заразились от цыплят [1]. В 2003 году вспыхнула новая эпизоотия, вызванная вирусом H5N1 (или т.н. «птичьим гриппом»), которая продолжается и сегодня. Согласно данным ВОЗ, с момента начала эпизоотии заразились уже 411 человек, 256 из которых погибли. При этом в
последние годы происходило непрерывное расширение ареала циркуляции штаммов «птичьего» гриппа, увеличился видовой спектр хозяев, возникла устойчивая тенденция повышения патогенности циркулирующих штаммов. Случаи передачи ВГА подтипа H5N1 от человека к человеку пока не зарегистрированы, однако, совместная циркуляция штаммов человеческого гриппа и птичьего гриппа повышает вероятность обмена вирусными сегментами между этими штаммами и возникновения нового варианта вируса, способного передаваться от человека к человеку, как это происходило в 1918, 1957 и 1968 годах при пандемиях "испанки", "гонконгского" и "азиатского" гриппа. Возможно, именно этим обусловлено возникновение вирулентного для человека штамма вируса «свиного» гриппа подтипа H1N1, уже унесшего жизни более 100 человек (к апрелю 2009 г.).
Появление штаммов, обладающих выраженным пандемическим
потенциалом, а также не снижающийся уровень заболеваемости
обуславливают необходимость поиска новых высокочувствительных и
надежных экспресс-методов определения вирусного подтипа для
прогнозирования эпидемий, осуществления эпидемиологического контроля, своевременного создания соответствующих вакцин.
К общепринятым методам определения вирусного подтипа относится иммунологический анализ, которому предшествуют стадии выделения вируса на куриных эмбрионах или на культуре ткани. Данный подход рассматривают в качестве «золотого стандарта», продолжительность которого составляет от 3 до 7 дней, требуемых для культивирования вируса. Молекулярно-генетические методы, основанные на обратной транскрипции и амплификации последовательностей генов гемагглютинина и неираминидазы, характеризуются более высокой чувствительностью, а результаты идентификации вирусного подтипа могут быть получены в
течение 3-6 часов. К настоящему времени предложен ряд методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, но из-за трудностей, связанных с количеством одновременно идентифицируемых в реакции мишеней, число подтипов, определяемых в одном анализе, остается весьма ограниченным.
Целью данной работы являлось изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А и разработка на основе полученных данных специализированного биологического микрочипа для молекулярного субтипирования ВГА, который позволял бы в сжатые сроки идентифицировать широкий спектр подтипов ВГА.
В работе отражены следующие результаты:
Впервые создан специализированный биологический микрочип, позволяющий проводить молекулярное субтипирование 15 вариантов гемагглютинина и 2 вариантов нейраминидазы ВГА. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 часов. С помощью разработанного подхода выполнен анализ вирусных нуклеиновых кислот, содержащихся в 123 полевых образцах, выделенных из клинического материала, полученного от диких и домашних птиц во время эпизоотии. На выборке, включающей 41 полевой образец, собранный в районе эпизоотии, специфичность и чувствительность метода составили соответственно 100% и 76%. Аналитическая чувствительность составила 10 ЭИДбо/мл. Полученные характеристики позволили успешно применить разработанный метод для определения подтипа вируса, вызвавшего эпизоотию. Необходимое оборудование установлено в* Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского и используется для
определения этиологического агента эпизоотии и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа, циркулирующих в природных резервуарах.
Показано, что предложенный подход обладает высокой
специфичностью, и может рассматриваться как универсальный инструмент для будущих разработок, нацеленных на генотипирование вирусов, характеризующихся'высокой изменчивостью.
Организация генома и функции вирусных белков
Геном вируса представлен 8 сегментами одноцепочечной (-)-РНК [7]. Длина каждого из сегментов варьируют от 874 до 2396 нуклеотидов. На концах сегментов находятся- от 20 до 45 некодирующихс нуклеотидов на 3 -конце, и от 23 до 61 нуклеотида на 5 -конце, в зависимости от сегмента. Эти терминальные регионы имеют консервативные для всех сегментов всех штаммов последовательности, включающие 13 нуклеотидов на 5" -конце и 12 нуклеотидов на 3"-конце (за исключением 4 нуклеотида на 3 -конце, которому присуща У/Ц гетерогенность) . Данные участки необходимы для репликации сегментов и их интеграции в вирусные частицы [7].
Три первых и наиболее длинных сегмента вирусного генома кодируют субъединицы вирусной полимеразы РВ2, РВ1 и РА, названные так в связи с щелочными (basic) либо кислотными (acidic) свойствами, проявляемыми в изоэлектрофокусирующих гелях. Они ответственны за транскрипцию мессенджер-РНК (мРНК), образование положительных антигеномных транскриптов (кРНК) и репликацию на матрице кРНК сегментов вирусной РНК (вРНК), которые затем инкорпорируются в новые вирусные частицы.
Четвертый сегмент генома кодирует гликопротеин гемагглютинин, который ответственен за связывание вируса с клеточными рецепторами, содержащими сиаловую. кислоту, и заі слияние мембран во время проникновения, вируса в клетку. Он также является основной мишенью для нейтрализующих антител: Патогенность вирусов гриппа строго коррелирует со скоростью протеолиза гемагглютинина и активацией пептида слияния, обеспечивающего проникновение вируса в клетки. Ген НА вирусов гриппа А является наиболее вариабельным. Мутации в гене НА приводят к изменению его способности к эффективной адсорбции на клетках-мишенях и рецептор-зависимому эндоцитозу.
Белок нуклеопротеин кодируется геном, расположенным в пятом сегменте. В зрелом вирионе он вместе с белками РВ1, РВ2 и РА находится в составе нуклеокапсида. В зараженной клетке он связывается с вирусной РНК, что необходимо для узнавания РНК в качестве матрицы вирусной полимеразой. Кроме того, предполагают, что он может принимать участие в сплайсинге вирусных транскриптов [8].
Сегмент 6 кодирует поверхностный белок нейраминидазу. Это гликопротеин, разрушающий связь между клеткой и вирусом в конце вирусного цикла, позволяя зрелым вирионам отделиться. Без функционально активной нейраминидазы взаимодействия между рецептор-связывающими сайтами НА и сиаловой кислотой препятствуют вирусному освобождению.
Сегмент 7 кодирует два продукта, матриксный белок Ml и трансмембранный белок М2. Матричная РНК (мРНК) белка Ml однонаправлена с мРНК М2. Белки Ml и М2 имеют общие 9 аминокислотных остатков на N-конце, включая первый остаток метионина, однако рамка считывания М2 отличается от таковой у МІ. В вирионе структурный белок Ml выстилает внутреннюю поверхность оболочки. Белок Ml, являясь многофункциональным, представляет собой не только главный структурный, компонент вириона, но также играет важную роль на многих этапах репликации вируса гриппа. На ранних этапах репликации для проникновения вРНП в цитоплазму хозяйской клетки необходима диссоциация вРНП и белка Ml. Позднее в репликационном цикле, вновь синтезированные молекулы белка Ml мигрируют в ядро зараженной клетки, где снова вступают во взаимодействие с вновь синтезированными вРНП [9,10]. Связывание Ml с вРНП стимулирует транспорт этого комплекса из ядра в цитоплазму [11] и предотвращает возвращение вРНП в ядро. Белок Ml также играет значительную роль при сборке. Здесь молекулы Ml связываются с вРНП и плазматической мембраной (возможно, через цитоплазматические "хвосты" двух поверхностных гликопротеинов) [12]. При созревании вирусных частиц соотношение M1:NP влияет на морфологические свойства и инфективность высвобождающихся вирусов [13].
М2 является трансмембранным белком, который в виде тетрамера образует ионные каналы в мембране вириона. Благодаря способности канала селективно пропускать протоны, рН внутри вириона снижается, что необходимо для диссоциации комплекса М1-вРНП [9] и проникновения вРНП в ядро. Кроме того, белок М2 участвует в удалении протонов из везикул аппарата Гольджи, что предохраняет синтезируемый НА от преждевременного расщепления у вирусов, гемагглютинин которых обладает повышенной чувствительностью к низким значениям рН [14]. Наконец, ряд работ, свидетельствует об участии белка М2 в регуляции сборки новых вирусных частиц [15].
Восьмой сегмент также кодирует два белка: NS1- и NS2. Белок NS1 является регулятором сплайсинга и трансляции мРНК, а также играет критическую роль в изменении интерферонового ответа1 на вирусную инфекцию. Функция NS2 заключается в экспорте вновь синтезированных вРНП из ядра к месту сборки вирионов [7].
Жизненный цикл вируса гриппа А Вирус гриппа связывается с N-ацетилнейраминовыми (сиаловыми) кислотами на поверхности клеток (Рис.3.) Контакт с рецепторами клетки хозяина обеспечивается за счет гемагглютинина. На поверхности вирусной оболочки он представлен в виде тримеров. Каждый из входящих в тример мономеров прочно заякорен в мембране и содержит две субъединицы - одна из них (НА1) обеспечивает первичный контакт с клеткой-мишенью, другая (НА2) отвечает за слияние вирусной и клеточной мембран. Различные по структуре и видовому происхождению НА отличаются по способности к распознаванию и связыванию с рецептором - сиаловои кислотой, связанной в
Тип связи концевой сиаловой кислоты и конформационная подвижность олигосахаридов поверхностных лектинов является элементом межвидового барьера для вирусов гриппа. Ранее было установлено, что рецепторы эпителиальных клеток дыхательного тракта человека содержат сиалоолигосахариды, у которых концевая сиаловая кислота соединена с галактозой связью а-2,6, рецепторы клеток эпителия кишечника птиц - а-2,3 связью, а клетки респираторного тракта некоторых млекопитающих (например, свиньи) несут оба типа рецепторов [18,19].
Эпидемиология вирусов гриппа А и межвидовая трансмиссия
Филогенетический анализ, а также то обстоятельство, что в популяциях диких водоплавающих птиц обнаружены вирусы всех известных к настоящему моменту подтипов гемагглютинина и неираминидазы, позволяет предположить, что все вирусы гриппа млекопитающих произошли от вирусов, циркулирующих среди птиц [4]. Дикие птицы водного и околоводного комплексов представляет собой естественный резервуар инфекции, в котором вирусы гриппа пребывают в определенном эволюционном равновесии ввиду оптимальной приспособленности к хозяину. В этих условиях аминокислотные замены не предоставляют селективных преимуществ, поэтому скорость эволюции вирусов птиц значительно ниже, по сравнению с вирусами млекопитающих, включая человека.
У людей вирусы гриппа А ежегодно вызывают эпидемии и с интервалом в 10-40 лет являются причиной пандемий. Источником инфекции является человек, больной или носитель. Заражение происходит воздушно-капельным путем. В связи с тем, что инкубационный период очень короток, возникшая эпидемия распространяется быстро и, при отсутствии коллективного иммунитета, может перерасти в пандемию. Основным регулятором эпидемий гриппа является иммунитет. По мере нарастания иммунной прослойки, эпидемия гриппа идет на убыль. Но, вместе с тем, в результате формирования иммунитета происходит селективный отбор штаммов вируса с измененной антигенной структурой обусловленной точечными мутациями в генах, прежде всего гемагглютинина и в меньшей степени нейраминидазы. Такой антигенный дрейф поддерживает непрерывность эпидемий.
Пандемии связаны с шифтовыми изменениями, возникающими после полной замены гена. Поскольку геном вируса гриппа сегментирован, при одновременном заражении клетки двумя разными штаммами сегменты их реплицирующихся геномов могут смешиваться в любых сочетаниях. В этом случае новые вирионы содержат разные наборы генов, заимствованные от каждого из исходных вирусов. Такое комбинирование сегментов вирусной РНК называют генетической перетасовкой, или реассортациеи. Реассортация теоретически может дать 256 (28) различных генетических вариантов. Роль реассортации в качестве механизма возникновения новых штаммов ; подтверждена пандемиями 1957 и 1968 годов, которые были вызваныіі вирусами с НА, РВ1 и NA или НА и РВ1 сегментами, унаследованными от «птичьего» штамма вируса [60]. Помимо реассортации отмечена рекомбинация вирусных сегментов, в ходе которой генетический материал перестраивается либо по механизму кроссинговера, либо в результате смены матрицы [61]. К антигенному шифту также может привести точечная мутация, вследствие которой вирусы, циркулирующие в животных популяциях, приобретут свойство напрямую передаваться от человека к человеку.
За последние 400 лет в мире описаны 18 пандемий гриппа. Из них научно подтвержденными являются пандемии 1918-1920, 1957, 1968 гг. и глобальная эпидемия 1977 г. Наиболее серьезной пандемией была «испанка», вызванная вирусами подтипа А(НШ1), которая поразила 30-40% населения Земли и унесла более 20 миллионов жизней в 1918-1919 гг. Позднее произошли еще две пандемии - "азиатский грипп" в 1957 г., обусловленный вирусами подтипа A(H2N2), и "гонконгский грипп" в 1968 г., возбудителями которого являлись вирусы подтипа A(H3N2). В 1977 г. вирус гриппа подтипа H1N1 вновь стал причиной тяжелой эпидемии, причем его нуклеотидная последовательность крайне незначительно отличалась от штаммов, циркулировавших в начале 1950-х годов. Подобное близкое родство и отсутствие мутаций противоречат гипотезе о персистенции данного штамма в животных популяциях. В настоящее время полагают, что пандемию 1977 г. вызвало случайное высвобождение лабораторного вируса. В отличие от 1968 года, когда вновь возникший подтип H3N2 полностью вытеснил циркулирующие H2N2 вирусы, замещения H3N2 не произошло. Вместо этого оба подтипа H1N1 и H3N2 продолжают циркулировать в настоящее время. Несмотря на то что "человеческими" вирусами гриппа считаются вирусы подтипов H1N1, H2N2 H.H3N2, регистрировались также случаи заражения человека вирусами с иными антигенными формулами. До 1996 года было зарегистрировано три случая выделения вирусов гриппа птиц у людей [62,63,64]. У инфицированных заболевание протекало в форме конъюнктивита, в редких случаях — слабовыраженного респираторного синдрома. В 1996 году вирус гриппа A/H7N7, относящийся к группе LPAI, был выделен в Англии от женщины, занимавшейся разведением уток. Заболевание также протекало в форме конъюнктивита. Было показано, что вирус имел более 98% нуклеотидной гомологии в гене НА с вирусом подтипа H7N7, выделенным от индеек в Ирландии в 1995 году [65].
Поскольку исход заболевания во всех случаях был благоприятным, считалось, что вирусы гриппа птиц не патогенны для людей. Эту точку зрения подтверждали и эксперименты на добровольцах [66]. Однако в последующие годы ситуация изменилась.
В 1997 г. вирусы подтипа H5N1 явились причиной чрезвычайно тяжелых форм заболевания среди людей - в Гонконге из 18 заболевших человек шестеро погибли, причем, все они заразились от цыплят [1]. В 2003 году вспыхнула новая эпизоотия, вызванная вирусом H5N1 (или т.н. «птичьим гриппом»), которая продолжается и сегодня. Согласно данным ВОЗ, с момента начала эпизоотии заразились уже 411 человек, 256 из которых погибли (к апрелю 2009). Не исключено, что существующий уровень летальности не соответствует истинному, поскольку заболевания со слабо выраженной симптоматикой могли не регистрироваться.
Чувствительность и специфичность амплификационных методов
Преимуществом LAMP является простота постановки реакции, и потенциальная возможность применения метода в полевых условиях. S. Jayawardena предложил использовать методику петлевой изотермальной амплификации для определения высокопатогенных штаммов подтипа H5N1 [93].
Чувствительность и специфичность амплификационных методов Чувствительность и специфичность всех описанных выше молекулярных методов зависит от 3 ключевых факторов, включающих выделение РНК, качество используемых для амплификации ферментов и правильный подбор последовательностей праймеров [94]. Выделение РНК - особенно важный этап, так как высоко-качественная РНК необходима для любого молекулярно-генетического теста. В тоже время известно, что молекула РНК менее стабильна чем ДНК и легче подвергается разрушению. Некоторые виды материала, например клоакальные или носоглоточные смывы, в которых необходимо детектировать вирус гриппа методами молекулярной диагностики, особенно трудны для анализа в связи с малым содержанием вирусных частиц, наличием в материале ингибиторов амплификации, необходимостью перед постановкой реакции транспортировать материал на дальние расстояния.
Чувствительность при диагностике гриппа обычно рассчитывается либо по минимальному количеству вирусных копий, либо по количеству эмбриональных инфекционных (ЭИД5о) или тканевых цитопатических (ТЦЦ5о) Д35 находящихся в исследуемом образце и выявляемых тестом.
Чувствительность ПЦР-тсстов, упомянутых выше, варьировала от 0,01 — 10 ТЦЦ50 и от 0,1 до 100 ЭИД50, в зависимости от того каким методом культивировали вирусы. Как правило «realime» ПЦР-тесты демонстрируют более высокую чувствительность (примерно на 1 порядок) по сравнению с теми, где применяется электрофоретическая визуализация продуктов амплификации. Чувствительность тестов, использующих изотермальную реакцию транскрипционно-опосредованной амплификации составила по данным авторов 0.1 ТЦЦ5о [90]. Разработчики LAMP указали, что чувствительность метода совпадает с чувствительностью традиционного одностадийного ПЦР-теста [92]. В исследовании A. Vabred с соавторами было показано, что чувствительность одного и того же теста может серьезно различаться при использовании различных штаммов вируса гриппа А [87]. Очевидно также, что и чувствительность, и специфичность тестов будут меняться по мере эволюции вируса.
Общий недостаток всех описанных выше методов заключается в том, что каждая из используемых праймерных систем специфична к определенному подтипу (или даже штамму). С одной стороны подобная специфичность позволяет добиться высокой чувствительности при определении данного конкретного подтипа. С другой стороны, все остальные подтипы ВГА остаются, за рамками анализа. Использование мультиплексной ПЦР, когда в одной реакции присутствуют праймеры специфичные к нескольким подтипам, позволяет частично решить эту проблему. Но количество праймеров в одной реакции ограничено межпраймерными взаимодействиями. Упомянутые выше амплификационные тесты, если даже в них используется мультиплексная амплификация, способны идентифицировать максимум 3-4 подтипа ВГА, причем в большинстве случаев субтипируется только гемагглютинин (главным образом HI и НЗ «человеческих» штаммов, Н5 и Н7 «птичьих» штаммов). Подобная специализация оправдана в том случае если штамм, обладающий пандемическим потенциалом, уже выявлен, но бесполезна при возникновении нового угрожающего штамма, в особенности с иной антигенной- формулой. Так, ни один из предложенных ранее методов теоретически не был способен идентифицировать (или дифференцировать от человеческого гриппа) появившийся в Мексике штамм «свиного» гриппа подтипа H1N1.
В связи с этим более перспективным представляется следующий подход: с помощью универсальной праймерной системы амплифицируются любые возможные подтипы ВГА, затем продукты амплификации анализируются, и в рамках этого анализа осуществляется идентификация вирусного подтипа. Наиболее информативным методом анализа является секвенирование. В настоящее время этот метод, наряду с культивированием и иммунологическим типированием в реакциях РТГА и РИНА, входит в инструментарий любой специализированной лаборатории, занимающейся исследованием вирусов гриппа. Альтернативой ему является динамично развивающаяся в последнее десятилетие технология ДНК микрочипов, которая позволяет проводить многопараметрический анализ генетического материала. Этот метод более прост в использовании, менее затратен и, как следствие, может использоваться в любой ПЦР лаборатории. К моменту начала данной работы, по созданию специализированного биологического микрочипа для субтипирования вирусов гриппа, в мировой научной литературе было лишь несколько публикаций, посвященных этой тематике. К настоящему моменту число подобных работ существенно возросло, что подтверждает перспективность выбранного подхода.
ДНК микрочипы представляют собой множество иммобилизованных на твердой фазе олигонуклеотидов, способных специфично связываться с детектируемыми последовательностями. В зависимости от технологии, олигонуклеотиды иммобилизуются на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика или металла. В гелевых биочипах, разработанных в ИМБ РАН, ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 микрон, нанесенного на пластик или специально обработанную поверхность стекла. Гибридизуемая ДНК предварительно нарабатывается в достаточных количествах одним из амплификационных методов и метится с помощью флуоресцентной метки. Флуоресценция является основным, но далеко не единственным методом изучения гибридизации. В частности, данные о характере гибридизации можно получить также с помощью масс-спектрометрии [95], атомной силовой микроскопии [96] и ряда других методов. Длина иммобилизованных олигонуклеотидов может варьировать в широких пределах от 15 до нескольких сотен нуклеотидов.
Разработка биологического микрочипа для определения подтипа вируса гриппа А
Был разработан биочип для молекулярного субтипирования ВГА, который позволяет определять 15 вариантов гемагглютинина, и 2 варианта нейраминидазы, представляющих наибольший эпидемиологический интерес.
Биочип состоит из 47 гелевых элементов (ячеек). В 41 ячейке иммобилизованы индивидуальные олигонуклеотидные зонды; 3 ячейки служат для вычисления фонового сигнала и 3 - для обработки флуоресцентной картины (Рис. 8). Гелевые элементы с иммобилизованными олигонуклеотидами объединены в группы, служащие для определения одного подтипа (выделены прямоугольными рамками). В рядах b-g сосредоточены группы дискриминирующих олигонуклеотидов для типирования 15 вариантов гемагглютинина (Н1-НГ5), а в рядах h и і -первого и,второго варианта нейраминидазы (N1, N2). Гелевые элементы al, jl, j7 содержат флуоресцентный маркер (М) для позиционирования сетки, формируемой программным обеспечением для определения интенсивности флуоресцентных сигналов в элементах микрочипа. Ячейки f4-f6 (Neg) не содержат олигонуклеотидов и служат для вычисления фонового сигнала.
При гибридизации с микрочипом флуоресцентно меченный фрагмент ДНК, полученный с помощью обратной транскрипции и амплификации РНК вируса, образует совершенный гибридизационный комплекс с комплементарным ему иммобилизованным олигонуклеотидом, что приводит к накоплению флуоресцентного сигнала в соответствующей ячейке. В пределах одной группы ячеек таких совершенных комплексов может образоваться несколько. В остальных группах ячеек образуются несовершенные гибридизационные комплексы, которые вследствие своей термодинамической нестабильности разрушаются при отмывке.
Положительными (свидетельствующими о формировании совершенного гибридизационного комплекса) считали сигналы, более чем в 3 раза превышающие среднее значение флуоресценции трех контрольных ячеек, не содержащих олигонуклеотидов (f4-f6). Таким образом, регистрация положительных сигналов в тех или иных группах позволяет сделать заключение о принадлежности исследуемого штамма к соответствующему подтипу. Условия проведения гибридизации были оптимизированы таким образом, чтобы обеспечить возможность надежной интерпретации гибридизационной картины, как при. помощи специализированных программных средств, так и визуально.
Оптимизация условий анализа
Разработанная процедура анализа состояла из 4 этапов: 1) выделение вирусной РНК; 2) проведение двухэтапной ОТ-ПЦР с образованием одноцепочечного флуоресцентно меченного продукта; 3) гибридизация продуктов амплификации на олигонуклеотидном микрочипе; 4) регистрация и интерпретация результатов с использованием специализированного аппаратно-программного обеспечения. Основные усилия по оптимизации были направлены на выбор условий ОТ-ПЦР и способа введения флуоресцентной метки в пробу.
Условия ОТ-ПЦР подбирали, варьируя температуру отжига, концентрацию ионов магния, праймеров и фермента в реакционной смеси, количество РНК-матрицы, времена денатурации, отжига и элонгации. Оптимальные условия проведения амплификации, подобранные в результате выполненных экспериментов, приведены в разделе «Материалы и методы». Пример ОТ-ПЦР, выполненной при анализе 11 полевых образцов, собранных в популяциях диких водоплавающих птиц, (исходный образец -клоакальные смывы, вирусы предварительно культивированы на куриных эмбрионах) приведен на Рис.9.
Для флуоресцентного маркирования нами было предложено использовать флуоресцентно меченные нуклеозидтрифосфаты. Преимуществом данного подхода, в сравнении с маркированием пробы посредством меченого по 5 концу праймера, является абсолютное увеличение количества молекул флуорофора-.в продукте амплификации, поскольку полимераза встраивает в случайном порядке меченые и немеченые нуклеозидтрифосфаты в Рис.9. Электрофоретический анализ продуктов ОТ-ПЦР. Дорожки 1-11 -амплификация кДНК, полученной с образцов РНК, выделенных из культуры вируса (материалом для культивирования служили клоакальные смывы), к-, К2— отрицательные контроли выделения и амплификации соответственно. Маркер FastRuler LowR, «Fermentas». синтезируемую цепь ДНК в процессе элонгации.
Сравнение различных производных проводили с помощью набора для выявления лекарственно-устойчивых форм туберкулеза «ТБ-Биочип» («Биочип-ИМБ», Россия) [112], позволяющего идентифицировать 29 мутаций в гене гроВ, ответственном за устойчивость микобактерии туберкулеза к рифампицину и 19 мутаций в генах katG, inhA, ahpC, ответственных за устойчивость М. tuberculosis к изониазиду. В качестве матрицы использовали выделенный препарат ДНК М. tuberculosis «дикого типа», содержащий 10 геном-эквивалентов. При использовании модифицированных флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов в стандартный протокол анализа вносили следующие изменения: на втором этапе амплификации использовали праймеры, не имеющие флуоресцентной метки на 5 -конце; реакционная смесь второго этапа содержала 2-24 мкМ меченого 2,-дезоксиуридин-5г-трифосфата.
Всего было проанализировано 23 модифицированных 2,-дезоксиуридин 5Л-трифосфата (dUl - dU23). Сравнение гибридизационных сигналов, полученных при использовании модифицированных нуклеозидтрифосфатов, осуществляли следующим образом: вычисляли средний флуоресцентный сигнал Іт в ячейках, содержащих зонды, полностью комплементарные ДНК «дикого типа» М. tuberculosis. Данное значение нормализовали относительно 1т, полученного при использовании референс-нуклеозидтрифосфата dUl. На первом этапе работы было изучено влияние концентрации меченых нуклеозидтрифосфатов в реакционной смеси на интенсивность /„,. При использовании модифицированных оснований dUl и dU2 оптимальный диапазон концентраций составил 6-12 мкМ (соотношение меченого нуклеозидтрифосфата к немеченому составляло 1/25-1/15). Уменьшение флуоресцентного сигнала при использовании концентраций ниже 6 мкМ по-видимому было обусловлено малым числом встроившихся меченых оснований при амплификации. В то же время увеличение концентрации свыше 12 мкМ отрицательно сказывалось на эффективности амплификации, о чем свидетельствовало снижение интенсивности полос амплифицированнного продукта при электрофоретическом анализе.
Похожие диссертации на Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе
