Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа Штыря Юлия Александровна

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 9

2.1. Вирус гриппа 9

2.2.Классификация нейраминидаз 13

2.3. Структура нейраминидаз 14

2.3.1. Цитоплазматический участок 16

2.3.2. Трансмембранный домен 18

2.1..3. Стебель 18

2.3.4. Голова 21

2.3.5. Гликозилирование 26

2.4.Строение каталитического центра 28

2.5.Механизм реакции 31

2.6.Ингибиторы нейраминидаз 33

2.6.1. Мутации в NA, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам NA 36

2.6.2. Мутации в НА, возникающие под действием ингибиторов NA 38

2.6.3. Современная ситуация с возникновением резистентных штаммов вируса гриппа 40

2.7.Определение активности и специфичности нейраминидазы вируса гриппа 43

2.7.1. Определение активности 43

2.7.2. Изучение субстратной специфичности 46

2.7.3. Известные литературные данные об олигосахаридной специфичности NA вирусов гриппа 48

2.8.Корреляция активностей гемагглютинина и нейраминидазы 53

2.8.1. Восстановление функционального баланса в реассортантных вариантах 53

2.9. Восстановление функционального баланса при дефектах вируса гриппа 55

3. Материалы и методы 57

4. Результаты и обсуждение 70

4.1.Метод определения активности и специфичности нейраминидаз с помощью BODIPY-меченых олигосахаридов 70

4.2. Определение активности NA вируса гриппа 81

4.3.Влияние вирусных белков на действие нейраминидазы 85

4.3.1. Удаление NA с вирусной частицы. Сравнение свободной и вирус-связанной нейраминидазы 85

4.3.2. Изменние типа гемагглютинина и М-белка 90

4.4.Влияние хранения вакцинных штаммов вируса гриппа на профиль специфичности NA 94

4.5. Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах 97

4.6. Субстратная специфичность вирусных реассортантов подтипа H5N2 109

4.7. Субстратная специфичность NA вирусов подтипа H9N2 111

4.8.Роль а.к. остатков 258, 275, 331, 339, 367, 370, 400 и 431 в функционировании нейраминидазы N2 115

4.9.Специфичность исследованных вирусов гриппа: общие закономерности 117

4.10. Вирусы, устойчивые к тамифлю 120

Заключение 123

Выводы 125

Благодарности 127

Список литературы 128

• Структура нейраминидаз
• Мутации в NA, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам NA
• Определение активности NA вируса гриппа
• Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах

Введение к работе

На поверхности вируса гриппа находятся два гликопротеина, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), которые узнают сиалированные углеводные цепи клетки-мишени. Функции этих белков противоположны друг другу: НА связывается с сиалированными рецепторами, a NA отщепляет терминальную сиаловую кислоту с углеводных цепей, то есть разрушает рецептор. Важным условием эффективной репликации вируса гриппа является оптимальное соотношение активностей НА и NA.

Известно, что NA необходима вирусу гриппа на стадии отпочковывания созревших вирусных частиц от клеточной поверхности (Wagner el al., 2002). Кроме того, есть экспериментальные доказательства необходимости NA на начальном этапе инфекционного цикла вируса гриппа (Matrosovich et al., 2004). Нейраминидаза вируса гриппа является одной из наиболее охарактеризованных сиалидаз: известна пространственная структура NA нескольких подтипов вируса гриппа А, а также нейраминидазы единственного подтипа вируса гриппа В. Предложен механизм действия фермента (Janakiraman et al., 1994). Много сведений накоплено о структурных особенностях и выявлены общие тенденции эволюции NA вирусов различной природы (Colman et al., 1993).

Несмотря на повышенный интерес к NA, ее функциональная активность исследована мало, а специфичность остается практически неизученной. В частности, опубликовано всего несколько работ, в которых была осуществлена попытка определения олигосахаридной специфичности NA. Отсутствие данных связано как с трудоемкостью существующих методов, так и с недоступностью сиалированных олигосахаридов. Без знания субстратной специфичности NA по отношению к природным сиалоолигосахаридам невозможны ни определение роли отдельных участков полипептидной цепи в функционировании NA, ни мониторинг возникновения и распространения новых штаммов вируса гриппа,

в частности вирусов, устойчивых к лекарствам-ингибиторам NA, ни понимание механизмов лекарственной устойчивости вирусов гриппа.

Цели и задачи исследования.

Целью данной кандидатской диссертации являлась разработка нового высокочувствительного метода определения активности и исследования субстратной специфичности NA вируса гриппа, и его применение для изучения олигосахаридной специфичности NA нескольких групп вирусов, в частности:

а) природных изолятов вирусов одного подтипа, выделенных от
различных хозяев;

б) искусственно полученных реассортантов вируса гриппа;

в) вирусов, устойчивых к ингибиторам NA;

г) NA в составе вирусной частицы в сравнении с тем же ферментом,
находящимся в растворе.

Кроме того, на основании полученных данных об олигосахаридной специфичности NA предполагалось изучение влияния отдельных аминокислотных замен на функционирование фермента.

Новизна полученных результатов.

Предложен метод определения специфичности NA, основанный на использовании в качестве ее субстратов набора флуоресцентно-меченых по спейсерной группе сиалоолигосахаридов.

С помощью семи субстратов показано, что для нейраминидаз вирусов гриппа, выделенных от различных «хозяев», характерны индивидуальные профили субстратной специфичности.

Показано, что восстановление функционального баланса

гемагглютинин/нейраминидаза реассортантов вирусов гриппа человека с вирусами птиц, может происходить не только благодаря изменению активности, но также и субстратной специфичности NA.

Показано, что замена H274Y (NA), обеспечивающая устойчивость современных вирусов гриппа человека к лекарству тамифлю, не приводит к изменению специфичности NA.

Доказано, что функционирование NA зависит от непосредственного окружения фермента, а именно, свойства индивидуального белка отличаются от таковых в составе вирусной частицы.

Научно-практическая ценность работы.

Разработанный метод определения специфичности NA оказался востребованным в службах эпидемиологического надзора за появлением новых разновидностей вируса гриппа, в частности, опасных для человека птичьих штаммов, а также мутаптных вариантов, устойчивых к тамифлю. Предлагаемый метод уже используется для характеризации новых сезонных штаммов вируса гриппа в центрах контроля и профилактики заболеваний: в США (Centers for Disease Control and Prevention), Атланта) и Германии (Институт им. Роберта Коха, Robert Koch-Institut, Берлин).

Кроме того, разработанный метод позволил выявить изменения, происходящие с NA вакцинного варианта вируса гриппа при его инактивации при длительном хранении, что актуально при получении нового поколения противовирусных вакцин (Европейский исследовательский консорциум FLUVACC, FP6).

9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вирус гриппа

Вирусы гриппа являются представителями семейства Orthomyxovirdae, к которому относятся РНК-содержащие вирусы с сегментированным геномом. Генетический материал вируса гриппа закодирован в восьми сегментах РНК, два из которых, а именно NS и М, имеют по две рамки считывания и, поэтому, из них получаются по два белковых продукта (NS1 и NS2, Ml и М2 соответственно) (Colman 1989). РНК, входящие в состав вирусной частицы, лишены структуры кэпа. Так как они являются (-РНК), то синтез' вирусных белков с них невозможен; для его осуществления необходима кэпированная и полиаденилированная (+РНК). За процесс синтеза мРНК ответственен комплекс полимеразных белков, который «ворует» кэп-структуры с несозревших клеточных мРНК, присутствующих в ядре, и обеспечивает полиаденилирование полученной РНК. Вирионы покрыты липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой экспонированы белки геммаглютинин (НА, около 85% белка поверхности), нейраминидаза (NA, 15%) и М2 белок, образующий ионные каналы (Barman et ah, 2004). Липопротеиновая оболочка вируса изнутри выстлана плотным слоем Ml-белка, взаимодействующего с цитоплазматическими участками НА и NA. Восемь генных сегментов плотно упакованы в NP белок, причем на каждый генный сегмент вириона приходится по одному комплексу полимеразных белков (РВ1, РВ2 и РА). Неструктурные белки участвуют в репликации вируса и подавлении ответа на вирусную инфекцию с участием системы интерферонов.

В настоящее время известно три подтипа вирусов гриппа, а именно А, В и С. Вирус С, также, как и вирус В, заражает только человека и не имеет большого количества антигенных подтипов. Его основным отличием от

вирусов гриппа А и В является то, что его рецептор-связывающие и рецептор-разрушающие функции выполняются одним и тем же HN-белком. Разнообразие антигенных подтипов вируса гриппа В тоже невелико. Хозяевами для вируса А являются не только люди, но и дикие и домашние птицы, а также многие виды млекопитающих, такие как лошади, свиньи, дельфины и кошки. Способность вируса гриппа А циркулировать в том или ином круге хозяев связана с набором подтипов НА и NA, для каждого вида хозяев характерен свой набор подтипов. Вирусы гриппа А выделяют из многих видов млекопитающих и птиц (Makarova et al., 1999; Nicol et al., 2000). На рисунке 1 представлено филогенетическое дерево вирусов гриппа А. Для его построения за основу была взята последовательность белка NP, так как он, в отличие от поверхностных белков, менее подвержен изменениям. Филогенетические данные подтверждают экологические данные о том, что спектр вирусов гриппа водоплавающих птиц является не только самым широким и разнообразным, но и самым константным, то есть эти вирусы находятся под наименьшим давлением отбора.

_]ⁿ _V*

І tye

.EQ5b(H7N7)

EQ63(ll3Ne)

EQ739(H7N7) EQKY86(1H\S) EQTN86(H1NH) SWHK82(H3\2)

_и:

PA73UI7 )

H DK77( і 11 \ 0

J~l BDG77(114 N6)

I Mink84(Hll)N4)

_ SW81(lll\l) r~L_SW85(in\l)

|j DK75(H3 )

I DK82(H?Nh)

Рисунок 1. Филогенетическое дерево гриппа А, построенное на основании нуклеотидной последовательности гена белка NP. NP-последовательности вирусов делятся на 5 видоспецифичных линий. Диагонально заштрихованные виды означают, что вирусы переданы в других хозяев (то есть, не характерны для данного хозяина, например H5N1 вирусы - для человека). Н - гемагтлютинин, N - нейраминидаза, показан вид и год изолята. EQ - лошадь, SW - свинья, HU - человек, GUL - чайка, DK - утка, RT - красноголовая камнешарка, TY - индейка, СК - курица, FPV - вирус чумы птиц, TN - крачка, РА -попугай, BDG - волнистый попугайчик. Цвет ветвей и типов Н и N (указаны после названия вируса) показывает возможные реассортантыне вирусы (в прямоугольниках - чистые реассортанты) (Strauss & Strauss, 2002).

100 Нуклеотидных замен

I 1

r-L

SW77(1I1M) SW30(1IIM) SW31(lil\0

HU33(WS) (і і ) HU34(PR8)(lil\0 HU60-68(H3\J)

SWIIK76(H3 )

HU72(Udorn)(lB ) HU83(H3N2) _ _ GUL84(H13\*)

GUL84(H13\n)

. GUL78(H13N6)

I GUL79(im\h)

JL, GUMN80(HI3Njh)

__J1 Whale84(Hn )

' GULMA80(H13N6)
DK78( )

RT85(H4Nh)

TY80(!I1 3\n)

СКвЗОІ- )

_ DK76(tl4\ii)

DK79(H4H4)

FPV34(H7\ )
CK49(HK)N7)

_DK56(II4\h)

DK6CKH11N8)

, TN61(\^\>)

^

В настоящее время известно шестнадцать подтипов НА и девять подтипов NA (Webby & Webster 2001, Fouchier et al., 2005). Все девять подтипов NA и практически все подтипы НА встречаются у водоплавающих птиц. Только три (HI, Н2 и НЗ) подтипа НА, и только два подтипа NA (N1 и N2) вызывали в XX веке пандемии. С 1977 года только два подтипа вируса гриппа А совместно циркулируют среди людей: H3N2 и H1N1. Однако, до настоящего времени ни одной эпидемии, вызванной их реассортантными вариантами не было зарегистрировано. Реассортанты, если и возникали, то всего на один-два эпидемических сезона (H1N2), а сочетание H3N1 не было выявлено вообще (Rudneva et al., 1996). Вирусы N5N1, типичные для птиц, в течение последних 10 лет периодически выявляются у людей, однако лишены способности передаваться от человека к человеку (Yen et al., 2007). В популяции свиней H1N2 подтип с недавнего времени циркулирует наравне с H3N2 и НШ1 вирусами гриппа (Karasin et al., 2000). В популяции лошадей обнаружены вирусы H3N8 и H7N7, а вирусы подтипа Н13 выделены только от чаек и дельфинов. Таким образом, не все теоретически возможные сочетания НА и NA встречаются в природе. Механизмы, лежащие в основе ограниченной совместимости этих двух белков, только начинают изучаться.

13 Классификация нейраминидаз

Нейраминидаза - это N-ацетил-нейраминил-гидролаза (ЕС 3.2.1.18), ее ферментативная активность заключается в расщеплении а-кетозидной связи между терминальным остатком сиаловой (N-ацетилнейраминовой) кислоты и следующим моносахаридным остатком. Аминокислотная последовательность NA закодирована в шестом сегменте РНК. У вирусов гриппа А выделяют девять серотипов NA, у вирусов В и С - по одному (Colman, 1989). Субтип NA вируса гриппа А обозначают номерами, например N2.

Подтипы нейраминидаз вирусов гриппа А разделяются на две филогенетические группы (Рисунок 2). В первую входят NA подтипов N1, N4, N5 и N8, а во вторую - N2, N3, N6, N7 и N9 (Russel et al., 2006). Основные структурные различия между этими группами находятся в районе петли-150 и кармана-150, соседствующих с активным центром. Их расположение таково, что в первой группе NA есть полость, продолжающая карман активного центра, которой нет у NA второй группы.

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, содержащее некоторые типичные NA вирусов гриппа В, и девяти подтипов NA вирусов гриппа А. Нейраминидазы подтипа А разделяются на две группы, выделенные зеленым и желтым цветами (Russel et al., 2006).

14 Структура нейраминидаз

NA состоит из 470 а.к. остатков, в белке можно выделить несколько структурно-функциональных доменов: цитоплазматический участок, трансмембранный домен и стебель.

На поверхности вириона NA в виде гомотетрамера грибообразной формы находится квадратная «голова» размером 80*80*40 А на тонком стебле диаметром 15 А и длиной до 100 А (чаще около 60 A) (Colman, 1989). Молекулярный вес мономера ~ 60 кДа, а тетрамера ~ 240 кДа (Varghese & Colman, 1991). На поверхности вириона присутствует в среднем 50 таких тетрамеров, расположенных скорее всего не равномерно, а в виде кластеров (Harris et al., 2006). В настоящее время известны пространственные структуры нейраминидаз N1, N2, N4, N8, N9 и В (Varghese et al., 1983; Varghese & Colman, 1991; Bossart-Whitaker et al., 1993, Janakiraman et al., 1994; Varghese et al., 1997; Russel et al., 2006). Несмотря на то, что гомология по первичной структуре NA между типами А и В достигает всего 30%, их пространственная организация идентична. При общей схеме укладки полипептидной цепи, существуют небольшие отличия в количестве аминокислот, входящих в тяжи и межтяжевые петли. Однако, эта вариабельность не влияет на пространственное расположение ключевых остатков NA, как функциональных, так и структурных (Bossart-Whitaker et al., 1993). После получения рентгеноструктурных данных по строению нейраминидаз N1, N4 и N8 и сравнения их пространственных структур с ранее известными выяснилось, что между NA групп 1 и 2 существуют небольшие различия в районе 150 а.к. остатка (остатки с 147 по 152) (Рисунок 3). Конформация петли-150 такова, что Са углеродного атома Vail49 у NA группы 1 расположен на 7 А дальше, чем атом в остатке Не 149 у NA группы 2. В точке максимального приближения петли-150 к активному центру наблюдается различие в 1,5 А в положении боковой цепи консервативного остатка Aspl51 между NA двух групп. Располагающийся радом консервативный остаток Glull9 у NA группы 2 формирует водородную

связь с Argl56, а у NA группы 1 боковая цепь этого остатка направлена в противоположную сторону. Различия в пространственной ориентации этих двух остатков приводят к увеличению на 5А «ширины» активного центра у NA группы 1. У NA второй группы Gin 136 образует водородную связь с углеродным остатком основной цепи а.к. остатка 150, что стабилизирует структуру петли. В белках группы 2 образование подобной водородной связи невозможно по стерическим причинам, что приводит к сдвигу цепи на 3,5 А ниже к основанию кармана. Т.о., карман-150 имеет размеры 10*5*5А (Russel et al., 2006).

Рисунок 3. Наложение активных центров трех неираминидаз из группы 1, показывающее их идентичность Нейраминидаза N1 представлена зеленым, N4 - золотым, N8 - синим. Наложение активных центров неираминидаз N1 (зеленый) и N9 (желтый) показывает, что N9 значительно отличается от N1 в районе а.к. остатка 150 (Russel et al., 2006).

Цитоплазматический участок

Цитоплазматический домен состоит из шести высоко-консервативных аминокислот (Block and Air, 1982). Мутации в этом и трансмембранном участках белка могут влиять на его экспрессию, созревание, транспорт, сборку вирусных частиц и ферментативную активность (Barman et al., 2004).

Цитоплазматический участок NA играет важную роль в процессе сборки новых вирусных частиц, определяя не только их форму, но и соотношение РНК и белков, входящих в состав вириопа. Процесс сборки вирусных частиц в общем можно представить в виде взаимодействия цитоплазматических и/или трансмембранных доменов поверхностных белков, заякоренных в мембране (НА, NA и М2) с выстилающим внутреннюю мембрану вирусной частицы белком Ml, который, в свою очередь, ассоциирован с вирусными РНП-частицами (Garoff et al., 1998, Nayak et al., 2004). Отсутствие цитоплазматического участка NA приводит к снижению выхода вирусных частиц и количества NA в составе вириона, изменению соотношения включаемых в вирион белков. Изменение количества РНК в вирионе и снижение инфекционности наблюдается у вирусных частиц с делетированным цитоплазматическим участком NA. При отсутствии этого участка, образуются вирионы филаментоподобной структуры, а при отсутствии цитоплазматических участков НА и NA образуются вирионы нерегулярной формы (Jin et al., 1997). Делеция цитоплазматических участков НА и NA не нарушает апикальной направленности их транспорта к мембране хозяйской клетки, но влияет на липидный состав вирусной мембраны: в ней уменьшается количество островков сфинголипидов и холестерина. Это, в свою очередь, приводит к снижению количества белка Мів вирусных частицах. Белок Ml необходим для сборки всех вирусных компонентов, включая РНП. Таким образом, вирусные частицы, несущие делеции по цитоплазматическим участкам НА и NA, имеют не только измененную морфологию, но и отличаются от природных вирионов нарушенным белковым и РНК-составом (Zhang et al., 2000, Barman et al., 2004). Недавно было показано, что белок Ml локализуется не только в ядре зараженной клетки, но также формирует островки на плазматической мембране в тех же местах, где локализуются на клеточной поверхности НА и NA, и выделяется в той же фракции, что НА и NA при дифференциальном центрифугировании (Latham and Galarza 2001). Замена а.к. №№ 2, 3 и 4 цитоплазматического домена NA приводит не только к снижению продукции

белка (27% по сравнению с диким типом), но и к исчезновению взаимодействия с белком Ml, что резко снижает количество тетрамеров NA, включаемых в вирион (Barman et al., 2004).

Трансмембранний домен

Гомология трансмембранного домена между подтипами NA низка. Тем не менее, наличие гидрофобных а.к., таких как изолейцин и аланин, характерно для всех трансмембранных структур: полярные а.к., такие как треонин и серии, возможно, необходимы для тетрамеризации нейраминидазы (Colman, 1989). В этом домене находится транслокационный сигнал и «якорный домен» для связывания с мембраной, который взаимодействует с липидными островками и содержит несколько сайтов, ответственных за апикальный транспорт белка (Kundu et al., 1996; Barman and Nayak, 2000). Вирусы с мутациями в трансмембранном домене имеют сниженный уровень нейраминидазной активности, плохо включаются в состав вируса, а полученные вирусные частицы остаются прикрепленными к поверхности клетки (Barman et al., 2004).

Стебель

А.к. последовательность стебля низкоконсервативна (Colman, 1989). Стебель является наиболее вариабельным участком NA, его длина может варьировать от 25 до 57 а.к. остатков (в среднем 45). Известно несколько подтипов вирусов (птичьи и человеческие H1N1, H5N1, H9N2; а также H7N3, H7N7 - только из птичьей популяции) с природными вариациями в длине стебля (Matrosovich et al., 1999; Campitelli et al, 2004). Замечено, что вирусы гриппа тех же подтипов, циркулирующие в популяции водоплавающих птиц, не только не несут делеций в стебле NA, но, наоборот, имеют консервативные а.к. последовательности в этих областях (Matrosovich et al., 1999). Так что делетированность этой области NA в вирусах домашней птицы и человека

свидетельствует о появлении данной делеции при переходе вируса водоплавающей птицы к курам и человеку, а не появлению вставки аминокислот в NA вирусов водоплавающих птиц (Matrosovich et al., 1999). У вирусов кур подтипов N1 и N2 делеция NA сопряжена с потерей от двух до четырех сайтов гликозилирования NA в районе а.к. 45 - 90. Это может влиять на эффективность ко- и посттрансляционной укладки полипептидной цепи. Механизм отбора вирусов с укороченным стеблем пока не ясен, одной из возможных причин возникновения вариантов с делециями в стебле NA может быть взаимная подстройка активности NA и НА друг к другу в новом хозяине (Matrosovich et al., 1999), рисунок 4.

нумерация по N2

Parrot/OnbCTep/7 3 Н7 [К02252

ВЧП/Росток/34 Н7 [Х52226

Sw/NJ/8/76 HI [М27970

Sw/WI/4754/94 HI [U53166

NWS/33 HI [L25815

WS/33 HI [L25816

WSN/33 HI [L25817

PR/8/34 HI [J02146

Мельбурн35* HI [K01020

Белами/42* HI [K01003

FW/1/50 HI [J02126

CCCP/90/77 HI [J02564

Чили/1/83 HI [X15281

HK/156/97 HI [AF028708

Ck/HK/258/97 HI [AF057291

40 50 60 70 80 90 HSIQTGNQNQPETCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFVAEQAVAPVALAGNSSLC

HSIQTENQNHHEACNPSI AGQDAASVALAGNSSLC

HSIQTGEKSHPKVCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNLAAGQGVTPIILAGNSSLC HSIQTGEKNHPEICSQNVITYENNTWVNQTYVNISNTNLADGQGVTSIILAGNSSLC

HSIQTGNQNHTGICNQGIITHK WAGQDSTSVILTGNSSLC

HSIQTGNQNHTGICNQGIITYN WAGQDSTSVILTGNSSLC

HSIQTGNQNHTGICNQGIITHK WAGQDSTSVILTGNSSLC

HSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTW KDTTSVILTGNSSLC

HSIQAGS STWVNQTYANISNTNWAG

HSIQTGSQNHTGICNHSIITYKNSTWVNQTYVNISNTNWAGKDTTSMILAGNS HSIQTGSQNHTGICNQRIITYENNTWANQTYVNISNTNWAGKDTTSMTLA HSIQTGSQNHTGICNQRIITYENSTWVNQTYVNISNTNWAGKDTTSMTLAGNSSLC HSIQTGSQNHTGICNQRIITYENSTWVNQTYVNINNTNWAGKDTTSVTLAGNSSLC

HIIQTWHPNQPEPCNQSI NFYTEQAAASVTLAGNSSLC

HIIQTWHPNQPEPCNQSI NFYTEQAAASVTLAGNSSLC

Dk/HK/24/76

Dk/HK/245/77

Ck/PA/8125/83

Ck/PA/1370/83

X-7 (RI/5+/57)

X-7 - Stubby

Токио/3/67

Айдахо/4/95

Sw/HK/1/76

Sw/HK/82/78

Sw/3xhm/1/80

Sw/HK/127/82

H2 [D21184]

H2 [D21185]

H5 [M11925]

H5 [M12051]

H2 [M18650]

H2 [M10899]

H2 [K01393]

H3 [AF008741]

H3 [D21187]

H3 [D21193]

HI [D00713]

H3 [D00713]

HFKQHECNSPAINQVIPCEPIIIERNITEIVYLNNTTIEREVCPKIADYRNWSKPQC HFKQHECNPPAINQVTPCEPIIIERNITEIVYLNNTTIEREVCPVIADYRNWSKPQC

HFRQNEESIPAYNQTTPCKPIIIERNI KYRNWSKPQC

HFRQNEGSIPAYNQTTPCKPIIIERNI KYRNWSKPQC

HFKQHECDSPASNQVMPCEPIIIERNITEIVYLNNTTIEKEICPEWEYRNWSKPQC

HFK LIERNITEIVYLNNTTIEKEICPEWEYRNWSKPQC

HFKQHECDSPASNQVMPCEPIIIERNITEIVYLNNTTIEKEICPKWEYRNWSKPQC HFKQYECNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEVCPKLAEYRNWSKPQC HFKQYECDSPANNQVMPCEPIIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLVEYRNWSKPQC HFKQYECDSPANNQVMPCEPIIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLVEYRNWSKPQC HFRQHESDSPPSNQVIPCEPIIIERNITEIVYLNNTTIEKETCPKSVEYRNWSKPQC HFNQYESDSLADNQVMPCEPIIIERNITEIIYLTNTTIEKEICPKLMEYRNWSKPQC

Рисунок 4. A.k. последовательность района стебля N1 и N2 NA вирусов гриппа. «-» обозначают делеции; потенциальные сайты гликозилирования окрашены серым; Parrot -попугай, FPV - вирус чумы птиц, Dk - утка, Ск - цыпленок, Sw - свинья, NJ - Нью Джерси, W1 - Висконсин, PR - Пуэрторико, FW - Фортварен, НК - Гонконг, РА - Пенсильвания (по Matrosovich et al., 1999).

Длина стебля, по-видимому, является регуляторным фактором каталитической функции NA. Показано, что укорочение стебля NA не изменяет ее активности по отношению к низкомолекулярному субстрату, но влияет на эффективность отщепления нейраминовой кислоты от высокомолекулярных гликопротеинов (Mitnaul et al., 2000). Меняется ли субстратная специфичность делетированых NA, пока не ясно.

Голова

Наибольший процент гомологии нейраминидаз вирусов достигается внутри каждого подтипа (90%), в то время как между подтипами - только 50%, а между типами А и В — еще меньше, 30% (Colman et al., 1993). Наилучшее совпадение наблюдается в районе а.к. 74 - 390 (нумерация по N2). Этот район относится к голове, причем высоко консервативным явялется участок 118 -375. В этой области расположены аминокислоты, непосредственно участвующие в каталитической активности фермента. Особенно консервативным является остаток Asn 146, формирующий сайт гликозилирования. Консервативны также остатки пролина, которые важны для укладки полипептидной цепи и образования функционально активной молекулы. Гомология наблюдается и в расположении остатков цистеина, обеспечивающих правильную укладку полипептидной цепи и стабилизацию молекулы.

Пространственная укладка белка

Рентгеноструктурными исследованиями (Bossart-Whitaker et al., 1993) показано, что голова NA представляет собой большой домен, состоящий из шести идентичных антипараллельных Р-слоев, организованных в пропеллер-подобную структуру. Каждый Р-слой состоит из четырех антипараллельных Р-тяжей (Branden & Tooze, 1998).

Диаграмма укладки полипептидной цепи представлена на рисунке 5. Наиболее важными для функционирования фермента являются петли между слоями и между тяжами 2 и 3 каждого слоя (Colman, 1989). Петли являются наиболее вариабельной частью структуры NA, они могут варьировать по длине и даже содержать в себе элементы вторичной структуры (Bossart-Whitaker et al., 1993). Петля, соединяющая слои 4 и 5, является самой длинной в молекуле, она стабилизируется дисульфидным мостиком между Cys318 и Cys337, содержит

консервативную ионную пару Asp330 - Arg364 и сайт связывания иона Са (Varghese & Colman, 1991).

Рисунок 5. Укладка полипептидной цепи NA, вид сверху относительно оси симметрии шестого порядка. Субъединица NA построена из шести конститутивных мотивов, каждый из которых, в свою очередь, состоит из четырех антипараллельных Р-тяжей; эти мотивы называют лопастями пропеллера, а всю структуру - 6-лопастевым пропеллером, где мотивы соединены петлями — от четвертого тяжа одного мотива к первому тяжу следующего (по Branden & Tooze, 1998).

Са-связывающий домен

В голове фермента обнаружен Са-связывающий домен, стабилизирующий активность фермента при низких значениях рН (Colman, 1989; Takahashi et al., 2003). Данный сайт имеет октаэдрическую симметрию. Он образован атомами кислорода главной цепи (остатки 297, 345 и 348) и Оу2

боковой цепи остатка 324. Эти пять «контактных» кислородов - октаэдрически координированные лиганды для Са²⁺, оставляющие один из сайтов в координационной сфере вакантным (Varghese & Colman, 1991; Bossart-Whitaker et al., 1993). Кроме них, в формировании сайта участвуют а.к. остатки в позициях 293, 347, 111-115 и 139-143. Са-связывающий сайт контактирует с активным центром фермента через консервативные а.к. остатки (Takahashi et al., 2003).

При исследовании штаммов N2, стабильных и нестабильных при низких значениях рН, было выяснено, что замены Arg344Lys и Phe466Leu дестабилизируют NA при низких рН, а замена в позиции 466 критична для стабильности: именно она обуславливает рН-лабильность N2 NA. Аминокислоты в этих позициях располагаются не в районе активного центра молекулы, но находятся вблизи сайта связывания кальция. Остаток 466 располагается вблизи поверхности соприкосновения мономеров NA между собой, замена Phe—>Leu может приводить к нарушению конформации гомотетрамера NA (Takahashi et al., 2003). Недавно этой же группой исследователей было показано, что большая часть N2 нейраминидаз вирусов гриппа птиц и H3N2 вирусов человека, вызвавших пандемии в 1957 и 1968 годах, обладают стабильностью при низких значениях рН, в то время как вирусы человека с NA подтипа N2, выделенные начиная с 1968 года, теряют стабильность при низких значениях рН. Причина этой потери пока не ясна, но возможно, что стабильность при низких значениях рН не является положительным изменением при адаптации вируса к репликации в организме человека (Suzuki et al., 2004).

НВ-сайт

У нейраминидазы N9 был найден второй сайт связывания нейраминовой кислоты (так называемый НВ-сайт). Он расположен на периферии NA, на расстоянии 14 А от основного центра связывания в направлении к Arg371. Последовательность, соответствующая этому сайту, высоко-консервативна у

птичьих вирусов, но вырождена у NA вирусов человека. Данный участок сформирован тремя петлями NA (Таблица 1).

Таблица 1. А.к. последовательности NA вирусов гриппа в районе НВ-сайта (Varghese et al, 1997, с сокращениями).

жирным шрифтом выделены остатки, контактирующие с Neu5Ac,

*нейраминидазы вирусов гриппа, выделенных от птиц.

Все шесть консервативных остатков НВ-сайта найдены только у N9 NA, тем не менее, все птичьи нейраминидазы, с первой по девятую, несут фрагмент этого сайта, в состав которого входит триада серинов и триптофан.

Все контакты между аминокислотами NA и остатком Neu5Ac выявлены рентгеноструктурными исследованиями. Как видно из рисунка 6, гидроксильная группа Ser367 и амидная группа боковой цепи Asn400 образуют водородные связи с двумя кислородами карбоксильной группы Neu5Ac.

Кислород карбонильной группы основной цепи Asn400 взаимодействует с кислородом и азотом N-ацетильной группы Neu5Ac, гидроксильныи кислород Ser372 также образует связь с этим атомом азота. Для Тгр403 и метильной группы ацетила Neu5Ac обнаружено гиброфобное взаимодействие. Lys432 через є-аминогруппу связан с дистальным кислородом 0-9 глицериновой части нейраминовой кислоты, а атом 0-8 контактирует с гидроксильным кислородом Ser370.

Рисунок 6. Стереоскопическое изображение кристаллографической модели Neu5Ac (показана оранжевым) в НВ-сайте NA вируса А/крачка/Австралия/О70С/75. Зеленым показаны аминокислоты, а красным молекулы воды, взаимодействующие с Neu5Ac. Межатомные взаимодействия отмечены пунктиром. Атомы кислорода, азота и углерода показаны соответственно красным, голубым и черным (Varghese et al., 1997).

Функция НВ-сайта пока не ясна. Замечена корреляция между рецепторной специфичностью НА и наличием НВ-сайта у вирусной NA (Matrosovich et al., 2001). НВ-сайт консервативен у вирусов с Neu5Aca2-3Gal рецепторной специфичностью НА (вирусы птиц и лошадей), а у вирусов с Ыеи5Аса2-60а1-специфичностью (характерна для человеческих, свиных и нескольких H9N2 изолятов домашней птицы) этот сайт мутирован по ключевым положениям (Matrosovich et al., 2001). Обнаружено влияние а.к.

замен в этой области на активность нейраминидаз подтипа N2 (Kobasa et al., 2001).

Гликоз іширование

Изменения в гликозилировании могут влиять на транспорт и/или укладку вирусных белков, а количество и местоположение углеводных цепей - на вирулентность вируса в целом (Li et al., 1993). Так, потеря гликозилирования по остаткам 83 и 398 (нумерация по N8) нейраминидазы подтипа N8 (А/утка/Украина/1/63) приводит к неправильной укладке белковой цепи. А удаление сайта гликозилирования в положении 144 приводит к изменению профиля субстратной специфичности этой NA, в частности снижается ее активность, но увеличивается способность дискриминировать 3"SLN и 3"SL (Salto and Kawano, 1997).

Для нормального транспорта, укладки и функционирования NA важно, не только наличие определенных сайтов гликозилирования, но и структура углеводной цепи.

Все работы по кристаллизации и разрешению пространственной структуры NA проводились на вирусах, выращенных на куриных эмбрионах, поэтому все данные и выводы по составу углеводных цепей NA относятся только к этим изолятам. Структура углеводных цепей обусловлена аппаратом гликозилирования хозяйской клетки. Углеводные цепи прикреплены к остаткам Asn, находящимся на разных участках NA: 86 и 234 — «внизу», ближе к стеблю, 146 - на внешней поверхности, вблизи активного центра, 200 - сбоку, в области соединения субъединиц. При а.к. остатках Asn86 и Asn200 найдены цепи олигоманнозного типа, которые содержат два GlcNAc и пять остатков Man. Углеводные цепи в позициях Asnl46 и Asn234 относятся к N-ацетиллактозаминовому типу. Сайт гликозилирования при Asn 146 консервативен для всех изученных последовательностей. Углеводная цепь при Asn 146 уникальна: она содержит N-ацетилгалактозамин, сульфатированный по

04. В кристаллах NA углеводные цепи при Asnl46 двух тетрамеров NA образуют структуру типа barrel, сформированную восемью углеводными цепями длиной приблизительно 20 А каждая (Varghese & Colman, 1991).

Гликозилирование Asnl46, по-видимому, играет регуляторную функцию. Известно, что отсутствие гликозилирования в этом положении обусловливает нейровирулентность вируса гриппа A/WSN/33 (H1N1). Показано, что углеводная цепь при Asnl46 влияет на ферментативную активность NA, в 20 раз снижая ее по отношению к фетуину (Li et al., 1993). К сожалению, не проведено сравнения субстратной специфичности NA вируса WSN дикого типа и мутанта, в котором восстановлен сайт гликозилирования. По-видимому, углеводная цепь, находящаяся вблизи активного центра фермента, ограничивает возможность выбора субстратов. Так, известно, что увеличение степени гликозилирования другого поверхностного белка вируса гриппа, НА, обусловливает его строгую субстратную специфичность (Mochalova et al., 2003) или изменяет ее (Gambaryan et al., 1999).

Строение каталитического центра

Сайт связывания нейраминовой кислоты нейраминидазой расположен над первыми тяжами третьей и четвертой лопастей пропеллерной структуры, в большом кармане на поверхности молекулы. Активный центр находится на N-конце центральных (второго и третьего) параллельных тяжей (Colman, 1989). Он представляет собой неглубокий «кратер» диаметром 16 А, глубиной от 8 до 10 А, и располагается на расстоянии 32 А от оси симметрии четвертого порядка. Сайт фланкирован двенадцатью гибкими петлями, которые тянутся вверх и наружу от оси симметрии четвертого порядка (Bossart-Whitaker et al., 1993). Структура активного центра консервативна не только между подтипами, но и типами вирусных NA.

В таблице 2 представлены аминокислоты, участвующие в связывании Neu5Ac, и акте катализа (нумерация по N2), а на рисунке 7 — пространственная структура активного центра. Остатки, окрашенные в таблице в желтый цвет, относят к функциональным; то есть они контактируют с Neu5Ac, а все образуемые ими контакты полярны, за исключением Arg224, в котором алифатический компонент образует неполярный контакт с липофильной поверхностью боковой цепи глицеринового фрагмента Neu5Ac. Остатки, представляющие собой структурный каркас, т.е. взаимодействующие с функциональными остаткам и поддерживающие их в правильном для связывания и катализа положении, выделены в таблице 2 красным цветом (Colman et al., 1993).

Атомы азота гуанидиновых групп Arg 118, 371 и 292 образуют водородные связи с двумя карбоксильными кислородами Neu5Ac, рисунок 5. Метильная группа в Neu5Ac идеально помещается в гидрофобном кармане, образованном Пе222, Тгр178 и Arg224, а карбонильный кислород образует водородную связь с Argl52. Argil8 также является донором водорода для Glull9. Эти а.к. остатки образуют каталитический центр NA, находясь в

непосредственном контакте с Neu5Ac. Aspl51 активирует молекулу воды, участвующую в реакции десиалирования.

Таблица 2. - Аминокислотные остатки, участвующие в связывании субстрата или катализе (по Colman, 1989, и Colman et al., 1993).

* в N7 и N9 этот остаток заменен на Asn.

Туг406 лежит под кольцом Neu5Ac, и может образовывать водородные связи с Glu277 и Arg292, тем самым участвуя в стабилизации промежуточных продуктов реакции (Bossart-Whitaker et al., 1993).

Рисунок 7. Активный центр NA вируса гриппа А в комплексе с Neu5Ac2en (Taylor et al., 1999).

Для рассмотрения взаимодействия Neu5Ac и ее аналогов с районом активного центра, также важна область, непосредственно соседствующая с активным центром, а именно «карман-150» и «петля-150» (остатки с 147 по 152) у нейраминидаз двух филогенетических групп. Так, в отличие от первой, у второй ветви филогененического древа образуется карман-150, который имеет размеры 10*5*5А и, возможно, играет роль в формировании пространственной структуры активного центра и взаимодействии с субстратом (Russel et al., 2006).

Механизм реакции

Механизм реакции десиалирования сиалилолигосахаридов

нейраминидазой вируса гриппа был предложен (Janakiraman et al., 1994) на основании рентгеноструктурных данных для вируса В/Л и/40.

_{U Л}

^.»-4

Фермент

НО ОН J

о. о" ^н

о-

_Т ^но

/

фермент

фермент

фермент

фермент

Схема 1. Механизм реакции десиалирования NA (по Janakiraman et al., 1994; Watts et al., 2006, von Itztein, 2007).

Формирование оксокарбониевого иона при атоме С2 Neu5Ac является ключевым шагом в гидролизе субстрата. После попадания остатка Neu5Ac в

активный центр, из-за сильных ионных взаимодействий между карбоксилатом субстрата и гуанидиновыми группами аргининов 118, 292 и 371, Neu5Ac переходит из конформации кресла в конформацию полукресла. Это изменение индуцирует формирование напряженного оксокарбониевого иона в активном центре, что приводит к расщеплению гликозидной связи. Образовавшийся агликон уходит из активного центра фермента вместе с протонированным гликозидным кислородом. Многочисленные взаимодействия между функциональными группами интермедиата и а.к. остатками активного центра (наиболее важны Туг40б и Aspl51) стабилизируют положительно заряженный оксокарбониевый ион с сохранением планарности атома С2. При этом, конформация интермедиата очень похожа на структуру Neu5Ac2en (Bossart-Whitaker et al., 1993). Недавно было показано, что на этой стадии реакции образуется ковалентное промежуточное соединение остатка Neu5Ac (карбоксильная группа) с молекулой белка (консервативный остаток тирозина, Туг406), характерное для всех экзосиалидаз (Watts & Withers, 2004; Watts et al., 2006). Оказалось, что лимитирующей стадией ферментативного процесса является гидроксилирование оксокарбониевого иона растворителем. На следующей стадии продукт реакции в виде Neu5Ac оставляет активный центр фермента. Следует также отметить, что перед входом в активный центр сиалилолигосахарида, активный центр оказывается «готовым к акту катализа», так как никаких существенных структурных подвижек не происходит - ни при связывании нейраминовй кислоты, ни планарного переходного состояния (Neu5Ac2en) реакции (Colman & Smith, 2002).

А.к. последовательности нейраминидаз вирусов А и В сильно отличаются, но сходство их пространственных структур, наличие общих инвариантных остатков в составе активного центра, и одинаковый характер взаимодействий как с Neu5Ac, так и с Neu5Ac2en, позволяет сделать вывод о том, что механизм действия нейраминидаз вирусов гриппа А и В одинаков (Bossart-Whitaker et al., 1993).

33 Ингибиторы нейраминидаз

Данные по пространственной структуре NA вирусов гриппа были использованы для разработки принципиально нового подхода к созданию противовирусных средств. Главной идеей этого подхода является дизайн ингибитора NA на основе данных о трехмерной структуре комплекса фермента с ингибитором в нем, а именно Neu5Ac2en (Рисунок 7 и Рисунок 8). Наличие двух остатков Glu вблизи атома С4 молекулы Neu5Ac2en навело на мысль синтеза производных этого ингибитора, несущих одну или две аминогруппы вблизи атома С4. Ожидалось, что такие производные будут обладать лучшими ингибирующими свойствами за счет взаимодействия с остатками Glu. Лучшим из этого класса ингибиторов оказался 4-гуанидино-Ыеи5Ас2еп (Рисунок 8), который связывался с NA на несколько порядков лучше, чем немодифицированный Neu5Ac2en, благодаря взаимодействию с Glull9 и Glu227 активного центра NA (Woods et al., 1993). Это соединение подавляло активность нейраминидаз вирусов гриппа А и В, но не ингибировало сиалидазы млекопитающих (von Itztein et al., 1993).

Предпринимались попытки улучшить 4-гуанидино-Кеи5Ас2еп (занамивир). Однако, константы ингибирования этих производных были в десятки и сотни раз хуже, чем у занамивира (Smith et al., 2001; Chandler et al., 1995). Более продуктивным подходом к улучшению ингибирующих свойств данного вещества стало получение три- и тетрамерных производных, которые в 40 раз активнее исходного соединения, и обладают большей продолжительностью действия (в мышиной модели, Watson et al., 2004).

Успех занамивира инициировал цикл работ по дизайну новых ингибиторов NA. Основным элементом структуры нового класса ингибиторов (карбоцепные, без кислородного атома, ингибиторы) являются шести- или пятичленные циклы.

Одним из таких соединений стала (ЗК,4Рч,58)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этил(пропокси)-!-циклогексан-1 -карбоновая кислота (тамифлю), рисунок 8. Его

структура «подогнана» к координатам тех остатков активного центра, которые взаимодействуют с глицериновой цепью Neu5Ac2en (Oxford et al., 2002). Данное соединение лежит в основе разработки новых ингибиторов NA с гидрофобными группами (Hanessian et al., 2002).

Кроме того, синтезирован ингибитор NA на основе циклопентанового кольца, где сохранены все функционально важные группы молекулы занамивира (карбоксильная, ацетамидная, С4-гидроксильная и глицериновая), расположение которых вписывается в активный центр NA. Только ориентация гуанидиновой группы отличается от таковой у занамивира. Однако, это различие имеет свои преимущества: ВСХ-1812 (преамивир) сохраняет ингибирующую активность по отношению к занамивир-устойчивым вариантам вируса гриппа (Babu et al., 2000). В настоящее время ведутся разработки сиаломиметиков на основе и этого соединения (Bianco et al., 2005). Занамивир и тамифлю уже используются как лекарственные препараты, а ВСХ-1812 находится на последней стадии клинических испытаний.

НО* н

но" н

Б)

В)

со,н

ССЮН

НО,

>Н N NH

О" ^Г NH,

NHCOCH,

Г) /* Д) <

Рисунок 8. a) Neu5Ac, б) Neu5Ac2en, в) занамивир, г) тамифлю, д) ВСХ-1812 (преамивир),

где R=NHAc.

Существуют также стратегии разработки ингибиторов двойного действия, ингибирующих как рецептор-связывающую активность НА, так и рецептор-разрушающую активность NA (Guo et al., 2002).

Недавно были получены интересные данные о том, что сульфолипиды обладают потенциалом по связыванию с различными штаммами вируса гриппа, выделенными от различных хозяев, и способны ингибировать сиалидазную активность NA вируса гриппа; уровень ингибирования превышает ингибирование Neu5Ac2en минимум в 10 раз (при рН ниже 6,0). Ингибирование, скорее всего, основано на взаимодействии гистидинов боковой цепи (144, 150, 155, 164, 189, 191, 264 и 274, нумерация по N2). Эти данные открывают еще одно перспективное направление по созданию ингибиторов NA (Suzuki et al., 2003).

Последние данные по рентгеноструктурному анализу NA вирусов гриппа подтипов N1, N4 и N8 открыли еще одну большую и совсем не исследованную область для разработки новых поколений нейраминидазных ингибиторов, специально структурно подогнанных под взаимодействие с полостью-150 возле активного центра NA, относящихся к первой ветви филогенетического древа (Russel et al., 2006). Разработка данных ингибиторов будет основана на том, что NA первой филогенетической группы связывают ингибиторы как в открытой (полость-150), так и в закрытой конформации (петля-150). Предполагается, что сначала идет взаимодействие с открытой конформацией, а затем комплекс с ингибитором переходит в закрытую конформацию, что позволяет применить подход по созданию ингибиторов с дополнительными радикалами, подогнанными под структуру открытой конформации петли-150. Хотя, скорее всего ингибиторы данного класса будут либо менее эффективны, либо совсем не эффективны против нейраминидаз второй ветви, лишенных кармана-150, но в свете возможной пандемии H5N1 вирусов гриппа, такой подход также может быть продуктивным.

36 Мутации в NA, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам NA

Следует заметить, что наблюдались случаи появления резистентных вирусов. При лабораторном получении вирусов гриппа, резистентных к ингибиторам нейраминидазы, парадоксальным образом, в первую очередь мутации появляются не в NA, а в НА. А.к. замены в NA появляются не раньше, чем через пять пассажей после возникновения мутаций в НА, или не появляются вообще (Staschke et al., 1995; Gubareva et al., 1996; Gubareva et al., 1998; Smeeetal., 2001).

Все мутации в первичной структуре NA, вызываемые ее ингибиторами, целесообразно разделить на два класса: а) затрагивающие функциональные остатки активного центра, б) структурные аминокислоты (Gubareva etal., 2001). Самой частой мутацией, вызываемой ингибиторами NA, является замена Arg292Lys. Arg 292 является функционально важным компонентом каталитического центра NA. Появление Lys в положении 292 влияет на связывание с карбоксилом Neu5Ac. Замена другой а.к. на лизин в этом положении приводит к нарушению взаимодействия. Данная замена появляется при селекции in vitro занамивиром, тамифлю и преамивиром. Мутант Arg292Lys в 30000 раз менее чувствителен к ингибиторам, активность NA снижается до 2% от исходной (Tai et al., 1998; Oxford et al., 2002). Вирусы с мутацией Arg292Lys проявляют минимальную чувствительность к занамивиру и преамивиру, и высокую - к ингибиторам с гидрофобными боковыми радикалами, таким как тамифлю (McKimm-Breschkin, 2000; Gubareva etal., 2001).

При лечении занамивиром был выделен вариант вируса гриппа В с мутацией Argl52Lys в NA; Argl52 образует водородную связь с карбонилом N-ацетильной группы Neu5Ac (Gubareva et al., 1998). Новый вариант вируса проявлял устойчивость ко всем трем ингибиторам (Gubareva et al., 2001; Mishin et al., 2005a). Обе замены, Arg292Lys и Argl52Lys, произошли в тех

положениях активного центра, которые контактируют с наиболее важными группами субстрата, сохраненными при дизайне ингибиторов, поэтому и устойчивость NA проявляется по отношению ко всем ингиибторам.

Недавно было проведено исследование влияния отдельных функциональных а.к. активного центра NA на устойчивость к ингибиторам. За основу была взята а.к. последовательность нейраминидазы А/Вухан/359/95 (H3N2), в нее были внесены следующие единичные мутации: Argll8Lys, Arg371Lys, Glu227Asp, Argl52Lys, Arg224Lys, Glu276Asp и Argl51Glu. Два из полученных вирусов (Argil8Lys и Glu227Asp) очень плохо росли на культуре клеток. Вирусы с мутациями Arg224Lys, Glu276Asp и Arg371Lys оказались резистентны к тамифлю и занамивиру, в то время как вирус с мутацией Argl51Glu проявлял резистентность только к тамифлю, а вирус с мутацией Argl52Lys оказался не чувствителен к обоим ингибиторам. Анализ аминокислотных последовательностей NA вирусов гриппа показал, что появление мутации Glu276Asp наиболее вероятно под селективным давлением применения ингибиторов (Yen et al., 2006). Результаты данного исследования, возможно, помогут оптимизировать дизайн новых ингибиторов NA.

Мутация по остатку Glull9 является самой распространенной и имеет большое влияние как на активность NA (снижает ее до 5-50% от уровня вируса дикого типа), так и на устойчивость вируса к лекарствам (Gubareva et al., 1996; McKimm-Breschkin, 2000; Gubareva et al., 2001). Кислород боковой цепи Glull9 взаимодействует с водородом Argll8, поэтому замена Glu на Val нарушает взаимодействие с Argll8. А так как Argil8 входит в состав триаргининового кластера, принципиально важного для действия NA, то любое изменение его координат влияет на взаимодействие как с карбоксилом Neu5Ac, так и ее аналогов - ингибиторов NA.

Недавно был выделен новый тамифлю-устойчивый вариант вируса гриппа В/Мемфис/20/96 с заменой в одном из функциональных остатков активного центра (Aspl98Asn), но данная аминокислотная замена не оказала влияния на его чувствительность к преамивиру (Mishin et al., 2005а). Остаток

198 контактирует с Argl52 активного центра, помогая ему поддерживать необходимую позицию, этот остаток аргинина образует водородную связь с карбонилом N-ацетильной группы Neu5Ac и мутация по нему приводит к резистентности ко всем лекарствам-ингибиторам NA. Интересно, что мутация Aspl98Asn произошла в единственном не строго консервативном а.к. остатке, входящем в активный центр NA, так как Asn в этой позиции характерен для N7 и N9 нейраминидаз. Необходимо отметить также, что нейраминидазы подтипов N7 и N9 являются чувствительными к тамифлю (Govorkova et al., 2001).

До сих пор не было получено данных о возникновении в природе вариантов вируса гриппа, у которых устойчивость к ингибиторам NA появляется благодаря заменам вне структурных и функциональных участков активного центра. Тем не менее, при селекции в лабораторных условиях был выделен один такой вирус, His273Tyr. Он был получен при культивации штамма В/Ямагата/16/88 в присутствии преамивира. Данный а.к. остаток напрямую не взаимодействует с ингибитором в активном центре фермента (находится на расстоянии более 5А от него), но как было показано при помощи методов математического моделирования, вызывает отталкивание между молекулой ингибитора и фермента (Baum et al., 2003). Таким образом, существует потенциал для появления резистентных штаммов вирусов гриппа за счет мутаций, которые, скорее всего не будут приводить к изменениям в функциональной активности фермента, и такие вирусы будут обладать гораздо большим адаптационным потенциалом.

Мутации НА, возникающие под действием ингибиторов NA

Для занамивир-устойчивого варианта у вируса В/Гонконг/8/73 с мутацией в позиции 119 NA, мутация в нейраминидазе появилась после мутаций в НА (Asnl45Ser и Asnl50Ser). Данные изменения приводят к снижению рецептор-

связывающей активности, что, по-видимому, компенсирует подавленную сиалидазную активность (Staschke et al., 1995).

У вируса гриппа В, выделенного от ребенка, получавшего занамивир (единственный описанный случай), сначала появилась замена в НА (Thrl98Ile). Она вызывает исчезновение сайта гликозилирования при Asnl96, вблизи рецептор-связывающего центра, и приводит к смене рецептор-связывающеи специфичности НА от Neu5Aca2-6- к №иАса2-3-фенотипу (Gubareva et al., 1998).

Попытки получить NA-мутировавший вирус А/Шандонг/09/93 (H3N2) под действием преамивира не привели к успеху (Smee et al., 2001).

Проводились исследования по влиянию одновременных мутаций в NA и НА на репликативные характеристики вируса в различных системах, как in vitro, так и in vivo. Из рекомбинантного вируса NWS/G70 (H1N9) был получен занамивир-устойчивый вариант G70C4-G, который приобрел мутацию в активном центре NA (Glull9Gly) и в рецептор-связывающем. сайте НА (Serl86Phe). Интересно, что замена остатка Serl86 появляется после первого же пассажа родительского вируса в присутствии занамивира. При последующих пассажах обнаружено два переходных варианта, которые несли вторую мутацию в НА (Serl65Asn или Lys222Thr). Оба варианта, имеющие дополнительно к единичной мутации в NA еще по две аминокислотные замены в НА, были устойчивы к занамивиру и даже нуждались в присутствии ингибитора для успешного роста in vitro. Дальнейшие исследования, проведенные с помощью реассортации генов, показали, что каждая из мутаций NA или НА в отдельности обусловливает низкий уровень резистентности. Комбинация мутаций в обоих белках или присутствие двух мутаций только в НА приводят к увеличению устойчивости вируса к ингибиторам NA (Blick et al., 1998). Известно, что а.к. замены в позиции 186 НА кардинально меняют спектр узнаваемых им рецепторов (Gambaryan et al., 1997), а появление Thr в позиции 222 может способствовать взаимодействию НА с 2-6-сиалиллактозой (Eisen et al., 1997). Замена Serl65Asn создает дополнительный сайт

гликозилирования в НА, который может влиять на рецептор-связывающую активность вируса.

Недавно было показано, что удаление сайтов гликозилирования НА также помогает вирусу обойти действие ингибиторов NA активности, причем этот эффект наиболее сильно выражается при удалении сайта гликозилирования по Asnl63 (Mishin et al., 2005b).

Рецепторная специфичность мутантных по НА вирусов, к сожалению, осталась не исследованной, то же можно сказать и о нейраминидазной активности реассортантов и субстратной специфичности NA. Вот почему трудно понять роль мутаций в НА и NA, возникающих под действием ингибиторов NA. Практически во всех работах, связанных с изучением возникновения резистентности к препаратам, ингибирующим сиалидазную активность, показано, что чувствительность к ингибиторам неираминидазы определяется генными сегментами 4 и 6, которые кодируют НА и NA (Staschke et al, 1995; Gubareva et al., 1996; Baigent et al., 1999; McKimm-Breschkin, 2000). Но, как при этом изменяется их функциональная активность, остается непонятным. Данные этих работ еще раз подчеркивают важность исследования вируса целиком, при проведении тестирования лекарственных средств. Общая тенденция к появлению мутаций в НА быстрее, чем в NA, указывает на перспективность разработки лекарств, действующих одновременно на НА и NA.

Современная ситуация с возникновением резистентных штаммов вируса гриппа

До недавнего времени считалось, что активное неконтролируемое применение озеламивира (тамифлю) и занамивира (реленза), не повлияет значимо на ситуацию с появлением резистентных штаммов вируса гриппа. То есть, даже при появлении резистентности, устойчивые вирусы не смогут эффективно реплицироваться в отсутствие ингибитора (Blick et al., 1998). В

клинических исследованиях резистентные вирусы составляли менее одного процента, доля их среди сезонных вирусов гриппа по всему миру была того же порядка.

Но в январе 2008 года данная ситуация резко изменилась: некоторые из вирусов гриппа подтипа H1N1 приобрели устойчивость к тамифлю за счет мутации His274Tyr в NA (Lackenby et al., 2008); характерно, что все мутировавшие вирусы сохраняли чувствительность к занамивиру. Мутация His274Tyr ранее обнаруживалась в исследованиях устойчивости in vitro и in vivo, а также у клинических изолятов вирусов гриппа (Hui-Ling Yen et al., 2007). Устойчивость His274Tyr мутантов к тамифлю в некоторых странах, например, в Норвегии, достигала 70%, и проявилась во всех странах мира одновременно, в течение одного сезона (Рисунок 9).

Европа

Америка

_{- I}

Всего

Африка Арабские Юго-восточная Страны

страны Азия Тихоокеанского

региона

Рисунок 9. Уровни устойчивости к тамифлю в различных странах Европы (по данным ВОЗ).

При лечении тамифлю и раньше иногда выделялись вирусные изоляты с мутациями в структурных а.к. остатках NA: His274Tyr и Glull9Val (Oxford et al., 2002). Было показано, что вирусы с мутацией His274Tyr резистентны к тамифлю, но не теряют чувствительности к другим ингибиторам (Gubareva et al., 2001). His 274 стабилизирует активный центр, взаимодействуя с Glu 276, поэтому замена His на незаряженный Туг может изменять позицию Glu 276. А так как дизайн тамифлю был основан на подгонке к координатам His274, то резистентность именно к тамифлю полученного мутанта не удивительна.

На рисунке 10 представлено изменение сайта связывания тамифлю при замене His274Tyr; как следует из рисунка, данная замена приводит к резкому изменению пространственной ориентации остатка Glu276, который занимает в каталитическом центре положение, близкое к пентилокси-группе молекулы лекарства, тем самым препятствуя ее докингу в активный центр (Collins et al., 2008). Тем не менее, подобная структурная перестройка в районе активного центра NA не оказывает влияния на поведение вируса в целом, то есть, резистентные вирусы не отличаются от вирусов дикого типа по вызываемой клинической картине заболевания, эффективности репликации и патогенности вируса (Hui-Ling Yen et al., 2007; Collins et al., 2008). Единственным отличием резистентного вируса от вируса дикого типа является двукратное увеличение Км, без изменения значения V_max (нужно отметить, что эти данные получены с помощью гидролиза MU-NANA) (Rameix-Welti et al, 2008).

Рисунок 10. Сайт связывания тамифлю вблизи а.к. остатка 274. Вариант с His показан желтым цветом, а Туг - зеленым (Collins et al., 2008).

Определение активности и специфичности нейраминидазы вируса гриппа

Под ферментативной активностью NA понимают ее взаимодействие с субстратом, в ходе которого отщепляется остаток Neu5Ac. Как правило, для количественного измерения активности используют Т -(4-метилумбеллиферил)-a-D-N-ацетилнейраминовую кислоту (MU-Neu5Ac или MU-NANA, рисунок 11), а также олигосахариды или гликопротеины.

Под субстратной специфичностью NA понимается способность фермента различать в структуре субстрата как разные варианты нейраминовой кислоты (Neu5Ac, Neu5Gc и другие), так и внутренних моносахаридных остатков олигосахаридной цепи. Все методы исследования специфичности NA основаны на количественное определение отщепленной нейраминовой кислоты.

Мы рассмотрим отдельно методы определения активности и субстратной специфичности нейраминидаз, хотя некоторые из них могут использоваться в обеих целях.

Определение активности

Хромогеппые субстраты

Гидролиз неокрашенного хорошо растворимого в воде гликозида нейраминовой кислоты приводит к нерастворимому окрашенному продукту, который, собственно, и детектируется - качественно, полуколичественно или количественно. Хромогенные субстраты, в основном, применяются при детекции сиалидаз на хроматографических пластинках и стрипах, а также в электрофоретических гелях. Наиболее удобны методы, позволяющие добиваться интенсивной окраски в одну стадию, например при использовании 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-а-№и5Ас (Рисунок 116). Реакция десиалирования приводит к образованию соединения, которое быстро и необратимо окисляется кислородом воздуха с образованием синего красителя (Eschenfelder & Brossmer, 1987).

Ряд похожих производных Neu5Ac, но дающих при гидролизе растворимый продукт, используется для колориметрического определения активности сиалидаз, к ним относятся фенил-, 3-метоксифенил- и р-нитрофенил-гликозиды Neu5Ac. Растворимый продукт реакции десиалирования, то есть фенол или замещенный фенол определяют реагентом Фолина-Чокальтеу или спектрофотометрически (Potier et al., 1979). Недостатком большинства этих методов является низкая чувствительность.

Флуоресцентные методы

Для определения активности NA вируса гриппа чаще других используют MU-Neu5Ac (более известный как MU-NANA). Этот подход был впервые предложен (Potier et al., 1979) как альтернатива колориметрическим и радиоактивным методам определения Neu5Ac. При отщеплении Neu5Ac образуется флуоресцирующее соединение метилумбеллиферон, MU (Hughes et al., 2001). Большим преимуществом этого метода является одностадийность процесса, а недостатком - высокий уровень фона. Ближайшим аналогом MU-Neu5Ac является 4-трифторметилумбеллиферил-а-№и5Ас (CF₃-MU-NANA). Оптимум флуоресценции CF₃-MUNANA наблюдается при нейтральных значениях рН, интенсивность флуоресценции в 10 раз выше, чем у MU-Neu5Ас (Engstler et al., 1997) (Рисунок 11).

A)

Б)

о

ч^\

6н о»

он vb¹ cAo

В)

Н₃С NH

но но^ X /он

Г)

Н,С NH _ 9

// ,Л~.г, р

ОН СН₃

і но

О "О

но.. X /он

Д)

Н,СГ НН

но / он

O^ONa

Рисунок 11. Структура a) Neu5Ac; б) 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-а-0-Кеи5Ас; в) MU-NANA; г) CF₃-MU-NANA; д) NA-Star.

Хемилюминесцентный метод

Принцип этого метода аналогичен предыдущим, но образующийся продукт сиалидазной реакции способен к хемолюминесценции. Чувствительность этого варианта на два порядка выше по сравнению с MU-NANA-тестом (Buxton et al., 2000), что дает возможность изучать вирусы с низкоактивной NA; в качестве субстрата используется соединение, получившее торговое название NA-Star (Рисунок 11). Недостатком этого метода является быстрый распад отщепленного от Neu5Ac люминесцирующего вещества (ті/2=5 мин) (Buxton et al, 2000).

Методы, основанные на детекции NeuSAc

При определении активности NA с помощью высокомолекулярных субстратов, таких как фетуин и о^-кислый гликопротеин, чаще всего определяют количество отщепившейся нейраминовой кислоты. Эти методы, как правило, сложнее в исполнении и обладают меньшей чувствительностью, чем флуориметрические. Neu5Ac определяют с помощью периодат-резорцинового или тиобарбитуратного методов. Главным недостатком первого из них является необходимость предварительного разделения субстрат-связанной и свободной Neu5Ac, что неизбежно ведет к потере вещества, и, как следствие - к уменьшению чувствительности (Jourdian et al., 1971). Тиобарбитуратный метод (Warren, 1959) лишен этого недостатка, однако его чувствительность составляет 10" моль в пробе, из-за чего требуется большое количество вируса и, поэтому, исключена возможность изучения вирусов с низкоактивной NA.

Лектиновый метод

В работе (Lambre et al., 1990) для определения активности NA использовали лектин, способный связываться с десиалированной углеводной цепью высокомолекулярного субстрата, (см. таюке раздел «субстратная специфичность», параграф «лектиновый метод»).

Изучение субстратной специфичности

Ядерный магнитный резонанс

Для определения субстратной специфичности NA вирусов гриппа использовали ЯМР. Метод основан на определении разницы резонансных характеристик аі-кислого гликопротеина (содержит как Neu5Acoc2-6Gal, так и Neu5Acoc2-3Gal-TepMHHHpoBaHHbie углеводные цепи), обработанного и не обработанного нейраминидазой (Paulson et al., 1982). Главный его недостаток -использование больших объемов вирусного материала для проведения реакции.

Радиоактивный метод

С помощью специфичных по типу связи (а2-3/а2-6) сиалилтрансфераз десиалированный ai-кислый гликопротеин ресиалируют меченой [С¹⁴] Neu5Ac, и таким образом, получают гликопротеин, содержащий исключительно а2-3-или исключительно сс2-6-сиалированные цепи. Для определения специфичности NA параллельно используют оба эти варианта. Образовавшуюся в результате ферментативного процесса [С¹⁴] Neu5Ac отделяют от субстрата на хроматографической колонке (0,7 х 13 см Sephadex G-50) и измеряют ее радиоактивность (Baum & Paulson, 1991).

Лектииовый метод

Субстратная специфичность NA вируса гриппа может быть определена с помощью индивидуальных сиалилгликоконъюгатов, где олигосахариды ковалентно связаны с полимерным носителем, например, полиакриламидом (РАА). После инкубации вирусов гриппа с адсорбированными на твердой фазе конъюгатами (3'SL-PAA, 6'SL-PAA или 6'SLN-PAA) сиалидазную активность, определяют с помощью лектина, узнающего терминальные остатки Р-галактозы, которые были маскированы нейраминовой кислотой (Katinger et al., 2004). Среди недостатков этого метода отметим риск фонового взаимодействия с галактозными остатками самого вируса.

Колориметрический метод

Обычно в качестве субстратов используется пара свободных трисахаридов, 6'SL и 3'SL, а количество свободной нейраминовой кислоты определяют тиобарбитуратным методом (Couceiro & Baum 1994; Kobasa et al., 1999). Сравнение гидролитической активности вируса по отношению к этим субстратам позволяет судить о предпочительности гидролиза а2-3- или а2-6-сиалированных субстратов. Этот метод в настоящее время является наиболее

распространенным при определении субстратной специфичности вирусных NA. Его главное ограничение - использование всего лишь двух субстратов, в то время как типичные гликаны - рецепторы вирусов гриппа млекопитающих и птиц, значительно разнообразнее по структуре, а именно, включают фукозилированные, сульфатированные, с коровым Gaipi-3GlcNAc (вместо 1-4) фрагментом и т.д.

Другие методы

В литературе можно найти ряд вариантов уже рассмотренных выше методов, которыми определяют субстратную специфичность NA вирусов гриппа, но все они носят частный характер. Например, в методе (Baigent et al., 1999) измеряется NADH, который образуется в результатте цепи нескольких сопряженных ферментативных реакций.

Известные литературные данные об олигосахаридной специфичности NA

вирусов гриппа

Наибольшее внимание при исследовании субстратной специфичности уделяется N2 и N1 NA, так как только эти две NA циркулировали в человеческой популяции в XX веке.

Первые работы по определению субстратной специфичности NA вирусов гриппа проведены в начале 90-х годов. В одной из них (Baum & Paulson, 1991) показано, что специфичность N2 вируса человека постепенно изменилась от 3'SL (штаммы H2N2 1957 года) к двойственной, то есть, 3'SL/6'SL специфичности (штаммы между 1972 и 1987 годами). Специфичность к 6'SL появляется в изолятах 1967 года, увеличение активности к этому субстрату наблюдается у вирусов с 1972 года. В цитируемой работе, в отличие от следующих, в качестве субстратов использованы пересиалированные (сиалилтрансферазами) высокомолекулярные субстраты (си-кислый

гликопротеин в концентрации 5 мг/мл, или аналогично пересиалированные эритроциты). Использование таких высоких концентраций субстратов вызвано низкой чувствительностью колориметрической детекции продукта реакции, Neu5Ac; очевидно, что к этим данным нужно относиться с осторожностью, так как из-за сверхвысокой концентрации субстрата фермент действует в области, далекой от условий Михаэлиса-Ментен.

Для штаммов N1 А/СССР/90/77 (H1N1) (Rudneva et al., 1993) и (А/Англия/333/60/85 (H1N1), А/Чили/1/83 (H1N1)) (Couceiro & Baum 1994) была показана двойственная субстратная специфичность. Отношение 6'SL/3'SL активностей нейраминидаз этих вирусов таково: для А/СССР/90/77 — 0.75, для А/Англия/333/60/85 - 1.17 и для А/Чили/1/83 - 0.83. Таким образом, активности этих NA по отношению к 3^SL и 6"SL сравнимы. Следует подчеркнуть, что в этих экспериментах использовалась одна, очень высокая концентрация субстратов, а именно 1 мМ.

В одной из последних работ по изучению субстратной специфичности NA вирусов гриппа также использована только одна, но меньшая (100 мкМ) концентрация субстратов 6'SL и 3'SL. Все N2 вирусы, исследованные в работе (Kobasa et al., 1999) имеют высокую активность по отношению к 3'SL, тогда как по отношению к 6'SL (по сравнению с активностью по 3'SL) она варьирует от предельно низкой (у птичьих и ранних человеческих вирусов), до высокой (у свиных вирусов и современных человеческих изолятов). Показано, что активность NA по отношению к 6'SL зависит от вида хозяина, а среди вирусов человека - и от года изоляции.

В уже процитированной работе (Katinger et al., 2004), основанной на детекции продуктов ферментативной реакции с помощью Gal-специфичного лектина, были использованы гликоконъюгаты 3'SL-PAA, 6"SL-PAA и 6'SLN-РАА. Исследовалось влияние хозяйской клетки на субстратную специфичность нейраминидаз современных человеческих вирусов подтипов H1N1 и H3N2; показано, что большая часть вирусов, выращенных на куриных эмбрионах и клетках MDCK, предпочтительно расщепляет 3'SL, а VERO-изоляты тех же

вирусов предпочтительно гидролизуют 6'SLN. Полученные результаты указывают, что на структуру и, следовательно, на субстратную специфичность NA влияет природа хозяйской клетки, используемой для выращивания вируса.

Полученные в описанных работах результаты можно интерпретировать так, что NA человеческих вирусов приобрели способность узнавать тот тип связи, который узнается гемагглютинином этих вирусов. По-видимому, это свойство способствует лучшему освобождению новых вирионов с клеточной поверхности и предотвращает их агрегацию. Однако, сопоставить данные разных авторов не представляется возможным, так как работы выполнены не только на различных вирусах, но и с различными субстратами, или кардинально разными концентрациями. Так, если в работе (Kobasa et al., 1999) показано, что максимальная активность NA по 6'SL составляет лишь 30% от активности по отношению к 3'SL, то в работе (Baum & Paulson, 1991)>, она равна или всего лишь на 10-15% выше активности по отношению к 3'SL. Следует также отметить тот факт, что еще ни разу при определении специфичности вируса гриппа исследователи не использовали одновременно как низко-, так и высокомолекулярный субстраты известной структуры, а также не исследовали кинетические параметры реакции десиалирования.

Измерение удельной активности нейраминидаз вирусов гриппа не только может предоставить информацию об уровне активности данного фермента для вирусов, выделенных от различных хозяев, что важно для исследования возможности перехода вирусами межвидового барьера, оно приобретает особую важность для мониторинга резистентных к ингибиторам NA штаммов. Единственная работа по исследованию удельной активности нейраминидаз вирусов гриппа выполнена (Kobasa et al., 2001), в которой был использован метод, основанный на гидролизе свободного олигосахарида З'ЗЬ. Было выявлено шесть а.к. замен в последовательностях N2 нейраминидаз вирусов, гриппа человека, между вирусом А/Сингапур/1/57, H2N2, который эффективно (уровне птичьих вирусов) реплицируется в кишечнике орально инокулированных уток, и вирусом А/Англия/12/62, H2N2, который не

поддерживает рост вируса в утках, и NA активность которого находится на уровне 5% от уровня активности NA птичьих вирусов.

Эти а.к. остатки, влияющие на удельную активность NA, расположены в позициях 367, 370, 400, 431, 331, и 339, причем остатки 367, 370, 400 и 431 находятся рядом с активным центром и формируют НВ-сайт NA утиных вирусов. Вводя сайт-направленным мутагенезом единичные а.к. замены в NA вируса А/Англия/12/62, авторы показали, что замены в позициях 370 и 431 вызывают рост активности, в позиции 367 — ее снижение, а в позиции 400 не вызывают заметного изменения в активности. Остатки 331 и 339 необходимы для высокой удельной активности NA, рисунок 12.

A)

Б)

о -

F и

в*

S &>

s a

о С о

X -=

ч 1) н s о о

X

5 г о а о аг

«TОІ— -2V

_II

Рисунок 12. Вклад индивидуальных а.к. остатков в удельную активность NA. A. A-R мутанты вируса гриппа А/Англия/12/62 (Анг/62), в которых а.к. в положениях, отмеченных (X) заменены соответствующими им а.к. NA вируса А/Сингапур/1/57 (Синг/57). Б. Соответствующие удельные активности мутантов (A-R) по отношению к 3'SL в концентрации 0,1 мМ. По оси абсцисс: тип мутанта по оси ординат: относительная специфическая активность NA (Kobasa et al., 2001).

Корреляция активностей гемагглютинина и нейраминидазы

Многочисленные исследования показали, что для эффективной вирусной репликации необходимо оптимальное соотношение рецептор-связывающей и рецептор-разрушающей активностей поверхностных гликопротеинов вирусов гриппа. Существующий баланс между НА и NA конкретного вируса может быть нарушен различными событиями, такими как реассортация, передача вируса новому хозяину, или лабораторная блокировка функциональной активности одного из этих белков. Наблюдающееся после этого снижение репликативного потенциала может быть преодолено путем компенсаторных мутаций одного или обоих белков (Wagner et al., 2002).

Восстановление функционального баланса вреассортантных вариантах

Характерной чертой вирусов гриппа является возможность реассортировать при попадании разных вирусов в одну клетку, т.е. обмениваться геномными сегментами. Теоретически такая реассортация может привести к возникновению огромного разнообразия всевозможных комбинаций НА и NA.

При получении реассортантных вариантов, содержащих, НА вирусов гриппа, изолированных от птиц и NA и другие гены от вирусов, изолированных от человека (Rudneva et al., 1993), наблюдается снижение репликативной активности реассортантов и приобретением агрегирующего фенотипа. Это указывает на нарушение функционального баланса HA-NA в полученных вирусах. Следствием восстановления функционального баланса HA-NA является повышение репликативно активности и приобретение вирусом неагрегирующего фенотипа (Rudneva et al., 1996), обычно реассортанты отличаются "скоростью приобретения" нового фенотипа, это видно из того, что некоторые сочетания НА и NA быстрее подстраиваются друг к другу (Ilyushina

et al., 2005). В большей части случаев восстановление баланса обеспечивается изменениями в НА (Руднева и др., 2003).

Баланс активностей НА и NA быть нарушен не только при реассортации, но и при смене организма хозяина. Так, функционально сбалансированные эпидемические штаммы подтипа H3N2, например сезона 2003-2004 г.г. хорошо реплицируются на клетках, но не в куриных эмбрионах. Для приобретения этими вирусами функионального баланса в новой репликационной системе оказались необходимыми либо две мутации в НА (пара Glyl86Val и Val 22611е или пара Hisl83Leu и Val226Ala) или две мутации в NA (Glull9Gln и Glnl36Lys). Заметим, что в данном случае мутации в НА приводят к увеличению его афинности к рецепторам, а мутации в нейраминидазе, наоборот, снижают ее активность (Lu et al., 2005).

Частным случаем исследования последствий реассортации" является изучение адаптации вируса гриппа А к росту в клетках, экспрессирующих низкий уровень сиаловой кислоты, которые имитируют ситуацию попадения вируса в нового хозяина (Hughes et al., 2001). В данной работе было показано, что вирус гриппа А/Тотори/872/94 (H3N2) может адаптироваться к росту в клетках с сильно сниженной экспрессией сиаловых рецепторов за счет большой делеции в гене NA (размер получаемой белковой молекулы составляет 66 или 39 а.к. остатков N-конца NA), полностью удаляющей каталитическую активность NA. При этом НА остается совершенно не затронутым. По-видимому, в отсутствие определенного уровня рецепторов, вирусу нет необходимости снижать аффинность НА к ним. Наоборот, высоко-аффинное связывание НА сохраняется, чтобы вирус мог размножаться в таких клетках.

Восстановление функционального баланса при дефектах вируса гриппа

К дефектам вируса гриппа, возникающим из-за изменений в NA можно отнести изменение длины стебля, а также полное удаление данного белка.

Изучение мутантных вирусов с различной длиной стебля NA показало, что длина стебля коррелирует с репликативной активностью вируса: чем длиннее стебель, тем лучше репликация (Castrucci & Kawaoka, 1993). Адаптация мутантного вируса, содержащего лишенную стебельного домена NA (делетировано 24 аминокислоты) (Mitnaul et al., 2000) может достигаться либо появлением замен в НА, либо удлинением стебля NA за счет негомологичной РНК-РНК рекомбинации, обусловленной «прыжком» полимеразы с одной матрицы на другую. «Донорами» для вставки были сегменты генов РВ1, РВ2 (их продукты входят в состав полимеразного комплекса) и NP (его продукт формирует нуклеокапсид).

В ряде работ (Wagner et al., 2000; Baigent & McCauley, 2001) было показано, что восстановление функционального баланса NA с укороченным стеблем может достигаться за счет исчезновения сайтов гликозилирования в районе рецептор-связывающего участка гемагглютинина.

В работе (Hughes et al., 2000) была показана возможность существования
вируса, полностью лишенного нейраминидазной активности,

реплицировавшегося на культурах клеток, куриных эмбрионах и в мышиной модели. Молекулярными основами такой экстремальной адаптации является возникновение множественных мутаций в НА, которые приводят к изменению рецептор-связывающих свойств.

Другая группа исследователей (Gubareva et al., 2002), культивируя вирус гриппа А/Карлотсвиль/31/95 (H1N1) в присутствии ингибитора NA активности преамивира (Рисунок 8 д)) получила ряд мутантов, в которых ген NA кодирует только первые 95 а.к. Эти мутанты эффективно размножаются в отсутствие экзогенной нейраминидазы, причем в их геномах не обнаружено компенсаторных замен в НА. Авторы считают, что отсутствие

нейраминидазнои активности приводит к увеличению сиалированности НА, что обусловливает снижение рецептор-связывающей активности. (Inkster et al., 1993).

В рассмотренных работах представлены крайние варианты "повреждений", а именно полное отсутствие одной из функций. Тем не менее, все рассмотренные данные свидетельствуют о том, что вирус гриппа может приспособиться практически к любому нарушению функционального баланса между NA и НА. Подвергаясь генетическим изменениям (единичные а.к. замены, вставки, делеции) вирус гриппа адаптируется к новым условиям, восстанавливая соответствие сиалосвязывающей и сиалоразрушающей активностей.

57 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы и материалы

В данной работе использовали следующие реагенты и материалы. Sigma: СаСЬ, MU-NANA, 4-MU, NaAsC>2, метанол, персульфат аммония, аммиак, AgN0₃, этанол, формальдегид, A1₂(S0₄)3, ДСН, NaCl, NaOH, NaN₃. Merck: глицин, сахароза, глутаровый альдегид, тиобарбитуровая кислота, кумасси бриллиантовый голубой R-250, бычий сывороточный альбумин (БСА). Fluka: агароза, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). BioRad: бис-акриламид, Gerbu -акриламид. Helicon: Na₂C03, H2SO4, Na₂S04, уксусная кислота, фосфорная кислота, бромфеноловый синий. Serva: Трис-NaCl Amersham: DEAE-Sepharose FF. Tosoh (Япония): DEAE-Toyopearl 650M и 650S. Invitrogen: First Strand Buffer, DTT, транскриптаза Super Skript II RT. Смесь Taq и PFU полимераз. 10-мкл наконечники с фильтром для автоматических пипеток (Рогех, Кат.№ F108-96R-10) и 20 мкл наконечники с фильтром (Omnitip Кат№ HT-F96S-020), одиночные и 8-стриповые 0,2-мл пробирки с крышками (Рогех, Кат.№ 43 0-0IX-NBZ-Q и 435, соответственно), черные полистирольные 96-луночные планшеты для флуориметрии (Nunc, Кат.№ 437111), 96-луночные DEAE-планшеты (Millipore, MultiScreen Кат.№ MADEN0B10).

BODIPY-меченые олигосахариды были синтезированы Корчагиной ЕЛО. в лаборатории углеводов ИБХ РАН.

Буферные растворы

В данной работе были использованы следующие буферные растворы:

1. Вирусные препараты хранились в 0,02 М Трис-HCl, рН 7,2, с ОДМ NaCl (TN буфер);

2. Для определения активности и субстратной специфичности пейраминидаз флуоресцентным методом использовали 0,1 М Na-ацетатный буфер, рН 5,0, с 10 мМ СаС1₂ (далее NC буфер);

3) В колориметрическом методе определения специфичности нейраминидаз
использовали следующие растворы:

1. 0,2 М раствор NaI0₄ в 9 М фосфорной кислоте

2. 10% NaAs0₂ в 0,1 N H₂S0₄ с 0,5 М Na₂S0₄

3. 0,6% раствор тиобарбитуровой кислоты в 0,5 М Na₂S0₄

4) В флуоресцентном методе определения активности NA использовали
следующие растворы:

4. Глициновый стоп-буфер: 20 г/л глицина, 7 г/л NaCl и 8,8 г/л Na₂C03 с 25% этанола, рН 10,7.

5. 10 мМ раствор 2^,-(4-метилумбеллиферил)-а-0-ацетилнейраминовой кислоты (MU-NANA) в воде

6. Для построения калибровочной кривой был использован 1 мМ раствор 4-метилумбеллиферола в глициновом стоп-буфере

5) Для проведения электрофореза использовали следующие буферные системы:

7. 200 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 4% ДСН, 0,01% бромфенолового синего (далее 3-кратный буфер для нанесения образцов);

8. 0,128 М буфер Трис-HCl, рН 6,8 (буфер №1);

9. 0,25 М буфер Трис-HCl, рН 8,8 (буфер №2);

10. 0,025 М Трис, 0,25 М глицин рН 8,3, 0,1% ДСН (буфер №3)

6) Водный раствор 0,25 г кумасси бриллиантового голубого R-250 с 45% (об/об)
метанола и 10% уксусной кислоты (далее «раствор красителя»).

7) Для окраски электрофоретических гелей кумасси бриллиантовым голубым в
модификации Kang (Kang et al., 2002) с коллегами использовались следующие
растворы:

11. Фиксирующий раствор 30% этанола (об/об) с 2% фосфорной кислоты (масс/об.)

12. Раствор 0,08% (масс/об.) кумасси бриллиантового голубого G-250 в 2% растворе фосфорной кислоты (масс/об.) с 8% (масс/об.) сульфата алюминия и 20% метанолом.

8) Для окраски гелей аммиачным комплексом серебра

13. 40% этанола и 10% уксусной кислоты в воде (раствор №1);

14. 5% этанола и 5% уксусной кислоты в воде (раствор №2);

15. глутаровый альдегид (25%): вода, 1:5 (раствор №3);

16. 0, IN NaOH с 0,7 мл NKUOH (конц) (раствор №4)

17. 0,019% (об/об) формальдегида и 0,005% (об/об) лимонной кислоты в воде (раствор №5).

Использованные штаммы вирусов гиппа

MDCK-вариант вируса гриппа А/Гонконг/1143/99 (Гк/1143/99) (H3N2)
был получен из Института прикладной микробиологии, Вена, Австрия (Institute
of Applied Microbiology in Vienna, Austria). Вирусы А/свинья/Гонконг/9/98
(H9N2); реассортанты R8/Dk-RAi (H3N2); R2 (H3N1); RCB1 (H4N1) и
соответствующие адаптанты R8/Dk-RAiXII (H3N2); R2-XXI (H3N1) и RCB-XXI
(H4N1) предоставлены Н.В.Кавериным, Институт вирусологии им.
Д.И.Ивановского РАМН. Реассортант Х31 (H3N2) (А/Аичи/2/68 (H3N2) и
/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)); Вирусы А/Гонконг/1073/97 (H9N2);
А/утка/Приморье/3/82 (H9N2); А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1);

А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); реассортант Vn-Лен получены из лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Генно-инженерно полученные вирусы H5N1 подтипа на основе (А/Вьетнам/1204/04 (VN) и А/Гонконг/213/03 (НК)), несущие М белок вирусов-

доноров НА и NA (А5:3) или М-белок вируса - донора остальных белков
(А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)) VN/1204 А5:3, VN/1204 А5:2, и НК/213 А5:3,
НК/213 А5:2 были предоставлены компанией Greenhills Biotechnology (Вена,
Австрия), данные вирусы были получены при культивировании на линии
клеток Vero. Все остальные вирусы выращены в аллантоисной полости 10-
дневных куриных эмбрионов. Вирусы H1N1 подтипа А/Массачусетс/06/2006
(дт); А/Массачусетс/05/2007 (H274Y); А/Гаваи/31/2007 (дт); А/Гаваи/21/2007
(H274Y); А/Нью-Джерси /115/2007 (H274Y); А/Техас/Зб/91 (дт); А/Техас/36/91
(H274Y) и А/Калифорния/27/2007 (дт) и А/цыпленок/Нью-Джерси/12220/97
(H9N2), реассортант VNH5N1-Pr8/CDC-RG (А/Вьетнам/1204/04 (H5N1) и
А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)), А/индюк/Миннесота/3 83 91-6/1995,

А/индюк/Висконсин/01/1996 и А/гусь/Миннесота/80 были предоставлены А.И. Климовым из коллекции Центра контроля заболеваний (Centers for Disease Control and Prevention, Атланта, США). Вирусы А/Мемфис/14/96 (H1N1), А/Сингапур/57 (H2N2) и А/Гонконг/68 (H3N2) были предоставлены М.Н.Матросовичем, Институт вирусологии центра биомедицинских исследований университета Марбурга (Philipps-Universitat, Marburg):

Очистка вирусов

Вирус-содержащую культуральную жидкость инкубировали в 0,5 М растворе NaCl в течение 30 мин при комнатной температуре и осветляли центрифугированием (10000 об/мин 10 мин при 4С). Супернатант наслаивали на поверхность 30% сахарозы в TN буфере (5 мл), и центрифугировали при 4С 1,5 ч на скорости 24000 об/мин (Beckman L-50, ротор SW-27). Образовавшуюся вирусную «бляшку» ресуспендировали в TN буфере, суспензию осветляли центрифугированием (8000 об/мин 8 мин при 4С) и хранили при 4С в буфере, содержащем 0,01% NaN3.

Определение титра гемагглютинации

Реакцию гемагглютинации (РГА) проводили в круглодонных иммунологических планшетах (Со star) с 0,5% суспензией человеческих эритроцитов (группа О, Rh") при 4С в присутствии ингибитора нейраминидазы (4-гуанидино-№и5Ас2еп, 7мкМ) (Katinger et al., 2004). Титр вируса в РГА рассчитывали как наибольшее разведение вируса, при котором еще наблюдается агглютинация.

Определение активности нейраминидаз с помощью OS-BODIPY

К 4 мкл NC буфера, содержащего 0,7 нмоль 3'SL-BODIPY, добавляли 3 мкл вирусной суспензии, пробирки плотно закрывали, встряхивали в течение 30 минут при 37С, затем прогревали в течение 10 мин при 70С. Реакционные смеси разбавляли 63 мкл дистиллированной воды и полученный раствор (разведенная реакционная смесь, далее «РРС») анализировали одним из описанных ниже методов. Контрольная реакционная смесь, содержащая 3 мкл TN буфера вместо вирусной суспензии, анализировалась аналогично. 1. Микрокатриджный вариант

Использовали наконечники с фильтром (Omnitip Кат№ HT-F96S-020). Их разрезали так, чтобы осталась только 1/2 фильтра с верхней частью носика, и наполняли 100 мкл воды. Далее добавляли 40 мкл DEAE-Toyopearl (в ацетатной форме), уравновешенного водой, и продавливали через него воду, используя 200-мкл самплер. На влажную поверхность Toyopearl наносили 20-мкл аликвоту РРС и продавливали жидкость в лунку 96-луночного черного планшета (Nunc, Кат.№ 437111) (схема 2).

+ 40 мкл

DEAE-

Toyoepearl

Лунка 96-луночного планшета

Схема 2. Подготовка и использование микрокартриджа.

Таким же образом микрокартридж промывали 450 мкл воды (в три порции). Весь водный элюат собирали в три лунки 96-луночного планшета. Затем микрокартридж промывали 450 мкл 0,5М Na-ацетатного буфера (рН 5,0), собирая элюат в следующие три лунки. Флуоресценцию в лунках измеряли на флуориметре Victor (Wallac, Perkin Elmer) при 480/520 нм. 2. Использование 96-луночных планшетов

Для этого варианта разделения использовали 96-луночные планшеты с DEAE-фильтром (MultiScreen № MADEN0B10). Планшеты предварительно готовили к анализу следующим образом. В каждую лунку вносили 100 мкл 0,5 М Na- ацетатного буфера (рН 5,0) и оставляли на ночь. Буфер удаляли центрифугированием: планшет MultiScreen ставился поверх обычного 96-луночной планшета, который использовался в качестве коллектора, между ними помещалась специальная прокладка (она рекомендуется к использованию фирмой Millipore для плотного прилегания планшета MultiScreen к коллектору, чтобы гарантировать точность фильтрации). Этот «сэндвич» центрифугировали 1 мин при 500 об/мин. После этого фильтры промывали 2x100 мкл Na-ацетатного буфера, затем водой 3 х 200 мкл. Буферный и водный растворы удаляли центрифугированием на протяжении 2 минут. Подготовленные таким

образом DEAE-планшеты использовали для разделения продукта и субстрата реакции.

РРС дополнительно разводили в 5-10 раз водой. 20-мкл аликвоты полученных смесей наносили на влажное дно лунок DEAE-планшета и, покачивая, инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Далее «сэндвич» (с черным 96-луночным планшетом в качестве приемника) центрифугировали 30 сек. Лунку промывали водой (2x30 мкл, затем 1x100 мкл), при этом весь водный элюат верхнего планшета собирали в одну соответствующую лунку нижнего планшета. Далее коллектор меняли и лунки промывали 200 мкл 0,5 М Na-ацетатного буфера (в две порции).

Определение субстратной специфичности NA с помощью OS-BODIPY

Сначала проводилось определение линейного диапазона зависимости, выхода продукта энзиматической реакции от концентрации субстрата, далее все исследования проводились в найденном диапазоне. Исследования субстратной специфичности NA вирусов гриппа проводили при постоянной концентрации вируса, предварительно подобранной с использованием субстрата 3"SL-BODIPY. Разведения каждого вируса выбирали таким образом, чтобы выход составлял не более 30% за 30 минут инкубации. Разведения OS-BODIPY для определения субстратной специфичности NA делали такими, чтобы концентрация субстрата в реакционных смесях соответствовала диапазону 30 -700 мкМ.

В микропробирки, объединенные в стрипы, помещали по 12 мкл раствора субстрата (серия из 5 — 6 концентраций) в NC буфере, и в каждую из них одновременно добавляли по 3 мкл вирусной суспензии. Пробирки плотно закрывали, встряхивали и инкубировали при 37С. Каждые 10 - 15 мин отбирали 5-мкл аликвоты и сразу же вносили их в пробирки с 45 мкл воды. Полученные РРС прогревали 10 мин при 70С и анализировали методами 1 и/или 2 (см. выше). Для определения субстратной специфичности NA вируса

проводили 3-4 независимых эксперимента с промежутками между ними не менее 3—5 дней. Каждая РРС анализировалась в трех параллелях для первого варианта анализа и в четырех — для второго.

Колориметрический метод определения специфичности NA

Был использован периодат-тиобарбитуратный метод (Warren, 1959) с незначительными модификациями. 20 мкл вируса Гк/1143/99 добавляли в пробирку, содержащую 5 нмоль 3'SL или 6'SL в 30 мкл NC буфера. Пробирку плотно закрывали, инкубировали при 37С при постоянном перемешивании 30 мин, и прогревали в течение 10 мин при 70С. Затем в пробирку добавляли 25 мкл раствора №1 (здесь и далее см. «буферные растворы») и интенсивно перемешивали 20 мин при комнатной температуре. После этого приливали 0,25 мл раствора №2, встряхивали до исчезновения желто-коричневой окраски и добавляли 0,75 мл раствора №3. После 15-мин кипячения, раствор охлаждали до комнатной температуры и полученный окрашенный продукт экстрагировали 1 мл изо-бутанола, содержащего 5% концентрированной НС1 (об/об). После центрифугирования количество Neu5Ac в органической фазе определяли по оптической плотности при 549 нм, используя калибровочную кривую, построенную для обработанных тем же способом растворов Neu5Ac (0,5 — 6,0 нмоль в 50 мкл). В качестве контролей использовали смеси, содержавшие 20 мкл TN буфера вместо вирусной суспензии, а также вирусную суспензию без субстрата.

Определение активности NA с помощью MU-NANA (Potier et al., 1979)

В лунку 96 луночного планшета к 2 мкл вирусного препарата добавляли 5 мкл NC буфера и 1 мкл 10 мМ раствора MU-NANA. Далее планшет инкубировали при 37С при постоянном перемешивании 15-30 мин. В каждую из лунок планшета добавляли 200 мкл холодного Стоп-глицинового буфера. Флуоресценцию измеряли при длине волны 360 нм. Выход определяли по калибровке, полученной для 4-метилумбеллиферона. Далее рассчитывалось

количество Ш в образце, равное количеству фермента, необходимого для гидролиза 1 мкмоль субстрата за 1 минуту. Была использована концентрация субстрата, заведомо превышающая значение К_м. В качестве контролей использовали смеси, содержавшие 20 мкл TN буфера вместо вирусной суспензии, а также вирусную суспензию без субстрата.

Электрофорез белков вируса гриппа в денатурирующих условиях

К вирусным препаратам добавляли 1/3 объема 3-кратного буфера для нанесения образцов, далее пробы прогревали в течение 15 мин при 100С, после чего к ним добавляли глицерин до 40% (об/об).

Электрофорез проводили на приборе фирмы «Хеликон» или BioRad в пластинах полиакриламидного геля по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Концентрирующий гель содержал 3,6% акриламида, 0,12% метилен-бисакриламида и 0,1 % ДСН в буфере №1. Разделяющий гель содержал 10% акриламида, 0,33% метилен-бисакриламида и 0,1 % ДСН в буфере №2. Для инициирования реакции полимеризации добавляли 0,1% раствор персульфата аммония и ТЕМЕД (в каталитических количествах). Пробы вносили в лунки геля после префореза (10 минут при силе тока 10 мА). Электрофорез проводили в буфере №3 при силе тока 25 мА. Для определения молекулярной массы белков использовали набор белковых стандартов (Amersham Biosciences, № L17061501/AB).

1) Кумасси

Гели помещали на 40 — 60 мин в раствор красителя. Далее гель отмывали от избытка красителя в воде, содержащей 10% метанола и 5% уксусной кислоты до обесцвечивания. Далее гель сканировали с помощью трансиллюминатора Chemilmager 5500 (Alphalnnotech) в проходящем белом свете (режим Transillumination White), обработку результатов проводили в программе Chemilmager 5500.

2) Окраска гелей по (Kang et al, 2002)

При окраске гелей по этому методу после проведения электрофоретического разделения белков их помещали в фиксирующий раствор на 15-30 минут. Затем переносили в раствор Кумасси на 60 — 120 минут, после чего промывали водой. Гель сканировали в том же режиме, что и при окраске по методу 1).

3) Аммиачный комплекс серебра

Гель отмывали водой 5 мин, помещали на 1 час в раствор №1 и оставляли на ночь в растворе №2. На следующий день гель отмывали водой в течение 5 мин и помещали на 30 мин в раствор №3, после чего отмывали водой (3x10 мин и 4x30 мин при 4С). Затем гель помещали в свежеприготовленный окрашивающий раствор: в 10 мл раствора №4 по каплям добавляли 2 мл 20% раствора AgNC>3 в воде до появления опалесценции, затем объем полученного раствора доводили до 50 мл. Окрашивание проводили при интенсивном покачивании. Гель отмывали водой 3x5 мин и помещали в раствор №5 до появления четкой окраски полос. Развитие окраски останавливали 5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 3-5 минут (Oakley et al., 1980). Гель сканировали в том же режиме, что и при окраске Кумасси.

Определение количества белка в вирусных препаратах по Бредфорд

К 20 мкл образца добавляли 100 мкл раствора красителя (100 мг Кумасси растворяли в 50 мл 95%-ного этанола, добавляли 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и доводили объем до литра дистиллированой водой). Через 15 мин измеряли оптическую плотность при 595 нм. Концентрацию вирусного белка определяли по градуировочному графику, построенному таким же образом для БСA (Bradford, 1976).

Когда концентрация белка была недостаточно высокой для определения по методу Бредфорд, количество белка в них определяли сканированием на электрофоретических гелях полосы М-белка (в качестве стандартов использовали БСА и очищенный препарат вируса №31). Сканирование и

!

обработку результатов проводили на приборе Chemilmager5500 в программе Chemilmager5500.

Подготовка образцов для секвенирования

Для выделения тотальной вирусной РНК использовали материалы и реагенты, проверенные на отсутствие РНКазнои активности. К 100-мкл аликвоте вирусной суспензии добавляли 300 мкл раствора Ultraspec (Biotech Laboratories, USA, № BL-10100) и 80 мкл хлороформа, встряхивали и помещали на 5 мин в лед. После центрифугирования при 4С (15 мин при 13000 об/мин), водную фазу декантировали, добавляли в нее равный объем ледяного изопропанола и оставляли на 15 мин при -20С. После центрифугирования при 4С (10 мин, 13000 об/мин) изопропанол осторожно удаляли, а «бляшку», содержащую РНК промывали 75% этанолом и высушивали на воздухе; растворив 20 мкл воды, и прогревали при 55 - 60С в течение 5 мин.

Матрицей для обратной транскрипции гена NA служила тотальная вирусная РНК. Реакционная смесь состояла из 5 мкл раствора вирусной РНК, 15 пмоль 5'-концевого праймера (далее 5'NA2-1), 1 мкл dNTP и 5,5 мкл воды: Все праймеры, использованные в данной работе, были любезно предоставлены Ю. Романовой, Институт прикладной микробиологии, Вена, Австрия. Смесь прогревали 5 мин при 65С и охлаждали на льду, после этого добавляли 4 мкл 5-кратного First Strand Buffer и 2 мкл 0,1М DTT, прогревали 2 мин при 42С, добавляли 1 мкл (50 ЕдАкт) обратной транскриптазы Super Skript II RT. Реакцию проводили при 42С 50 мин, останавливали 5-мин прогреванием при 72С.

Полимеразную цепную реакцию проводили для накопления такого количества ПЦР продукта, которого достаточно для последующего секвенирования гена NA. Для амплификации использовали следующие две пары специфических праймеров:

первая пара прямой 5'NA2-1 AGCAAAAGCAGGAGTGAAG

обратный 3'NA2-843 ACATGCTGAGCACTTCCTG

вторая пара прямой 5'NA2-731 ACAGTAGTAATGACTGATGG обратный 3'NA2-Uni AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTC.

Используя данные пары праймеров, с полученной при обратной транскрипции матрицы, получали два специфичных продукта длиной около 800 пн.

Для проведения полимеразной реакции использовали смесь Taq и PFU полимераз (1 Ш на реакцию), PFU полимераза использовалась для уменьшения ошибок при проведении ПЦР. Всего проводили 35 циклов (30 сек при 94С, 35 сек при 58С, 1 мин при 72С) на амплификаторе Eppendorf Master Cycler (Eppendorf, Германия).

Для детекции и идентификации продуктов амплификации и наличия специфичных индивидуальных продуктов использовали гель-электорофорез в 1,5% агарозном геле (раствор агарозы в буфере: 40 мМ Tris-борат, рН 7,6, с 1мМ EDTA). В качестве стандарта использовали Apst (Lambda DNA/PstI Marker Fermentas #SM0361), гель окрашивали раствором этидий-бромида (0,5 мкг/мл) и фотографировали на приборе BioDocAnalyze (Whatman Biometra, Германия). Продукты ПЦР-реакции очищали при помощи QIAquick набора (Qiagen, № 28104) согласно протоколу, рекомендованному производителем.

Количество ПЦР-продукта определяли на спектрофотометре Genesis 10UV (Thermo Spectronic, Великобритания) и аликвоту секвенировали.

Обработка данных по первичной структуре NA

Данные по секвенированию обрабатывались с помощью программы
Chromas V 1.45 (Contor McCarthy). Для транслирования полученной
нуклеотидной последовательности в белковую использовали программу
ExPASy Translate tool nittp://cn.expasv.org/tools/dna.html). Выравнивание
белковых последовательностей осуществляли программой ClustalW 1.83
(). Для построения выравниваний

использовали все доступные в Genbank на 01.01.2006 а.к. последовательности девяти подтипов NA, выделенных от разных хозяев. Анализ выравниваний проводили, используя программу Genedoc. Определение положения а.к. замен на трехмерной структуре NA проводили при помощи программы DSviewerPro 5.0иРуМОЫ.1.

Модели нейраминидаз, анализ взаимодействия олигосахаридов с ферментом на основе результатов математического моделирования

Математическое моделирование нейраминидаз вирусов гриппа проводили при помощи программы MODELLER 8.0, минимизация энергии проводилась в поле CHARMM27 при использовании программы TINKER. Модели олигосахаридов (З^Ь, 3'SLN, SLe^c, SLe^a, SLe^x, 6'SL, 6^SLN и MU-NANA) были получены на основании рентгеноструктурных данных (Somerset al., 2000; Liu et al., 2001; Haet al., 2001), их минимизация по энергии проводилась в поле ММ2 при использовании той же программы. Докинг олигосахаридов в НВ-сайт NA проводили в программе AutoDock.

Обработка результатов

Данные по кинетике обрабатывали с помощью программ Excel и SigmaPlot 4.0.

70 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метод определения активности и специфичности нейраминидаз с помощью BODIPY-меченых олигосахаридов

Принцип метода

Для изучения субстратной специфичности NA нами предложен метод, основанный на использовании BODIPY-меченых олигосахаридов в качестве субстратов. Электронейтральный продукт энзиматической реакции и отрицательно-заряженный нерасщепленный субстрат количественно разделяются с помощью анионообменнои смолы — в виде микрокартриджа или 96-луночного планшета (в последнем случае анионообменник входит в состав полупроницаемого дна лунок планшета). Образовавшийся продукт регистрируется флуориметрически.

субстрат NA продукт

Neu5Aca2-3Gaipi-4Glc-cneHcep-BODIPY Gal01-4Glc-cneiicep-BODIPY + Neu5Ac

отрицательно заряжен нейтрален

[ГП Е А ІЕ I

Gal{31-4Glc-cneftcep-BODIPY

( Детекция флуоресценции Схема 3. Определение нейраминидазной активности.

Предложенный метод определения активности нейраминидаз состоит из следующих стадий:

инкубация BODIPY-меченого сиалилолигосахарида с вирусным препаратом в условиях, когда субстрат десиалирован частично

связывание непрореагировавшего субстрата с анионообменной смолой

детекция BODIPY-меченого продукта реакции в водном элюате.
Субстрат, связавшийся со смолой, элюируется ацетаным буфером. Эта

процедура не является обязательной, однако, ее использование позволяет дополнительно контролировать исходное количество наносимое на микрокартридж.

Оптимизация метода

В данной работе использовался набор олигосахаридов , приведенный в Таблице 3, хотя предлагаемый подход позволяет использовать любой олигосахарид, несущий один отрицательный заряд. Выбранные олигосахариды отличаются по: 1) типу связи между остатками Neu5Ac и Gal, 2) наличию или отсутствию ацетамидной группы при С2 остатка Glc, 3) типу связи между Gal и предшествующим остатком, а именно 1-3 или 1-4, и 4) наличию или отсутствию фукозы при остатке GlcNAc. Флуоресцентная метка присоединена к: первому звену OS (Glc или GlcNAc) через спейсер, и таким образом удалена от терминального остатка Neu5Ac и гидролизуемой связи. Выбор BODIPY в качестве метки был обусловлен стабильностью, гидрофильностью и отсутствием суммарного заряда. Отсутствие заряда обязательно, так как отрицательно-заряженный субстрат отделяется от нейтрального продукта благодаря различию в заряде, с помощью ионообменной смолы. Кроме того, спектр флуоресценции BODIPY FL (А,_ех/^_ет 502/513 нм) позволяет работать со стандартным флуоресцеиновым фильтром (480/520 нм).

² Эти сиаліїлолигосахаріїдьі являются рецепторами вирусов гриппа. В частности, 3'SL, 3'SLN, SLe^c, SLe" и SLe^a распознаются НА вирусов гриппа птиц, Вирусы, выделенные из различных семейств птиц, проявляют различное сродство к этим а2-3 сиалозидам (Gambaryan et al., 1997). Все вирусы гриппа А и В человека связываются с 6'SLN (Mochalova et al., 2003). Рецепторная специфичность вирусов свиней более разнообразна и обычно близка либо к птичьим, либо к человеческим изолятам (Gambaryan et al., 2003).

Таблица 3. Структура использованных субстратов.

* спейсер =-CH₂CH₂CH₂NH-^J.

При поиске анионообменной смолы, подходящей для разделения субстрата (на примере 3'SL-BODIPY) и продукта реакции (Lac-BODIPY), было проведено сравнение двух материалов: DEAE-Sepharose FF и DEAE-Toyopearl 650М. Продукт реакции не задерживался ни на одном из них. Связавшийся со смолой субстрат элюировался с DEAE-Sepharose FF в 0,02 М Na-ацетатном буфере, в то время как с DEAE-Toyopearl 650М - в 0,05 М. Таким образом, использование DEAE-Toyopearl позволяет надежнее разделить 3'SL-BODIPY и Lac-BODIPY (фактор ионной силы необходимо учитывать при работе с реакционными смесями, например, концентрация ацетата Na в РРС составляет 10 мМ). Оптимальный объем DEAE-Toyopearl составил 40 мкл для разделения искусственных и реальных реакционных смесей, содержащих 10"¹¹ - 10~⁹ моль OS. Такие концентрации OS-BODIPY соответствуют линейному участку калибровочной кривой, и соотношение сигнал/фон для них больше 70. В ходе дальнейшей оптимизации процедуры разделения было проведено сравнение свойств двух типов DEAE-Toyopearl сорбентов, а именно DEAE-Toyopearl 650М и DEAE-Toyopearl 650S, которые отличаются только средним размером частиц. В результате экспериментов по разделению модельных реакционных смесей с 3'SL-BODIPY и Lac-BODIPY был выбран сорбент DEAE-Toyopearl

Далее для простоты изложения спейсерный фрагмент в формулах опущен.

650S, позволяющий достичь более надежного разделения субстрата и продукта реакции.

Структура нейраминидаз

NA состоит из 470 а.к. остатков, в белке можно выделить несколько структурно-функциональных доменов: цитоплазматический участок, трансмембранный домен и стебель. На поверхности вириона NA в виде гомотетрамера грибообразной формы находится квадратная «голова» размером 80 80 40 А на тонком стебле диаметром 15 А и длиной до 100 А (чаще около 60 A) (Colman, 1989). Молекулярный вес мономера 60 кДа, а тетрамера 240 кДа (Varghese & Colman, 1991). На поверхности вириона присутствует в среднем 50 таких тетрамеров, расположенных скорее всего не равномерно, а в виде кластеров (Harris et al., 2006). В настоящее время известны пространственные структуры нейраминидаз N1, N2, N4, N8, N9 и В (Varghese et al., 1983; Varghese & Colman, 1991; Bossart-Whitaker et al., 1993, Janakiraman et al., 1994; Varghese et al., 1997; Russel et al., 2006). Несмотря на то, что гомология по первичной структуре NA между типами А и В достигает всего 30%, их пространственная организация идентична. При общей схеме укладки полипептидной цепи, существуют небольшие отличия в количестве аминокислот, входящих в тяжи и межтяжевые петли. Однако, эта вариабельность не влияет на пространственное расположение ключевых остатков NA, как функциональных, так и структурных (Bossart-Whitaker et al., 1993). После получения рентгеноструктурных данных по строению нейраминидаз N1, N4 и N8 и сравнения их пространственных структур с ранее известными выяснилось, что между NA групп 1 и 2 существуют небольшие различия в районе 150 а.к. остатка (остатки с 147 по 152) (Рисунок 3). Конформация петли-150 такова, что Са углеродного атома Vail49 у NA группы 1 расположен на 7 А дальше, чем атом в остатке Не 149 у NA группы 2. В точке максимального приближения петли-150 к активному центру наблюдается различие в 1,5 А в положении боковой цепи консервативного остатка Aspl51 между NA двух групп. Располагающийся радом консервативный остаток Glull9 у NA группы 2 формирует водородную связь с Argl56, а у NA группы 1 боковая цепь этого остатка направлена в противоположную сторону. Различия в пространственной ориентации этих двух остатков приводят к увеличению на 5А «ширины» активного центра у NA группы 1. У NA второй группы Gin 136 образует водородную связь с углеродным остатком основной цепи а.к. остатка 150, что стабилизирует структуру петли. В белках группы 2 образование подобной водородной связи невозможно по стерическим причинам, что приводит к сдвигу цепи на 3,5 А ниже к основанию кармана. Т.о., карман-150 имеет размеры 10 5 5А (Russel et al., 2006). Рисунок 3. Наложение активных центров трех неираминидаз из группы 1, показывающее их идентичность Нейраминидаза N1 представлена зеленым, N4 - золотым, N8 - синим. Наложение активных центров неираминидаз N1 (зеленый) и N9 (желтый) показывает, что N9 значительно отличается от N1 в районе а.к. остатка 150 (Russel et al., 2006).

Цитоплазматический домен состоит из шести высоко-консервативных аминокислот (Block and Air, 1982). Мутации в этом и трансмембранном участках белка могут влиять на его экспрессию, созревание, транспорт, сборку вирусных частиц и ферментативную активность (Barman et al., 2004). Цитоплазматический участок NA играет важную роль в процессе сборки новых вирусных частиц, определяя не только их форму, но и соотношение РНК и белков, входящих в состав вириопа. Процесс сборки вирусных частиц в общем можно представить в виде взаимодействия цитоплазматических и/или трансмембранных доменов поверхностных белков, заякоренных в мембране (НА, NA и М2) с выстилающим внутреннюю мембрану вирусной частицы белком Ml, который, в свою очередь, ассоциирован с вирусными РНП-частицами (Garoff et al., 1998, Nayak et al., 2004). Отсутствие цитоплазматического участка NA приводит к снижению выхода вирусных частиц и количества NA в составе вириона, изменению соотношения включаемых в вирион белков. Изменение количества РНК в вирионе и снижение инфекционности наблюдается у вирусных частиц с делетированным цитоплазматическим участком NA. При отсутствии этого участка, образуются вирионы филаментоподобной структуры, а при отсутствии цитоплазматических участков НА и NA образуются вирионы нерегулярной формы (Jin et al., 1997). Делеция цитоплазматических участков НА и NA не нарушает апикальной направленности их транспорта к мембране хозяйской клетки, но влияет на липидный состав вирусной мембраны: в ней уменьшается количество островков сфинголипидов и холестерина. Это, в свою очередь, приводит к снижению количества белка Мів вирусных частицах. Белок Ml необходим для сборки всех вирусных компонентов, включая РНП. Таким образом, вирусные частицы, несущие делеции по цитоплазматическим участкам НА и NA, имеют не только измененную морфологию, но и отличаются от природных вирионов нарушенным белковым и РНК-составом (Zhang et al., 2000, Barman et al., 2004). Недавно было показано, что белок Ml локализуется не только в ядре зараженной клетки, но также формирует островки на плазматической мембране в тех же местах, где локализуются на клеточной поверхности НА и NA, и выделяется в той же фракции, что НА и NA при дифференциальном центрифугировании (Latham and Galarza 2001). Замена а.к. №№ 2, 3 и 4 цитоплазматического домена NA приводит не только к снижению продукции белка (27% по сравнению с диким типом), но и к исчезновению взаимодействия с белком Ml, что резко снижает количество тетрамеров NA, включаемых в вирион (Barman et al., 2004).

Гомология трансмембранного домена между подтипами NA низка. Тем не менее, наличие гидрофобных а.к., таких как изолейцин и аланин, характерно для всех трансмембранных структур: полярные а.к., такие как треонин и серии, возможно, необходимы для тетрамеризации нейраминидазы (Colman, 1989). В этом домене находится транслокационный сигнал и «якорный домен» для связывания с мембраной, который взаимодействует с липидными островками и содержит несколько сайтов, ответственных за апикальный транспорт белка (Kundu et al., 1996; Barman and Nayak, 2000). Вирусы с мутациями в трансмембранном домене имеют сниженный уровень нейраминидазной активности, плохо включаются в состав вируса, а полученные вирусные частицы остаются прикрепленными к поверхности клетки (Barman et al., 2004).

Мутации в NA, отвечающие за устойчивость вирусов к ингибиторам NA

Следует заметить, что наблюдались случаи появления резистентных вирусов. При лабораторном получении вирусов гриппа, резистентных к ингибиторам нейраминидазы, парадоксальным образом, в первую очередь мутации появляются не в NA, а в НА. А.к. замены в NA появляются не раньше, чем через пять пассажей после возникновения мутаций в НА, или не появляются вообще (Staschke et al., 1995; Gubareva et al., 1996; Gubareva et al., 1998; Smeeetal., 2001).

Все мутации в первичной структуре NA, вызываемые ее ингибиторами, целесообразно разделить на два класса: а) затрагивающие функциональные остатки активного центра, б) структурные аминокислоты (Gubareva etal., 2001). Самой частой мутацией, вызываемой ингибиторами NA, является замена Arg292Lys. Arg 292 является функционально важным компонентом каталитического центра NA. Появление Lys в положении 292 влияет на связывание с карбоксилом Neu5Ac. Замена другой а.к. на лизин в этом положении приводит к нарушению взаимодействия. Данная замена появляется при селекции in vitro занамивиром, тамифлю и преамивиром. Мутант Arg292Lys в 30000 раз менее чувствителен к ингибиторам, активность NA снижается до 2% от исходной (Tai et al., 1998; Oxford et al., 2002). Вирусы с мутацией Arg292Lys проявляют минимальную чувствительность к занамивиру и преамивиру, и высокую - к ингибиторам с гидрофобными боковыми радикалами, таким как тамифлю (McKimm-Breschkin, 2000; Gubareva etal., 2001).

При лечении занамивиром был выделен вариант вируса гриппа В с мутацией Argl52Lys в NA; Argl52 образует водородную связь с карбонилом N-ацетильной группы Neu5Ac (Gubareva et al., 1998). Новый вариант вируса проявлял устойчивость ко всем трем ингибиторам (Gubareva et al., 2001; Mishin et al., 2005a). Обе замены, Arg292Lys и Argl52Lys, произошли в тех положениях активного центра, которые контактируют с наиболее важными группами субстрата, сохраненными при дизайне ингибиторов, поэтому и устойчивость NA проявляется по отношению ко всем ингиибторам.

Недавно было проведено исследование влияния отдельных функциональных а.к. активного центра NA на устойчивость к ингибиторам. За основу была взята а.к. последовательность нейраминидазы А/Вухан/359/95 (H3N2), в нее были внесены следующие единичные мутации: Argll8Lys, Arg371Lys, Glu227Asp, Argl52Lys, Arg224Lys, Glu276Asp и Argl51Glu. Два из полученных вирусов (Argil8Lys и Glu227Asp) очень плохо росли на культуре клеток. Вирусы с мутациями Arg224Lys, Glu276Asp и Arg371Lys оказались резистентны к тамифлю и занамивиру, в то время как вирус с мутацией Argl51Glu проявлял резистентность только к тамифлю, а вирус с мутацией Argl52Lys оказался не чувствителен к обоим ингибиторам. Анализ аминокислотных последовательностей NA вирусов гриппа показал, что появление мутации Glu276Asp наиболее вероятно под селективным давлением применения ингибиторов (Yen et al., 2006). Результаты данного исследования, возможно, помогут оптимизировать дизайн новых ингибиторов NA.

Мутация по остатку Glull9 является самой распространенной и имеет большое влияние как на активность NA (снижает ее до 5-50% от уровня вируса дикого типа), так и на устойчивость вируса к лекарствам (Gubareva et al., 1996; McKimm-Breschkin, 2000; Gubareva et al., 2001). Кислород боковой цепи Glull9 взаимодействует с водородом Argll8, поэтому замена Glu на Val нарушает взаимодействие с Argll8. А так как Argil8 входит в состав триаргининового кластера, принципиально важного для действия NA, то любое изменение его координат влияет на взаимодействие как с карбоксилом Neu5Ac, так и ее аналогов - ингибиторов NA.

Недавно был выделен новый тамифлю-устойчивый вариант вируса гриппа В/Мемфис/20/96 с заменой в одном из функциональных остатков активного центра (Aspl98Asn), но данная аминокислотная замена не оказала влияния на его чувствительность к преамивиру (Mishin et al., 2005а). Остаток 198 контактирует с Argl52 активного центра, помогая ему поддерживать необходимую позицию, этот остаток аргинина образует водородную связь с карбонилом N-ацетильной группы Neu5Ac и мутация по нему приводит к резистентности ко всем лекарствам-ингибиторам NA. Интересно, что мутация Aspl98Asn произошла в единственном не строго консервативном а.к. остатке, входящем в активный центр NA, так как Asn в этой позиции характерен для N7 и N9 нейраминидаз. Необходимо отметить также, что нейраминидазы подтипов N7 и N9 являются чувствительными к тамифлю (Govorkova et al., 2001).

До сих пор не было получено данных о возникновении в природе вариантов вируса гриппа, у которых устойчивость к ингибиторам NA появляется благодаря заменам вне структурных и функциональных участков активного центра. Тем не менее, при селекции в лабораторных условиях был выделен один такой вирус, His273Tyr. Он был получен при культивации штамма В/Ямагата/16/88 в присутствии преамивира. Данный а.к. остаток напрямую не взаимодействует с ингибитором в активном центре фермента (находится на расстоянии более 5А от него), но как было показано при помощи методов математического моделирования, вызывает отталкивание между молекулой ингибитора и фермента (Baum et al., 2003). Таким образом, существует потенциал для появления резистентных штаммов вирусов гриппа за счет мутаций, которые, скорее всего не будут приводить к изменениям в функциональной активности фермента, и такие вирусы будут обладать гораздо большим адаптационным потенциалом.

Определение активности NA вируса гриппа

Основным параметром, анализируемым в данной работе, является субстратная специфичность (профиль субстратной специфичности), под которой подразумевается совокупность активностей по отношению ко всем использованным олигосахаридам (см. таблицу 3), определяемая в идентичных условиях, отвечающих линейной кинетике реакции. На практике, часто оказывается достаточным определить активность фермента по отношению только к одному субстрату. Обычно, для определения активности NA используют флуорогенный субстрат MU-NANA (Рисунок 14) или аналогичные простые гликозиды, в состав которых входит моносахарид Neu5Ac, а не сиалоолигосахарид. Очевидно, что их взаимодействие с активным центром фермента отличается от такового для природных субстратов, к которым максимально приближены структуры исследуемых нами олигосахаридов.

Чтобы ответить на этот вопрос, было проведено моделирование взаимодействия, а также проведены прямые кинетические эксперименты по сравнению субстратов. Моделирование. Проведенное математическое моделирование взаимодействия MU-NANA с активным центром N9 NA4 показало, что в наиболее энергетически выгодной конформации MU-NANA занимает в активном центре такое положение, при котором остаток MU контактирует с функциональными аминокислотами активного центра, в частности с аргининами, входящими в состав триаргининового кластера (Рисунок 15). Иными словами, остаток нейраминовой кислоты в составе MU-NANA занимает в активном сайте фермента иное положение, чем в комплексе NA с сиалилолигосахаридами. Следует отметить, что при моделировании взаимодействия природных олигосахаридов, а также нейраминовой кислоты и Neu5Ac2en, наиболее выгодным положением в активном центре NA оказывалось то, в котором нейраминовая кислота расположена максимально удобно для катализа, что говорит в пользу правильности математического моделирования.

Экспериментальное сравнение. В качестве стандартизованной меры активности фермента используются международные единицы (Ш), которые отражают количество фермента, осуществляющего катализ одного микромоля субстрата в минуту (Coperland, 2000). Для сравнения соответствия активности NA, определенной с помощью MU-NANA и с помощью 3 SL, было проведено определение количества Ш для образцов высокоочищенных реассортантов и адаптантов вирусов гриппа R8/Dk-RAi (H3N2), R8/Dk-RAiXII (H3N2), R2 (H3N1), R2-XXI (H3N1), RCB1 (H4N1) и RCB-XXI (H4N1).

Большее количество IU активности NA в одних и тех же образцах вирусов, определенное при использовании 3"SL по сравнению с MU-NANA указывает на то, что 3"SL значительно лучше гидролизуется неираминидазои. Более того, последняя колонка Таблицы 5 говорит об отсутствии пропорциональности между Ш, определенными для двух различных субстратов, отношение активности варьирует в пределах порядка величины! Таким образом, общепринятый субстрат для определения активности NA не является адекватным для изучения гидролиза неираминидазои вируса гриппа природных рецепторов. По-видимому, применение MU-NANA следует ограничить задачами, когда измеряется активность разных образцов одного и того же вируса. Безусловно, MU-NANA нельзя использовать как «золотой стандарт» для определения количества Ш активности NA вируса гриппа. Дополнительные экспериментальные данные, показывающие неидеальность MU-NANA для изучения кинетики десиалирования, приведены в главе «Вирусы, устойчивые к тамифлю».

Таким образом, не только определение профиля субстратной специфичности, но и более простую задачу - определение активности NA по отношению к одному субстрату, лучше проводить с помощью олигосахаридного субстрата, а не традиционного MU-NANA. Влияние вирусных белков на действие нейраминидазы

В литературе можно найти многочисленные данные о взаимозависимости функционирования НА и NA вируса гриппа (см. раздел «Корреляция активности гемагглютинина и нейраминидазы»). Реализуется ли взаимный «отбор» этих белков по чисто эволюционному механизму, или имеет место их физическое влияние друг на друга в составе вирусной частицы, до сих пор неизвестно. В данной работе сделана попытка выявить непосредственное влияние НА (а также некоторых других факторов) на субстратную специфичность NA; точность разработанного метода позволяла надеяться на выявление даже слабых изменений. Один из примененных экспериментальных подходов заключается в частичном удалении НА и (или) NA с поверхности вирусных частиц с помощью протеазы бромелаина.

Согласно литературным данным, использование этого фермента позволяет достичь избирательного удаления НА и NA с поверхности вирусных частиц (Арбатский коллегами др., 1989). Двухстадийная процедура Арбатского включает: 1) расщепление вирусных частиц ферментом в отсутствие тиольного агента, приводящее к удалению с поверхности вирусных частиц НА, 2) проведение той же процедуры в присутствии Р-меркаптоэтанола, приводящее к удалению NA.

Мы повторили описанные выше условия для избирательного удаления эктодоменов НА и NA с поверхности вируса А/Пуэрто Рико/8/34 (H1N1). После проведения реакции эктодомены НА и NA отделяли от обработанных (себвирусных) частиц при помощи ультрацентрифугирования. Процесс контролировали по наличию полос НА и NA на электрофоретических гелях, для чего исходные и обработанные вирусные частицы «разбирали» с помощью детергента. Кроме того, проводилось определение активности НА и NA в полученных растворах.

При использовании бромелаина без тиольного агента мы наблюдали практически полное исчезновение полосы НА с электрофоретических гелей субвирусных частиц, которое сопровождалось сокращением титра гемагглютинации частиц по сравнению с исходным вирусом (на 2,5 порядка), в то время как гемагглютинирующеи активности в супернатанте не обнаруживалось. По-видимому, мы наблюдали практически полное отщепление НА, причем в процессе отделения эктодоменов от субвирусных частиц, тримеры НА распадались до мономеров, - об этом косвенно говорит эксперимент с другим протеолитическим ферментом (трипсином), когда следовая НА активность в супернатанте сохраняется. Активность NA в составе субвирусных частиц падала приблизительно в 100 раз (для расчета использовалась концентрация белка в образцах) по сравнению с активностью в составе исходной вирусной частицы и, обнаруживалась в супернатанте на уровне, сравнимом с активностью для субвирусной частицы.

При использовании бромелаина в присутствии Р-меркаптоэтанола наблюдалось практически полное исчезновение полос НА и NA с электрофоретических гелей субвирусных частиц, для данных образцов также отмечалось резкое снижение титра гемагглютинирующеи активности, NA активность субвирусных частиц также была невелика и не обнарживалась в супернатанте. Таким образом, полученные данные противоречат результатам Арбатского с коллегами.

Восстановление функционального баланса HA-NA в реассортантных вирусах

Хорошо известно, что только некоторые из комбинаций гемагглютинина с нейраминидазой реализуются в природе. In vitro можно получать «неестественные» конструкции (реассортанты), которые, однако, генетически неустойчивы, и мутируют в более устойчивые варианты, так называемые адаптанты, в которых соблюдается жизненно важный для вируса баланс активностей этих двух сиало-узнающих белков. Что при этом происходит с субстратной специфичностью NA, то есть изменяется ли вместе с активностью фермента также и его рецепторная специфичность, до настоящего исследования было неизвестно.

В данном случае изучались реассортанты между вирусами человека и птицы, которые несли гемагглютинин НЗ (А/утка/Украина/1/63) или Н4 (А/утка/Чехословакия/56) вирусов птиц, наряду с низкоактивной нейраминидазой N1 (А/СССР/90/77) или N2 (А/Аичи/2/68) вирусов человека. В результате предыдущих исследований данных пар реассортант-адаптант было показано, что для всех НА-адаптантов характерны замены в районе рецептор-связывающего участка молекулы НА, которые приводят к снижению его аффинности к сиалилологосахаридам, тем самым снижая тенденцию к агрегации адаптантов (Kaverin et al., 1998; Kaverin et al., 2000). Также было показано, что восстановление функционального баланса между НА и NA возможно за счет изменения в НА — для компенсации недостаточной активности NA. В то же время, несмотря на то, что у некоторых полученных реассортантов в ходе успешной адаптации были отмечены изменения в а.к. последовательности NA (Таблица 6), исследований их влияния на активность и специфичность фермента проведено не было. Определение роли NA в восстановлении функционального баланса между НА и NA было целью данной части работы. Были изучены три пары реассортант-адаптант: 1) R8/Dk-Rai и R8/Dk-RALXII (H3N2), 2) RCB1 и RCB1 XXI (H4N1), 3) R2 и R2 XXI (H3N1); обязательным условием выбора пар было возникновение мутаций в NA в процессе адаптации.

Для первой пары вирусов (R8/Dk-Rai и R8/Dk-RAiXII) адаптационное изменение NA выражалось в замене Glu83Gly, которая локализуется в районе присоединения «стебля» белковой молекулы к ее «голове», достаточно далеко от активного центра фермента (Рисунок 24). Известно, что Glu83 является консервативной а.к. для N2 нейраминидаз вирусов гриппа птиц и свиней, в то время как Gly в данном положении встречается у вирусов гриппа птиц; то есть, в ходе адаптации произошла замена в «птичьем» направлении. Изменения в профиле субстратной специфичности NA, вызванные данной заменой, оказались незначительными и выражались в основном в «сглаживании» профиля субстратной специфичности (Рисунок 23).

При учете количества общего белка, определенного по методу Бредфорд, и при сканировании полосы М-белка с электрофоретических гелей получается, что NA пассажного варианта R8/Dk-RAiXII менее активна, чем NA родительского реассортанта R8/Dk-RAi. Правда, снижение активности NA R8/Dk-RAiXII может отражать не удельную активность NA, а различное количество NA тетрамеров на поверхности вирионов. Кроме того, полученные величины абсолютной активности сравнивали с результатами определения общепринятым методом, основанного на использовании MU-NANA в качестве субстрата. В результате проведения данного анализа было установлено, R8/Dk-RAi содержит в два раза меньше единиц активности фермента в препарате, чем R8/Dk-RAiXII. То есть, препарат адаптанта является в два раза более активным, чем препарат реассортанта. Это не совпадает с данными по абсолютной активности, рассчитанными на основании количества белка. Возможно, это несоответствие связано с влиянием, оказываемым метилумбеллиферильной группой на кинетику реакции десиалирования.

Адаптация NA второй пары вирусов (RCB1 и RCB1 XXI) выражалась в одной замене Leu206Ile. Данная а.к. расположена в (3-слое, в зоне контакта мономеров NA на далеиии от района активного центра фермента (Рисунок 25), причем данный участок крайне консервативен для нейраминидаз N1, а также для нейраминидаз других подтипов .

Среди всех доступных в настоящее время в GenBank а.к. последовательностей N1 NA изолейцин в данном положении не встречается. Более того, как видно из рисунка 22, данный участок является высококонсервативным и для NA других подтипов, вне зависимости от типа организма-хозяина, и высоко консервативна между подтипами NA. Последовательности данного участка наиболее близки для нейраминидаз, входящих в одну и ту же филогенетическую группу (Russel et al., 2006). Так, для N1 и N4, формирующих группу 1, участок а.к. 206 практически идентичен, а в группе 2 он идентичен для N9 и N6 NA. Если в нейраминидазах N1 и N4 позицию 206 занимает Leu, то в N3, N5 и N9 - Не, в N6, N7, N8 - Val, а в N2 -Phe. Все эти факты указывают на то, что данный участок играет критическую роль в функционировании фермента, которая, скорее всего, связана со стабильностью мономера или тетрамера NA. Интересно также отметить тот факт, что полиморфизм по данному а.к. остатку у NA подтипа N2 носит видоспецифичный характер; так, Не в данном положении характерен для вирусов птиц, в то время как Phe — для NA вирусов гриппа, изолированных от человека.

Влияние замены а.к. 206 на профиль специфичности, скорее всего, обусловлено нарушением взаимодействий в зоне контакта мономеров NA. Основным последствием данной мутации стало значимое увеличение отношения гидролитической активности по а2-3 и а2-6 сиалоолигосахаридам (Рисунок 23), по сравнению с исходным реассортантом. Эффект увеличения величины а2-3/а2-6 отмечался также при сравнении профилей специфичности NA вируса А/Пуэрто-Рико/8/34 в составе вирусной частицы и в растворе (см. раздел «Влияние других вирусных белков на действие нейраминидазы»). Поэтому, наблюдаемые изменения в профилях RCB1 и RCB1 XXI мы объясняем нарушением контакта мономеров NA в составе тетрамера.

Похожие диссертации на Изучение олигосахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа

Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипеФесенко Евгений Евгеньевич

Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человекаКочергин-Никитский Константин Сергеевич

Исследование структуры РНК и белка нуклеопротеида вируса гриппа в растворе и в составе РНП Соколова Марина Владимировна

Структурно-функциональные домены матриксного белка М1 вируса гриппаТимофеева Татьяна Анатольевна

Антигенная структура гемагглютинина подтипов H5 и H9 вируса гриппа A и фенотипические свойства их антигенных вариантов Ильюшина Наталия Александровна

Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для мониторинга вируса гриппа АКиреев Дмитрий Евгеньевич

Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растенияхМещерякова Юлия Александровна

Рецепторная специфичность вирусов гриппа разных хозяевГамбарян Александра Сергеевна

Нейраминидазная специфичность штаммов вирусов гриппа A и B, циркулировавших в России в эпидсезоны 2006-2010 гг.Белякова, Наталья Владимировна

Изучение репродукции вируса гриппа в первичных культурах клеток респираторных органов для прогноза его инфекционности in vivoСергеев Артемий Александрович