Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы «Использование первичных культур клеток для изучения инфекционных свойств вирусов» 14
1.1. Характеристика восприимчивости организма к вирусу гриппа. Методы оценки патогенности и инфекционности вирусов 14
1.2. Использование модельных животных в вирусологических экспериментах 29
1.3. Использование первичных и перевиваемых культур клеток для изучения инфекционности вирусов 32
1.4. Метод прогнозирования ИД50 вируса с использованием первичных культур клеток 35
1.5. Вирус гриппа, клетки-мишени и механизмы адсорбции и репродукции вируса гриппа в клетках-мишенях 39
1.5.1. Механизмы адсорбции и репродукции вируса гриппа в клетках-мишенях 43
1.5.2. Клетки-мишени для вируса гриппа 48
1.6. Факторы врожденного иммунитета к вирусу гриппа у мышей, крыс, других животных и человека 57
1.7. Использование первичных культур клеток для научных исследований 67
2 Материалы и методы 72
2.1. Вирус и определение его концентрации 72
2.2. Лабораторные животные 72
2.3. Получение первичных культур клеток легких и трахеи 73
2.4. Получение первичных клеточных культур с разным содержанием определенных типов легочных клеток 74
2.5. Оценка жизнеспособности клеток при длительном культивировании 76
2.6. Цитологическое исследование 76
2.7. Изучение кинетики инактивации вируса в дебрисе клеток. Определение константы скорости инактивации вируса 79
2.8. Определение кинетики репродукции вируса 79
2.9. Определение 50% инфицирующей дозы вируса для первичной суспензионной культуры клеток легких или трахеи 80
2.10. Определение продукции (урожайности) вируса для одной клетки 81
2.11. Определение 50% инфицирующей дозы для легких и трахеи у животных 82
2.12. Метод прогнозирования ИД5о 83
2.13. Проверка адекватности алгоритма прогнозирования 84
2.14. Получение бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), содержащей внеклеточные ингибирующие факторы секреторной эпителиальной выстилки (ИФСЭВ) крыс 84
2.15. Диализ и лиофилизация жидкости, содержащей ИФСЭВ 85
2.16. Изучение нейтрализующей активности жидкости, содержащей ИФСЭВ крыс, при инфицировании развивающихся куриных эмбрионов вирусом гриппа 86
2.17. Статистические методы 86
3 Результаты собственных исследований 89
3.1. Разработка методик определения параметров взаимодействия вируса гриппа с клетками трахеи и легких в первичной суспензионной культуре 89
3.1.1. Оптимизация условий культивирования первичной суспензионной культуры клеток, выделенной из легочной 89
3.1.2. Разработка методик определения параметров вирус-клеточного взаимодействия с учетом кинетических особенностей репродукции и инактивации вируса гриппа в первичной суспензионной культуре легочных клеток мышей и крыс 96
3.1.2.1 Определение вероятности продуктивной адсорбции вируса гриппа на восприимчивой клетке 98
3.1.2.2. Определение урожайности вируса гриппа в клетке (N) 102
3.1.2.3. Определение константы инактивации вируса (kj) и длительности стационарной фазы продукции вируса 106
3.2. Проверка возможности прогнозирования ИД50 вируса гриппа для хозяина 107
3.2.1. Определение ИД50 вируса гриппа для респираторных органов-мишеней у экспериментальных животных при аэрогенном заражении 107
3.2.2. Определение параметров вирус-клеточного взаимодействия для клеток легких и трахеи экспериментальных животных в первичной суспензионной клеточной культуре 111
3.2.3. Изучение вирус нейтрализующей активности внеклеточных ингибирующих факторов, входящих в состав секреторной эпителиальной выстилки, в легких у крыс 120
3.3. Прогнозирование восприимчивости животных in vivo на основании показателей инфекционности вируса гриппа в клетках легких и трахеи in vitro 124
Заключение 128
Выводы 136
Список использованной литературы
- Использование первичных и перевиваемых культур клеток для изучения инфекционности вирусов
- Клетки-мишени для вируса гриппа
- Оценка жизнеспособности клеток при длительном культивировании
- Оптимизация условий культивирования первичной суспензионной культуры клеток, выделенной из легочной
Введение к работе
Актуальность исследования. Вирус гриппа является самым известным и распространенным среди вирусов, вызывающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. Грипп представляет собой острое респираторное заболевание, часто с тяжелым течением. Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 млн. случаев тяжелых заболеваний и к 300-500 тыс. случаев со смертельным исходом [CDC, 2005]. Эпидемии гриппа по масштабам распространения заболевания среди населения представляют меньшую угрозу по сравнению с пандемиями, которые охватывают целые континенты, и приводят к огромной смертности среди заболевших [Kamps and Reyes-Teran, 2006]. Продолжающиеся вспышки H5N1 гриппа среди птиц со случаями передачи людям вызывают беспокойство у ученых во сем мире, так как известно, что штамм вируса гриппа (H1N1), вызвавший пандемию в 1918 году, был подобен вирусу гриппа птиц [Kamps and Reyes-Teran, 2006]. Многие эксперты считают, что именно вирус гриппа птиц H5N1 может породить новый пандемичный штамм [Webster et al., 1992; Guan et al., 2004; WHO, 2005; Perdue and Swayne, 2005].
Проблема возникновения смертоносной пандемии или эпидемии гриппа свидетельствует об необходимости создания методов, позволяющих оценивать степень опасности для человека вновь возникающих вариантов вируса гриппа А, в частности, прогнозировать потенциальную степень инфекционности вируса или эквивалентную характеристику - потенциальную степень восприимчивости человека к вирусу гриппа. Кроме того, эффективное противодействие пандемии предполагает не только раннее выявление потенциальных пандемичных вариантов вируса гриппа А, но и определение противовирусных препаратов, способных эффективно защитить человека от гриппа.
Умение количественно оценивать восприимчивость человека и животных к новым штаммам вируса гриппа, а также прогнозировать степень защиты организма человека и животных противовирусными препаратами, повысит как
8 вероятность раннего выявления пандемичного штамма, так и вероятность
выбора наиболее эффективных средств борьбы с гриппом в случае
возникновения пандемии.
Кроме генетических штаммовьгх особенностей вируса гриппа А восприимчивость организма к нему определяется как специфическими клеточными рецепторами, в состав которых входит сиаловая кислота, так и внеклеточными факторами, ингибирующими (сурфактант) или, напротив, потенцирующими (протеиназы) проникновение вируса в клетки-мишени органов дыхания [Kido et al. 1999; Ito et al, 2000; Matrosovich et al., 2000; Tamura and Kurata, 2004].
В основу разрабатываемого в данной работе метода положен метод прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусу Марбург путем экстраполяции ЛД50 вируса с модельного животного [Чермашенцев В.М. и др., 1993]. Уравнение и схема прогнозирования были выведены, исходя из наиболее общей схемы формирования инфекционного процесса, с учетом того, что инфицирование клетки и продукция новых вирусных частиц являются вероятностными процессами. Система прогнозирования ИД5о для вируса гриппа кроме алгоритма расчетов включает также методики получения первичных клеток и определения параметров вирус-клеточного взаимодействия, которые должны учитывать особенности патогенеза инфекции. В связи с этим в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.
Цель исследования. Разработать экспериментально-теоретическую систему прогнозирования восприимчивости организма к вирусу гриппа (in vivo) на основе восприимчивости к вирусу гриппа его клеток-мишеней (in vitro) и оценить возможность ее применения при сравнении прогнозируемых и экспериментально полученных инфицирующих доз вируса гриппа для лабораторных животных.
9 Задачи исследования:
Разработать методы получения и культивирования суспензионных первичных культур клеток легких и трахеи лабораторных животных.
Разработать методы оценки параметров инфекционности вируса гриппа в суспензионных первичных культурах клеток легких и трахеи лабораторных животных (мышей и крыс).
Провести сравнительный анализ показателей инфекционности вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных in vivo и для восприимчивых клеток легких и трахеи in vitro.
Оценить возможный вклад внеклеточных защитных (барьерных) факторов выстилки респираторных органов лабораторных животных в формирование их восприимчивости к вирусу гриппа.
Сделать прогноз ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных и проверить адекватность разработанной системы прогнозирования путем сравнения прогнозированных и экспериментально определенных величин ИД50 вируса гриппа для легких и трахеи лабораторных животных.
Научная новизна работы. Впервые разработана лабораторная технология получения и культивирования первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи, сохраняющих жизнеспособность и способных продуцировать вирус гриппа в течение трех суток. Впервые разработаны оригинальные процедуры определения показателей восприимчивости к вирусу гриппа для первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи (50% инфицирующей дозы и средней урожайности вируса гриппа в инфицированной клетке).
Впервые показано, что восприимчивость первичных суспензионных культур клеток легких и трахеи мышей CD-1 и крыс Wistar при инфицировании вирусом гриппа in vitro одинакова, но ниже, чем у мышей ICR.
Впервые проведено сравнительное изучение восприимчивости различных типов легочных клеток у мышей CD-I и крыс Wistar при инфицировании
10 вирусом гриппа in vitro. Показано, что восприимчивость и вирус-продуцирующая способность реснитчатых клеток при их инфицировании вирусом гриппа in vitro значительно выше, чем восприимчивость и вирус-продуцирующая способность альвеолоцитов 1-го и 11-го типов.
Впервые показано, что при инфицировании вирусом гриппа in vivo (1) восприимчивость легких у мышей CD-I выше, чем у крыс Wistar, но ниже, чем у мышей ICR; (2) восприимчивость трахеи у мышей CD-I и крыс Wistar одинакова, но ниже, чем у мышей ICR; (3) у мышей CD-I и ICR восприимчивость легких и трахеи одинакова, тогда как у крыс Wistar восприимчивость трахеи достоверно выше, чем восприимчивость легких.
Впервые установлено, что прямое вируснейтрализующее действие секреторных факторов бронхоальвеолярной эпителиальной выстилки может быть одной из причин существенного снижения вероятности инфицирования вирусом гриппа клеток-мишеней и, следовательно, восприимчивости легких к вирусу гриппа у крыс Wistar.
Впервые разработан и апробирован алгоритм прогнозирования восприимчивости к вирусу гриппа лабораторных животных, характеризуемой величиной ИД5о для респираторных органов (легких и трахеи) при" инфицировании вирусом гриппа in vivo, и рассчитанной с использованием величины ИД50 для клеток легких и трахеи при инфицировании вирусом гриппа in vitro.
Впервые обнаружено, что прогнозируемая восприимчивость легких к вирусу гриппа у крыс должна быть существенно выше, чем наблюдаемая в эксперименте, то есть прогнозируемая ИД5о была меньше, чем ИД5о для легких, определенная при аэрогенном инфицировании крыс вирусом гриппа, что обусловлено наличием у крыс выраженной вируснейтрализующей активности секреторных факторов бронхоальвеолярной выстилки.
Впервые установлено, что прогнозированные и экспериментально полученные при аэрогенном инфицировании вирусом гриппа величины ИД50 для трахеи крыс, а также для легких и трахеи мышей статистически совпадают.
Следовательно, разработанный и апробированный нами алгоритм прогнозирования может быть использован для прогноза восприимчивости in vivo к вирусу гриппа тех органов, в которых внеклеточные защитные (барьерные) факторы существенно не уменьшают вероятность инфицирования клеток-мишеней.
Практическая значимость работы. Изучение параметров инфекционности вируса гриппа на модельных животных позволит заблаговременно выявлять штаммы, потенциально способные вызывать масштабные эпизоотии. Это даст возможность контролировать эпизоотическую ситуацию в птицеводческих и животноводческих хозяйствах. Параметры вирус-клеточных взаимодействий, полученные с использованием первичных культур клеток респираторных органов животных и человека, совместно с параметрами инфекционности вируса гриппа у модельных животных in vivo, в дальнейшем, после того как будут разработаны методики оценки инфекционности вируса гриппа в первичной культуре клеток легких человека, позволят заблаговременно определять потенциальную восприимчивость человека к новым штаммам вируса гриппа, циркулирующим среди животных и птиц. Предложенный метод прогнозирования в будущем даст возможность; количественно оценивать восприимчивость человека к новым штаммам вируса гриппа животного происхождения до их перехода в человеческую популяцию, и тем самым повысит вероятность раннего выявления пандемичного штамма и ускорит разработку эффективных противоэпидемических мероприятий. Кроме того, после дальнейшего совершенствования методической основы прогнозирования восприимчивости человека к вирусу гриппа, этот метод может быть использован для оценки потенциальной эффективности разрабатываемых противовирусных препаратов для лечения гриппозной инфекции у людей.
Положения, выносимые на_защиту: 1. Первичная суспензионная культура клеток легких и трахеи лабораторных животных содержит основные типичные для этих органов клетки, в том числе
12 восприимчивые к вирусу гриппа, и способна продуцировать вирус гриппа при культивировании не менее трех суток.
Защитные секреторные факторы бронхоальвеолярной поверхностной выстилки у крыс могут существенно снижать восприимчивость легких к вирусу гриппа при аэрогенном заражении посредством прямого вируснейтрализующего воздействия.
Показатели восприимчивости к вирусу гриппа для суспензионных первичных культур легочных клеток лабораторных животных {in vitro) могут быть использованы для прогноза базовой (клеточной) видоспецифической восприимчивости легочных клеток-мишеней к вирусу гриппа in vivo без учета вмешательства внеклеточных факторов бронхоальвеолярной выстилки.
Показатели восприимчивости к вирусу гриппа для суспензионных первичных культур клеток трахеи лабораторных животных {in vitro) могут быть использованы для адекватного прогноза восприимчивости трахеи при заражении этих животных вирусом гриппа in vivo.
Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены в десяти докладах и обсуждены на "трех отечественных и четырех зарубежных конференциях:
Biological Medical Defense Conference of prophylaxis and treatment of BW health disorders; Oct 29-30, 2003; Munich, Germany;
Biological Medical Defense Conference; October 20-21, 2004; Munich, Germany;
Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний; Международная конференция; 8-10 сентября 2004; Сосновка, Новосибирская область, Россия;
Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты; Всероссийская конференция; 5-7 октября 2004; Новосибирск, Россия;
Microbes in a changing world; XIII International Congress of Virology; Jul 23-28 2005; San Francisco, California, USA;
13 2-я Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование
Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда», 10 - 13 мая 2005,
Пущино, Россия;
Biological Medical Defense Conference; October 26-27 2005, Munich, Germany.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных статей, из них 6 - в журнале Вестник РАМН (2004, 2006, 2007) и 2 - на сайте электронного журнала в Интернете (16pdf.phtml, .
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах, содержит 7 рисунков и 13 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 60 отечественных и 290 зарубежных источников.
Вклад автора в диссертационную работу. Весь материал, представленный в диссертации, получен и проанализирован лично автором под руководством и при участии к.т.н. Жукова В.А. и к.б.н. Шишкиной Л.Н. Исследования с применением световой и электронной микроскопии были проведены при помощи и непосредственном участии профессора Рябчиковой Е.И., д.м.н. Малковой Е.М. и ст. лаборанта Филипповой Ю.С. Аэрозольные исследования были проведены с участием к.б.н. Пьянкова О.В. и н.с. Киселева С.А. Биохимические методы были выполнены при участии к.б.н. Плясунова И.В. Вирусологические исследования были проведены с помощью н.с. Петрищенко В.А., а также инженеров Окуловой Л.М., Копыловой Е.О. и ст. лаборантов отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций Кириченко Т.Б., Прудниковой Н.В., Соловей И.М., Генераловой Т.И.
Всем перечисленным сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» автор выражает огромную и искреннюю благодарность.
Использование первичных и перевиваемых культур клеток для изучения инфекционности вирусов
Опубликовано множество работ, посвященных изучению вирус-клеточных взаимодействий на моделях первичных культур клеток, выделенных из органов-мишеней хозяина. Некоторые из исследований вирусов проведены с использованием первичных культур макрофагов [Johnson and Griffin, 1978; Theis and Koprowski, 1961; Kennedy et al., 1989]. Ряд исследований направленны на изучение корреляции между восприимчивостью хозяина и восприимчивостью макрофагов к макрофаготропным вирусам. Показано, что для вируса Марбург в развитии инфекционного заболевания первостепенную роль играют клетки системы мононуклеарных фагоцитов [Bosio et al., 2003]. Эти клетки являются клетками-мишенями для этого вируса.
Исследования, проведенные Johnson, демонстрируют, что изменения в чувствительности макрофагов к герпесвирусной инфекции связано с возрастом [Johnson, 1964]. При периферическом инфицировании мышей вирусом HSV-1 развитие возрастной зависимости резистентности к энцефалиту была впервые описана Andervont в 1929 году и позднее подтверждены остальными [Andervont, 1929; Kilbourne, 1951; Lennette and Koprowski, 1944; Ruchman, 1954]. Установлено, что чувствительность мышиных макрофагов к вирусу мышиного вирусного гепатита (MHV-3) находится в тесной связи с чувствительностью различных линий мышей к этому вирусу [Verilizer and Allison, 1976]. Резистентность A2G мышей к различным миксовирусам приписывают единственному доминантному гену, определенному как Мх [Lindenmann et al., 1963; Lindenmann, 1964]. Мыши проявляют резистентность к нейротропным штаммам вируса гриппа, введенным интрацеребрально, и к гепатотропным штаммам, введенным интраперитонеально [Haller et al., 1976]. Попытки определить фенотипическую экспрессию гена Мх были безуспешны. Ингибиторы вируса гриппа не были обнаружены ни в жидкостях организма невосприимчивых мышей, ни в тканевых экстрактах. Однако различий в способности вируса реплицироваться in vitro в фибробластах, клетках почек, нервных клетках полученных из резистентных и восприимчивых к вирусу гриппа мышей не было обнаружено [Lindenmann et al., 1963; Lindenmann et al., 1978]. В условиях иммуносупрессии организм мышей терял резистентность к вирусной инфекции [Haller et al., 1976]. Инфекция макрофагов, вызванная лентивирусами, и соответствующая патологическая картина в тканях органов-мишеней также связана с генетическими факторами [Kennedy et al., 1989]. Макрофаги и микроглия в центральной нервной системе являются главными клетками-мишенями при инфицировании вирусом висна во время эпизоотии исландских баранов. После экспериментального заражения исландских баранов вирусом висна он часто идентифицируется в макрофагах. Инфекция в макрофагах исландских баранов часто вызывает бурное воспаление в ЦНС с болезненной смертью. Однако при интрацеребральном введение вируса висна британским баранам, инфекционный процесс в макрофагах протекал в абортивной форме, не вызывая гибели живоных. В ЦНС таких животных было обнаружено только временное околожелудочковое лимфоцитарное воспаление и небольшие локусы демиелинизации с последующим рубцеванием [Kennedy et al., 1989].
Вирус гриппа, взаимодействуя с легочными макрофагами, адсорбируется на поверхности и проникает внутрь клетки благодаря процессу фагоцитоза, но размножения вируса не происходит [Wells, 1978; Lemercier et al.,1979; Sweet, 1985; Hofmann, 1997]. Однако рядом ученых было показано, что взаимодействие альвеолярных макрофагов с вирусом гриппа не ограничиваются адсорбцией и фагоцитозом. После заражения в макрофагах обнаруживается начальная стадия синтеза вирусных белков, однако далее синтез прерывается, что приводит к остановке вирусного репликационного цикла. Кроме того, установили, что способность некоторых штаммов инфицировать и реплицироваться в альвеолярных макрофагах хорьков может быть связана с их вирулентностью in vivo и может играть роль в определении развития патогенеза [Kaufmann et al., 2001; Hofmann et al., 1997; Riser and Maassab, 1990].
Клетки могут быть временно пермиссивными или полупермиссивными, вследствие чего вирус либо сохраняется в клетках до момента, когда они становятся пермиссивными, либо вирусное потомство образуется только в немногочисленных клетках популяции. Этот вид инфекции одними исследователями был определен как рестриктивный (restrictive), другими — как ограниченный (restringent) [Ройзман Б., 1989]. Примеры рестриктивной инфекции наблюдали в полупермиссивных клетках обезьян с вирусом энцефаломиокардита, а также у менговирусов в разных клетках [Dubois, 1977; Prather and Taylor, 1975]. Множество работ посвящено изучению ограниченной инфекции, вызванной аденоассоциированным вирусом в первичной культуре клеток почки африканской мартышки [Buller et al., 1979].
Для изучения взаимодействия вируса гриппа с восприимчивыми клетками in vitro в качестве модельной системы широко используют перевиваемые культуры клеток, например, MDCK [Condit, 2001]. В последнее время работы, связанные с изучением вирус-клеточных взаимодействий для вируса гриппа проводят также с использованием первичных культур клеток воздухоносных путей млекопитающих, так как эти клетки являются первичными клетками-мишенями для вируса гриппа в естественных условиях [Matrosovich, 2004; Imbricevic, 2006].
Клетки-мишени для вируса гриппа
Необходимым условием размножения вирусов является взаимодействие с восприимчивыми клетками хозяина. Входными воротами для вируса гриппа является дыхательная система. Таким образом, вирус гриппа, попадая в организм хозяина, в первую очередь контактирует с клетками слизистой дыхательной системы.
Количественные соотношения различных типов клеток в органах дыхания до настоящего времени изучены недостаточно. Это объясняется тем, что под световым микроскопом при обычных гистологических окрасках достоверно идентифицируется только часть клеток. При электронномикроскопических исследованиях клетки идентифицируется, но в ультратонкий срез их попадает небольшое количество, поэтому для оценки их встречаемости необходимы трудоемкие серийные исследования.
Морфометрические методики, позволяют определить число клеток и клеточные характеристики в альвеолярном регионе и воздухоносных путях, однако, эти данные противоречивы [Dormans, 1983; Chang et al., 1986; Stone et al., 1992;Merser, 1994].
Дыхательная система состоит из воздухоносных путей и альвеолярной области. Воздухоносные пути животных и человека подразделяются на верхние и нижние отделы. К верхним традиционно относят полость носа, носоглотку, ротоглотку и часть глотки. В состав нижнего отдела воздухоносных путей входит гортань, трахея, вне- и внутрилегочные главные бронхи. Главные бронхи ветвятся на долевые, сегментарные и на более мелкие вплоть до терминальных бронхиол. Трахея со стороны просвета выстлана клетками: реснитчатыми, секреторными, базальными, щеточными. Стенки крупных бронхов со стороны просвета выстланы многорядным реснитчатым эпителием, в котором выделяют 3 типа клеток: базальные, реснитчатые и бокаловидные эпителиоциты. На одну бокаловидную клетку приходится 5 реснитчатых [Быков В.Л., 2001].
Количество реснитчатых клеток у крыс увеличивается в дистальном направлении от трахеи до перефирических внутрилегочных бронхов. В проксимальной части трахеи их только 17% от всех эпителиальных клеток; в дистальной части реснитчатых клеток 33%, в начальных бронхах - 35%, в главных внутрилегочных - 53%, а в периферических внутрилегочных - 65% от всех эпителиальных клеток [Dormans, 1983]. Базальные клетки в первых 4-х генерациях воздухоносных путей дистальнее трахеи занимают 30%) от эпителиальных клеток у человека и 2% - у крыс [Merser, 1994].
Для определения числа клеток в воздухоносных путях Stone с соавторами взяли крыс массой 230-280 г. Были изготовлены серийные 1,5 мкм срезы и окрашены для световой микроскопии. Авторы рассчитали число клеток в альвеолярной и неальвеолярной тканях [Stone et al., 1992]. Было .установлено, что у крыс 87% объема легких занимает респираторный отдел. Из них 6% -ткань, которая содержит 725x10б клеток. Нереспираторный отдел составляет 13% общего легочного объема, из которых 23% - ткань, содержащая 250хЮ6 клеток. Таким образом, легкие крысы содержат в среднем 975x106 клеток, из которых 74% располагаются в респираторной ткани и 26% - в нереспираторной ткани. По данным Mercer и соавторов (1994) общая площадь поверхности воздухоносных путей от трахеи до бронхиол у крыс составляет 27,2±1,7 см , у человека - 2471±320 см , общее число эпителиальных клеток в воздухоносных путях - 0,05x109 - у крыс и 10,5x109 - у человека. У обоих видов альвеолярных клеток в 18 раз больше, чем бронхиальных [Mercer et al., 1994]. Общая поверхность легких мыши составляет 5,4 м2/кг массы животного, в тоже время О поверхность легких крысы составляет 3,3 м /кг массы животного [Трахтенберг И.М.идр.,1991].
В таблице 2 приведены результаты объемного распределения эпителиальных клеток в воздухоносных путях и дистальном респираторном отделе легкого крысы, полученные Ling-Yi Chang с соавторами в 1986 году.
Эпителий воздухоносных путей и респираторной области состоит из множества отличающихся морфологически и функционально типов клеток [JefferyandLi, 1997].
Реснитчатые (цилиарные) клетки - наиболее многочисленные; своими суженными базальными концами они контактируют с базальной мембраной, на расширенном апикальном полюсе имеются длинные реснички (в клетках выстилки носа их число равно 15-20, трахеи - 100-250). Биение ресничек (с частотой до 25/сек) направлено в сторону носовой полости [Быков В.Л., 2001], оно способствует выведению слизи и осевших на ней пылевых частиц, что препятствует проникновению частиц в респираторный отдел легких [Афанасьев Ю.И. и Юрина Н.А., 2002]. На движение ресничек большое влияние оказывает температура окружающей среды, а также концентрация ряда веществ. При высокой концентрации водородных ионов колебания ресничек угнетаются. В связи с тем, что потребление Ог мерцательным эпителием прямо пропорционально скорости колебания ресничек, высокая концентрация СОг замедляет движение ресничек. Реснитчатые клетки имеют разнообразные рецепторы, такие как адренорецепторы, холинорецептры, рецепторы глюкокортикоидов, гистамина, аденозина и другие. По" мере уменьшения просвета воздухоносных путей высота реснитчатых клеток снижается [Афанасьев Ю.И. и Юрина Н.А., 2002].
Бокаловидные клетки - одноклеточные эндоэпителиальные железы, которые вырабатывают слизь, обладающую антимикробными свойствами. В ней содержатся иммуноглобулины, выделяемые плазматическими клетками из подлежащей под эпителием собственной пластинки соединительной ткани [Афанасьев Ю.И. и Юрина Н.А., 2002]. Эти клетки - призматические, однако, их форма зависит от степени наполнения секретом. Ядро располагается в базальной части, над ним крупный комплекс Гольджи, от которого отделяются пузырьки слизи, накапливающиеся в апикальной части и выделяющиеся посредством экзоцитоза.
Оценка жизнеспособности клеток при длительном культивировании
В препаратах, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову, при увеличении 1000 в световом микроскопе Axiovert-40 (Цейс, Германия) оценивали процентное содержание различных типов клеток: реснитчатых эпителиальных клеток (Рэ), бокаловидных эпителиальных клеток (Бэ), альвеолоцитов I и II типов (AI и АН), недифференцированных эпителиальных клеток (Нэ), а также макрофагов-моноцитов (Мф), нейтрофилов (Нф), эозинофилов (Эф), лимфоцитов (Лф) и прочих (Пр). Идентификацию клеток при световой микроскопии осуществляли на основе характерных для них морфологических признаков [Абрамов М.Г., 1979; Koss, 1979; Кост Е.А., 1979].
Реснитчатые эпителиальные клетки имеют крупные размеры, сохраняют цилиндрическую форму, цитоплазма ацидофильна. Крупное, круглое без инвагинаций ядро интенсивно окрашивается основными красителями, часто встречается глыбчатое распределение хроматина, лежит в центральной или базальной части клетки. Для апикальной поверхности характерно наличие ресничек, которые сохраняются частично или полностью и являются основным признаком для идентификации клетки.
Бокаловидные эпителиальные клетки имеют крупные размеры, сохраняют форму близкую к цилиндрической. Крупное пятнистое ядро круглой или овальной формы, с ровными контурами, локализуется базально. Апикальная часть клетки расширена и содержит крупные гранулы слизи, на цитологических препаратах сохраняется плохо, однако клетку можно идентифицировать по сохранившимся оптически прозрачным вакуолям.
К недифференцированным эпителиальным клеткам относятся клетки, имеющие крупные ядра, характерные для бронхиальных эпителиоцитов и сохранившуюся цитоплазму. Сложность идентификации этих клеток связаны с изменениями ее формы и частичным разрушением цитоплазматической мембраны.
Альвеолоциты I типа на цитологических препаратах имеют округлую форму, поверхность клетки неровная, цитоплазма слабо эозинофильная (светло-розовая). Ядро небольшое круглое, плохо воспринимает окраску, практически сливаясь с окружающей цитоплазмой.
Альвеолоциты II типа - небольших размеров, их форма кубическая (редко) или округлая (чаще). Ядро небольшое, круглое, интенсивно, равномерно окрашено. Цитоплазма яркая, азурофильная, видны темные точечные включения или единичные светлые вакуоли.
Макрофаги варьируют в размерах, преобладают небольшие круглые клетки. Ядро маленькое, эксцентричное, цитоплазма имеет пенистый вид (много оптически прозрачных вакуолей) и множественные гетерогенные включения, азурофильна. Моноциты отличаются четким, более крупным бобовидным ядром, меньшим количеством цитоплазмы, единичными вакуолями, большей ацидофильностью цитоплазмы.
Лимфоциты - мелких и средних размеров клетки, в которых ядро занимает значительную часть клетки. Ядро круглое, гомогенно и интенсивно окрашивается. Цитоплазма в виде тонкого ободка, базофильна. Плазматические клетки овальные, имеют эксцентричное ядро со специфическим распределением хроматина.
Нейтрофилы - клетки небольших и средних размеров 10-12 мкм, отличаются сегментарными ядрами, которые интенсивно, равномерно окрашиваются. По наличию специфических гранул в цитоплазме отличаются эозинофилы и базофилы.
Эозинофилы - клетки крупнее нейтрофилов 12 мкм в диаметре. Ядро часто состоит из двух сегментов, реже 3 и более. Цитоплазма слегка базофильна, содержит крупную, ярко окрашенную эозином зернистость.
Прочие клетки - ядросодержащие клетки, которые при данных условиях окраски и микроскопирования препаратов нельзя было с уверенностью отнести к тому или иному определенному типу клеток.
Методом ультратонких срезов изучали репродукцию вируса гриппа в суспензионных первичных клеточных культурах легких и трахеи у мышей CD-1, ICR и крыс Wistar. Для этого осадок клеток после центрифугирования фиксировали 4% раствором параформальдегида (в качестве буфера использовали раствор Хенкса) при 4 С в течение 24-48 часов. Затем препараты дофиксировали 1% раствором осмиевой кислоты и обезвоживали по стандартной методике в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, Заливали в смесь эпон-аралдит и проводили полимеризацию в течение 48 ч [Уикли Б., 1975]. Ультратонкие срезы готовили с помощью стеклянных ножей на ультратоме Райхерт-Янг (Австрия), монтировали на медные палладированные сетки и контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и 2% расвором цитрата свинца. Срезы изучали в электронном микроскопе Н-600 (Хитачи, Япония) при увеличениях 5000-30000.
Полученную суспензию легочных клеток лабораторных животных разводили средой DMEM/F12 с 0,5% эмбриональной сыворотки до концентрации 1-2 млн/мл. Затем клетки разрушали посредством 3-кратного повторения процедуры замораживания и оттаивания при -20 С в течение 3 суток. Различные разведения ВАЖ в среде Игла-Мем в объеме 0,1 мл добавляли к 0,9 мл клеточного дебриса, полученного от 1-2 млн. клеток/мл. Полученную суспензию разливали по 0,5 мл в пробирки и инкубировали при 37 С в течение 36 часов. В образцах определяли концентрацию вируса через 0, 3, 6, 24, 30 и 36 часов инкубации.
Константу скорости инактивации вируса kj определяли на основании данных по инактивации вируса в дебрисе клеток за 3 и 6 часов инкубации, полагая, что уменьшение концентрации вируса V(t) в момент времени t описывается экспоненциальной функцией V(t) = V(0)xe"kl . где V(0) -концентрация вируса в начальный момент времени t=0.B этом случае константа вычисляется по формуле ki = -[lnV(t2) - InVCtt)] -!!), (1), где tj t2 - два последовательных момента времени измерения концентрации в процессе инкубации вируса
Оптимизация условий культивирования первичной суспензионной культуры клеток, выделенной из легочной
Как следует из литературных данных [Ройзман Б., 1989] и подтверждается собственными экспериментальными данными (таблица 6), динамика продукции вируса в клеточной культуре состоит из 3-х фаз (рисунок 7).
На протяжении первой фазы (эклипса и созревания вируса) концентрация вируса возрастает до некоторого значения Vs, которое остается неизменным (в пределах точности измерения) на протяжении второй - стационарной - фазы, когда скорости продукции и инактивации вируса уравновешиваются. Во время третьей фазы концентрация вируса убывает до нуля. Значение концентрации Vs 1-я фаза соответствует фазам эклипса и созревания вируса; 2-я фаза соответствует стационарной фазе продукции вируса; 3-я фаза - фаза инактивации вируса; Vs — максимальная стабильная концентрация вируса для всей стационарной фазы продукции вируса. может служить достаточно точной оценкой множественности вирусной массы, наработанной одной клеткой во время первой и третьей фаз. Поскольку в первой фазе скорость инактивации меньше скорости наработки вируса, а в третьей фазе скорость наработки существенно меньше скорости инактивации, то в первом случае можно пренебречь инактивированным вирусом, а во втором случае - наработанным. Однако очевидно, что значение Vs не может быть использовано для оценки количества инфекционного вируса, произведенного во время второй фазы (как правило, наиболее длительной по сравнению с двумя другими), когда скорости инактивации и продукции уравниваются. Для более корректной оценки урожайности вируса надо учитывать количество вирусных частиц, инактивированных во время второй фазы.
Обозначим: v - объем, в котором происходит культивирование инфицированных клеток; t, 0 t Т — момент времени из интервала [0, Т], в течение которого клетки продуцируют инфекционный вирус; 0 - соответствует времени инфицирования, Т - соответствует времени окончания вируспродукции; N - количество инфекционных вирусных частиц, которое производит одна клетка после заражения за время Т; [ti, \ї\ - интервал времени, соответствующий стационарной фазе продукции инфекционных вирусных частиц; r(t) - скорость репродукции вируса в момент времени t; i(t) - скорость инактивации вируса в момент времени t; n(t) - количество вирусных частиц, произведенных одной клеткой и не инактивировавшихся к моменту времени t; ns - количество вирусных частиц, произведенных одной клеткой и не инактивировавшихся к моменту времени из интервала [ti,t2], когда наблюдается стационарная фаза продукции вируса; V(t) -концентрация не инактивированных вирусных частиц в момент времени t; Vs - концентрация не инактивированных вирусных частиц во время стационарной фазы продукции вируса.
Общая скорость изменения количества инфекционных вирусных частиц состоит из скорости продукции и скорости инактивации вируса dn(t)/dt = r(t)-i(t).
Вывод последующих формул проводится на основе предположения, что инактивация вируса подчиняется экспоненциальному закону. В этом случае скорость инактивации вируса пропорциональна количеству не инактивированного вируса, i(t) = k,xn(t), где kj 0 — константа скорости инактивации. Количество вируса, произведенного клеткой, может быть определено по формуле: N = оГ r(t)dt, где ol dt - определенный интеграл с пределами интегрирования 0 и Т.
Разобьем область интегрирования на 3 подобласти [0,tj), [ti,t2) и [t2,T], соответствующие увеличению, сохранению на постоянном уровне и уменьшению количества инфекционного вируса, и представим выражение для N в виде суммы 3 интегралов: = Jnr(t)dt + tlJt2r(t)dt +t2Fr(t)dt = = 0r[r(t)-i(t)+i(t)]dt + tlf r(t)dt +t2rr(t)dt= = (ArOO-Kt)] + оГ4(1)Л + til dt +t2Fr(t)dt = = ns +0Jui(t)dt + tifr(t)dt +t2Fr(t)dt. Рассмотрим стационарную фазу продукции вируса. В этой фазе количество не инактивированного вируса постоянно и равно Cs, и общая скорость изменения количества вирионов dn(t)/dt = r(t) - i(t) равна 0, так как скорость продукции вируса равняется скорости инактивации вируса p(t) = i(t), а последняя остается постоянной в интервале времени стационарной скорости продукции вируса и равняется i(t) = ki n(t) = kj ns. Отсюда, r(t) = ki ns. Подстановка последнего выражения во второй интеграл в выражении для Мдает N = ns +0Jui(t)dt + ufV ns dt +t2fr(t)dt. Приближенная оценка для N следует, если в последнем выражении пренебречь 1-ми 3-м интегралами и проинтегрировать 2-й интеграл, N = ns + nsxkiX(t2,) (3). Количество ns вирусных частиц, произведенных одной клеткой и не инактивировавшихся к моменту времени из интервала стационарной фазы можно вычислить по формуле ns = vxVs/(vxV0xln2/KWl,5o) = Vs/(V0xln2/KHA50), где выражение в числителе дроби равняется количеству инфекционного вируса в объеме v среды культивирования, измеренного во время стационарной фазы, а выражение в знаменателе равняется количеству инфицированных клеток в объеме v среды культивирования.
