Введение к работе
Актуальность проблемы
Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), несмотря на определенные успехи в вакцино- и химиопрофилактике, остаются одной из самых актуальных медицинских и социально-экономических проблем. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных; из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет около 86% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями. В течение 2005-2009 гг. выявлены изменения в эпидемиологии гриппа животных. Продолжают возникать случаи заболевания людей, вирус распространился географически на новые страны. Так, особую актуальность приобретает грипп птиц. Грипп птиц - высококонтагиозная вирусная инфекция, которая может поражать все виды пернатых. Для птиц грипп является энтеральной инфекцией, при которой поражаются паренхиматозные органы, особенно селезенка, и легкие. К настоящему времени известно, что носителями вируса гриппа птиц H5N1 могут являться практически все известные дикие птицы водного и околоводного комплекса [Киселев О.И., 2008]. В значительно меньшей степени среди птиц на данный момент циркулирует серотип H7N7 (вирус «чумы птиц»), последняя эпизоотия была зарегистрирована в 2003 году в Голландии среди домашней птицы. Этим вирусом было заражено 88 человек, работавших на птицефермах, у которых диагностировали лишь коньюктивит. Домашние птицы, особенно куры и утки, высоко восприимчивы к штаммам вируса гриппа серотипа H5N1, летальность от которых доходит до 100%. За период с января 2004 года по август 2009 года в мире зарегистрировано 237 случаев птичьего гриппа у людей, вызванных вирусом А/H5N1, из них 137 (58%) закончились летальным исходом [Goidman D, 2009]. Большинство описанных случаев заражения людей происходило при непосредственном контакте с больными птицами.
Эффективность современных вакцин ограничивается постоянно меняющимся антигенным разнообразием вируса гриппа, вектором их действия являются антигенные белки. Поэтому при появлении нового штамма необходимо заниматься созданием новой вакцины, что экономически невыгодно. В связи с этим появление нового фосфолипидного препарата может решить данную проблему за счет воздействия его на липидную мембрану вирионов, липидный состав которой примерно одинаков для всех известных серотипов вируса гриппа.
Цель исследования
Разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения липосом, борных производных адамантана и их комплексов, направленных на лечение и профилактику гриппозной инфекции.
Задачи исследования
-
Оценить возможность использования липосом разного липидного состава для снижения токсичности борных производных адамантана.
-
Определить нетоксический диапазон концентраций и характеристики связывания бораадамантана с липосомами.
-
Выявить механизмы вирусоингибирующего действия борных производных адамантана, липосом и их комплексов в отношении вируса гриппа.
-
Протестировать вирулицидное действие бораадамантана, нативных липосом и комплексов бораадамантана с липосомами на лабораторных животных.
-
Разработать методику определения размера и концентрации липосом.
Научная новизна
Впервые применен нанотехнологический подход к подбору биодеградируемого носителя (липосомы) и нетоксического диапазона концентраций для новой группы противовирусных препаратов – борных производных адамантана (бораадамантана). Определен оптимальный липидный состав нативных липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном для слияния с клетками и вирионами. Для контроля качества нанотехнологического процесса получения липосом был разработан и апробирован на практике новый метод оценки размеров и концентрации липосом. Впервые выявлены физико-химические механизмы, обусловливающие выраженное вирусоингибирующее действие бораадамантана в нетоксическом диапазоне концентраций, связанные с изменением фазового состояния липидной мембраны вириона, а именно, повышение температуры фазового перехода липидов, входящих в состав мембран вирионов. Показано выраженное вирусоингибирующее действие нативных безхолестериновых липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном и выявлен физико-химический механизм данного явления, заключающийся в экстракции холестерина и других липидов липосомами из мембран вирионов. Процесс экстракции был зафиксирован двумя методами: гель-фильтрацией с радиоактивно меченными липосомами и вирионами, и по изменению величины поляризации флуоресцентных зондов. При низкой микровязкости липидных мембран вирионов нормальный процесс слияния вирионов с клеткой невозможен. Вирусоингибирующее действие используемых в работе препаратов доказано достоверным снижением смертности лабораторных животных, зараженных различными дозами (2lg ЭИД/мл, 4lg ЭИД/мл) вируса серотипа, Н5N2 авирулентного для человека, при введении одинаковых доз бораадамантана, липосом и липосом в комплексе с бораадамантаном различными способами.
Практическая значимость работы
Работа имеет прикладное значение. Возможное применение используемых в работе химиопрепаратов для лечения гриппа вызовет снижение заболеваемости в случае эпидемии и пандемии, а также сведет практически на нет необходимость прогнозирования появления нового штамма вируса за счет мутаций, так как вектор вирусоингибирущего действия, используемых в работе химиопрепаратов, направлен на липидную мембрану вируса, а не на антигенные белки, как многие имеющиеся на сегодняшний день лекарственные препараты. Использование наночастиц – липосом в качестве биодеградируемого нетоксического носителя позволяет пролонгировать действие многих противовирусных препаратов. Разработанная методика оценки качества дисперсии липосом позволяет определять размеры и концентрацию липосом и стандартизовать липосомальные дисперсии.
Апробация материалов диссертации и публикации
Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов» (Пермь, 2008), Международной конференции «Органическая химия для медицины» (Черноголовка, 2008).
Апробация диссертации состоялась 19 октября 2009 г. на научной конференции отдела вирусологии ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.
Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, в том числе в 2 журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
