Содержание к диссертации
Введение
2. Современное состояние методов насыщающего иммуноанализа 9
2.1. Общая характеристика насыщающего иммуноанализа . 9
2.2. Аналитические характеристики: 13
- точность 13
- чувствительность 14
- специфичность 19
- достоверность 21
2.3. Методическая база насыщающего иммуноанализа: 21
- очистка лигандов 21
- специфичные антитела 25
- методы разделения свободной и связанной фракций. 29
- меченый лиганд и разновидности насыщающего иммуноанализа 32
2.4. Радиоиммуноанализ: 32
- йодирование белков 33
- введение йода в соединения небелковой природы . 36
- техника радиоиммуноанализа 37
2.5. Альтернативные методы насыщающего иммуноанализа: 39
- энзимоиммуноанализ 39
- кофакторный иммуноанализ 45
- мембранный иммуноанализ 47
- флуоресцентный иммуноанализ 49
2.6. Заключение 50
3. ЭКСПЕШЛЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 54
3.1. Материалы 54
3.2. Препаративные биохимические методы 56
3.3. Синтетические методы 60
3.4. Модификация белков 62
3.5. Иммунохимические методы 65
3.6. Физико-химические и биохимические методы анализа 71
3.7. Обработка данных 74
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 75
4.1. Разработка иммунохимической системы "миоглобин - антитела против миоглобина" 75
- выделение и очистка миоглобина из сердечной мышцы человека 75
-получение антисыворотки против миоглобина человека 77
- специфичность иммунохимической системы "миоглобин-антитела против миоглобина" 80
4.2. Разработка быстрого метода радиоиммуноанализана миоглобин, пригодного для экспресс-диагностики острого инфаркта миокардаток
- введение I в миоглобин 84
- оптимизация системы радиоиммуноанализа 88
- характеристики качества анализа 89
- исследование образцов сыворотки доноров и пациентов; возможность применения метода для диагностики острого инфаркта миокарда 94
4.3. Мембранный иммуноанализ: 101
- получение реакциошспособных липосом и их вза-модействие с белками 101
- комплемент-зависимый лизис липосом, сенсибилизированных миоглобином 109
4.4. Система иммуноанализа на миоглобин с использо
ванием АТР в качестве метки (АТФ-метрический
иммуноанализ) 112
- получение и характеризацил меченого АТР миоглобина 113
- АТФ-метрический иммуноанализ на миоглобин. Ц5
- возможности применения АТФ-метрического иммуноанализа для определения миоглобина и других клинически важных соединений в сыворотке крови. 121
5. Выводы 130
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
- Общая характеристика насыщающего иммуноанализа
- Препаративные биохимические методы
- Разработка иммунохимической системы "миоглобин - антитела против миоглобина"
Общая характеристика насыщающего иммуноанализа
Для иллюстрации принципа насыщающего иммуноанализа можно рассмотреть простейший случай одноцентрового взаимодействия гомогенгде к, -константа скорости образования комплекса, k-i -константа скорости диссоциации комплекса.
На основании закона действующих масс Экинз и соавт. (8-II) получили следующее уравнение для распределения лиганда между свободной и связанной с антителами фракциями:
где RQ/F - распределение, q - начальная концентрация антител, р - начальная концентрация лиганда, к - константа ассоциации, равная k, /k-i , В - концентрация специфически связанной фракции, F - концентрация свободной фракции.
Уравнение [2] описывает гиперболу в координатах RR _ - р (рис. LA) (8-II). Физический смысл имеет участок гиперболы, расположенный в области положительных RB/(_ и р , представляющий собой калибровочную функцию распределения лиганда от его концентрации. Графический вид функции существенно зависит от относительной концентрации антител и значения К . Для практических целей необходима достаточно крутая зависимость RR/F от р , достигаемая при q p (8-Ю) (рис. ІБ), т.е. система должна быть близка к насыщению с тем, чтобы при изменении р Rfi/ менялось бы достаточно сильно. С возрастанием величины К при фиксированном р также увеличивается крутизна зависимости R - от р (8, 9) (рис. IB).
Таким образом, принцип насыщающего иммуноанализа состоит в насыщении специфичных антител возрастающими концентрациями лиганда и измерении его распределения между свободной и связанной фракциями. Внесение в систему стандартного количества меченого лиганда обеспечивает метод регистрации этого распределения по принципу изотопного разбавления. Как уже отмечалось, уравнение [2] получено для случая одноцентрового связывания гомогенного антитела с одновалентным лигандом. Кроме того, в рамках данной модели меченый и немеченый лиганд неотличимы. В реальной иммуноаналитической системе ситуация значительно сложней. Это обусловлено:
а) неоднородностью популяции сывороточных антител, обычно используемых для анализа;
б) поливалентностью многих лигандов, например, крупных белков;
в) различиями между меченым и немеченым лигандом.
Препаративные биохимические методы
До выделения сердце хранили при -40. Перед опытом сердце размораживали 2-3 часа при 6+8. В одном опыте использовали около 100 г мышечной ткани. Все операции проводили при температуре 6-8. Выделение проводили по методу Стоуна и др. (І), в нашей модификации.
Сердечную мышцу отделяли от жира и соединительной ткани, нарезали кусочками объемом около I см3, взвешивали и заливали бидис-тиллированной водой, охлажденной до 6-8 (1:2 вес к объему). Гомогенизировали в механическом микроизмельчителе тканей ( Homogeniser type 302, ПНР) в течение 8-Ю мин, охлаждая стакан микроизмельчителя на ледяной бане. Гомогенат оставляли на I час при постоянном перемешивании для более полной экстракции и центрифугировали на центрифуге G-2I (Beckman, США) I час при 12000 об/мин (ротор 12). Осадок отбрасывали, а водный экстракт подвергали ступенчатому фракционированию сульфатом аммония при 60$, 70$ и 100$ насыщения и рН 6,0 (необходимое значение рН поддерживали добавлением 2% уксусной кислоты или 2N НаОН). На каждой ступени насыщения после добавления сульфата аммония экстракт инкубировали в течение 8-12 часов для формирования осадка, отделяли осадок центрифугированием на G -21 60 мин при 12000 об/мин (ротор 12), а супернатант подвергали дальнейшему фракционированию.
Осадок после 100$ насыщения переносили в диализный мешок и диализовали ночь против 10 л 0,005 М трис-нсі рН 7,5. Полученный раствор отделяли от нерастворившегося материала на стеклянном фильтре и наносили на колонку с Сефадексом G-75 (3x100 см)уравновешенную тем же буфером. Гель-фильтрацию вели со скоростью 10 мл/час, собирали фракции по 10 мл. Фракции, соответствующие объему удерживания около 450 мл и имеющие максимум поглощения при Л = =418-420 нм, объединяли и наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1,5x40 см), уравновешенную 0,005 М трис неї рН 7,5. Скорость нанесения 60 мл/час. Элюировали тем же буфером со скоростью 30 мл/ч. В данных условиях миоглобин слабо сорбируется на ДЭАЭ-целлюлозе и вымывается в первом пике оптической плотности при Л =418-420 нм. Окрашенные фракции собирали, диализовали против бидистиллирован-ной воды и высушивали лиофильно. Выход электрофоретически гомогенного белка, определенный спектрофотометрически (см.разд. 3.6), составил 0,95 мг на I г сердечной мышцы.
Разработка иммунохимической системы "миоглобин - антитела против миоглобина"
Для выделения и очистки миоглобина применили метод Стоуна и др. (І) в нашей модификации.
Согласно оригинальной методике белковый осадок после фракционирования сульфатом аммония длительно диализуют и наносят на ДЭАЭ целлюлозу. После хроматографии собранные фракции концентрируют, и препарат доочищают гель-фильтрацией на сефадексе G-75. В нашей модификации стадии гель-фильтрации и ионообменной хроматографии переставлены местами. В результате отпадает необходимость в длительном диализе и концентрировании. Кроме того, благодаря малому молекулярному весу миоглобина, 17800, удается освободиться от большей части примесных белков еще до ионообменной хроматографии. При ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе миоглобин элюировал-ся 3-4 окрашенными зонами вследствие присущей этому белку гетерогенности на уровне высших структур (147). Для работы выбирали главную зону, составлявшую около 70$ материала, элюирующегося 0,005 М трис неї, рН 7,5 и поглощающего свет в видимой области.
Спектр поглощения полученного препарата миоглобина, переведенного в со-форму, имел характерные максимумы в видимой и ультрафиолетовой областях: при 280 нм (УФ-полоса), 345 нм (б -полоса), 424 нм ( У-плоса или полоса Соре), 540 нм и 578 нм (р и - полосы, соответственно). Соотношения интенсивностей этих максимумов хорошо соответствуют таковым, приведенным в литературе для чистых препаратов миоглобина .
