Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы. 8
Введение. Обзор методов диагностики фитопатогенов 8
Иммунохимические методы 10
Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот 13
Микрочипы (microarray) 14
ДНК маркеры 15
Выбора локуса для видовой дифференциации SCAR-маркерами 19
Методы диагностики, основанные на амплификации нуклеиновых кислот. 21
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ...21
Альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот 33
Методы с флуоресцентной детекцией результатов амплификации 38
Различные подходы к флуоресцентной детекции результатов ПЦР 39
Методы с флуоресцентой детекцией результатов после амплификации 46
Флуоресцентная детекция результатов в других системах амплификации 47
Краткая характеристика фитопагогенов 47
Материалы и методы. 66
Реактивы, оборудование и штаммы микроорганизмов 66
Выделение нуклеиновых кислот и реакция обратной транскрипции 67
Выравнивание нуклеотидных последовательностей, дизайн прапмеров и зондов 68
Полимеразная цепная реакция в формате FLASH
Общая стратегия подбора праймеров 70
Детекция результатов ПЦР 72
Клонирование положительных контролен 73
Результаты и обсуждение. 74
Стратегия диагностики 74
Выбор типа флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР в формате FLASH 75
Адаптация наборов для выделения нуклеиновых кислот 77
Разработка SCAR-маркеров и диагностических тест-систем для видовой дифференцировки фитопато генов 79
Выбор участка генома, подбор праймеров 80
Подбор и апробация зондов, проверка ингибирования ПЦР амплификацией ВК 104
Сравнение существующих диагностических систем с разработанными 109
Апробация тест-систем на полевых образцах 118
Выводы. 122
Литература 123
Приложение 1 140
- Выбора локуса для видовой дифференциации SCAR-маркерами
- Различные подходы к флуоресцентной детекции результатов ПЦР
- Выравнивание нуклеотидных последовательностей, дизайн прапмеров и зондов
- Подбор и апробация зондов, проверка ингибирования ПЦР амплификацией ВК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Диагностика и идентификация патогенов важны в медицине, во многих отраслях сельского хозяйства (растениеводстве, животноводстве и ветеринарии), при контроле за состоянием окружающей среды и т.д. Так, вирозам, бактериозам, гельминтозам и микозам подвержены все без исключения растения. В сельскохозяйственном производстве это грозит большими потерями. Например, при заражении картофеля вирусами урожайность снижается в пределах от 10 до 80% (в зависимости от вируса и сорта картофеля), уменьшается содержание крахмала в клубнях, ухудшаются их качество и товарный вид.
Продовольственная и биологическая безопасность во многом зависит от четкого и постоянного контроля над фитосанитарным состоянием не только окружающей среды в целом, но и сельскохозяйственных растений, продуктов их переработки и кормов. Одним из основных методов осуществления такого контроля является высоко специфичная и эффективная диагностика и идентификация фитопатогенов.
Традиционные методы диагностики болезней растений основаны на
таких подходах как визуальная диагностика болезни по симптомам и по
морфологии возбудителя, микроскопия, использование растений-индикаторов.
Все эти методы позволяют определить болезнь и ее возбудителя, но для этого
требуют выполнения ряда обязательных условий: явного проявления
симптомов (в то время как многие болезни развиваются латентно), больших
затрат времени и средств для выделения патогена в культуру и его
идентификации (в то время как многие фитопатогены сложно культивировать),
наличие теплиц для выращивания растений-индикаторов. Диагностику
фитопатогенов традиционными методами затрудняет также большое
разнообразие и быстрое появление новых штаммов и рас, дающих
нехарактерные симптомы. Сильно затруднена традиционная диагностика при
больших объемах анализируемого материала, например, при проверке на наличие карантинных организмов, когда нужна быстрая детекция патогена с максимальной чувствительностью (Borman et al., 2008; McCartney et al., 2003; Atcins & Clark, 2004; Rosso, 2007; Lopez et al., 2003; Lopez et al., 2009).
Таким образом, сегодня традиционные методы диагностики фитопатогенов далеко не всегда эффективны, что обусловливает необходимость создания и постоянного усовершенствования специфичных и чувствительных тестов, не требующих большого количества материала для анализа и пригодных для рутинной диагностики. Поэтому на смену традиционным методам приходят все более чувствительные молекулярные технологии, такие как различные модификации иммуноферментного анализа (ИФА, чувствительность ~103-105 ед. патогена/мл) и полимеразной цепной реакции (ПЦР, чувствительность -10-Ю2 ед. патогена/мл). Еще в диагностике распространено использование микрочипов, позволяющих одновременно анализировать большое число образцов, а также различать последовательности нуклеотидов с гомологией около 80%. Однако этот метод обладает невысокой, сравнимой с ИФА, чувствительностью и требует сложного и дорогого оборудования.
Использование SCAR-маркеров (sequence characterized amplified region) — ДНК-маркеров, основанных на ПЦР одного локуса, дающей один фрагмент с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов, позволяет четко детектировать и идентифицировать вид или штамм организма по специфической последовательности нуклеотидов фрагментов его генома, метод обладает гораздо большей чувствительностью по сравнению с ИФА, достаточно прост и позволяет существенно сократить время, затрачиваемое на анализ, которое в случае ПЦР не превышает 2-3 часов. Метод ПЦР дает возможность максимально автоматизировать процесс диагностики, а ПЦР «в
реальном времени» (ПЦР-РВ) хотя и требует дорогостоящего оборудования, но
позволяет осуществлять количественный анализ (Saponari et al, 2008; Osman et al, 2008; Gil-Salas et al, 2007; Agindotan et al, 2007; Lopez et al., 2009).
Для рутинной диагностики фитопатогенов в России наиболее оптимальным и перспективным сегодня является метод ПЦР в формате FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization). Этот метод позволяет использовать недорогое, но высококачественное оборудование российского производства, что снижает стоимость оснащения диагностических лабораторий, экономит время анализа и сводит к минимуму риск контаминации рабочего пространства продуктами реакции, неизбежно сопутствующей анализам результатов ПЦР методом гель-электрофореза.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка новой стратегии диагностики фитопатогенов при помощи SCAR-маркеров с детекцией результатов в формате FLASH, что позволяет просто и эффективно детектировать патогенные организмы. В качестве объектов исследования были выбраны 18 фитопатогенов разных систематических групп, являющихся особо важными и/или карантинными организмами (далее К означает, что данный патоген является объектом внешнего или внутреннего карантина в РФ): X, Y, А, М и S вирусы картофеля (Х-, Y-, А-, М- и SBK), вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК), вирус метельчатости верхушки картофеля (ВМВК), вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК), возбудители кольцевой гнили картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus), аскохитоза тыквенных и томатов (Didymella spp.), гнили плодов (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), рака томатов (С. michiganensis subsp. michiganensis), вилта кукурузы (Pantoea stewartii subsp. stewartii, K), бурой гнили картофеля (Ralstonia solanacearum, К), бледная и золотистая картофельные цистообразующие нематоды (Globodera pallida и G. rostochiensis, К), сосновая стволовая нематода (Bursaphelenchus xylophilus, К) и ее вид-двойник (В. mucronatus, К), вирус ризомании сахарной свеклы (Beet necrotic
yellow vein viras). Для контроля корректности выделения РНК и реакции обратной транскрипции также была разработана тест-система на ген актина картофеля.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
Разработать стратегию диагностики фитопатогенов методом ПЦР в формате FLASH.
Создать SCAR-маркеры для детекции фитопатогенов методом FLASH-ПНР по унифицированному алгоритму.
Клонировать и протестировать положительные контроли.
Оптимизировать методы выделения нуклеиновых кислот из различных материалов (культур микроорганизмов, тканей растений, нематод, семян, почвы и т.п.).
5. Разработать регламент производства тест-систем для рутинной
диагностики перечисленных выше фитопатогенов в формате FLASH-ПНР.
Научная новизна и практическая значимость работы. Основным научным результатом исследований является разработка новой стратегии диагностики фитопатогенов при помощи SCAR-маркеров и создание 18 тест-систем в формате FLASH-ПНР. Тест-системы на перечисленные выше патогены в формате FLASH-ПЦР разработаны впервые и не имеют аналогов в нашей стране, а также за рубежом. Во всех тест-системах используются оригинальные прайм еры и зонды. Полученные результаты открывают новые возможности для рутинной диагностики фитопатогенов, в том числе ряда особо вредоносных и карантинных. Впервые продемонстрировано, что зонд типа «молекулярный маячок» разрушается ферментом с 5'-3' экзонуклеазной активностью в ходе элонгации цепи ДНК при ПЦР.
Практическая значимость работы определяется тем, что созданные
тест-системы просты и удобны для рутинного применения и позволяют с
высокой чувствительностью и специфичностью определять детектируемые
фитопатогены. Диагностические системы разработаны в едином формате FLASH-ПЦР, рассчитанном на недорогое оборудование отечественного производства.
Внедрение работы. На базе проведенных исследований создан производственный регламент, на основе которого ЗАО «НПФ ДНК-Технология» наладило опытное производство диагностических наборов на основе разработанных тест-систем (см. приложение). Тест-системы были апробированы во ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха РАСХН (Красково, Московская обл.), во ВНИИ карантина растений МСХ РФ (Быково, Московская обл.), в Научно-практическом центре НАЛ Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству (Самохваловичи, Беларусь), во ВНИИ фитопатологии РАСХН (Бол. Вяземы, Московская обл.), компанией HLB (Нидерланды). Эти тест-системы могут и уже используются в профильных НИИ и лабораториях, осуществляющих фитосанитарный контроль. Тест-системами для карантинных объектов в настоящее время активно пользуются лаборатории службы карантина растений РФ.
Апробации работы и публикации. Результаты работы были доложены
на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и
биотехнология», международной конференции «Грибы и водоросли в
биоценозах», международной научно-практической конференции
«Биотехнология. Вода и пищевые продукты», международном научно-практическом совещании «Паразитические нематоды растений, биоразнообразие, изучение, коллекции», всероссийской научно-координационной конференции «Использование мировых генетических ресурсов ВИР в создании сортов картофеля нового поколения». По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы, включающего 229 названий, и приложений. Работа изложена на 149 машинописных страницах, содержит 36 рисунков и 5 таблиц.
Выбора локуса для видовой дифференциации SCAR-маркерами
ДНК маркеры являются генетическими инструментами, позволяющими решать самые разнообразные задачи, такие как видовая идентификация и генотипирование различных организмов, установление родства, происхождения, эволюционных связей между организмами и их таксонами, картирование генов и признаков, отслеживание интрогрессии генетического материала, селекция с помощью ДНК маркеров и т.д. В основе создания и использования ДНК маркеров лежит геномный полиморфизм различного генезиса. Наличие большого разнообразия ДНК маркеров обусловливается тем, что типы маркеров основаны на различных видах полиморфизма и техниках детекции результатов. Источниками полиморфизма генома могут служить мутации, инделы, а также изменения количества тех или иных повторов. Так, мутации по рестриктным сайтам служат источником полиморфизма для RFLP (restriction fragment length polymorphism; полиморфизм длин рестриктных фрагментов, ПДРФ), CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) и AFLP (amplified fragment length polymorphism) маркеров; мутации по сайтам ПЦР праймеров - для RAPD (random amplified polymorphic DNA), DAF (DNA amplification fingerprinti), AP-PCR (arbitrarily primed-PCR), SSR (imple sequence repeats/simple tandem repeats (микросателлиты), VNTR (variable number of tandem repeat) (минисателлиты) и ISSR (inter-simple sequence repeat) маркеров, a мутации по одному нуклеотиду — для SNP (Single nucleotide polymorphism; однонуклеотидные замены) маркеров (Lam, http://ihome.cuhk.edu.hk/ z045513/ coursematerial/blast.pdf). Типы ДНК маркеров. В основе работы разных типов маркеров лежат три основные техники: рестрикционный анализ, гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР).
К маркерам, в основе работы которых лежит сочетание рестрикционного анализа с гибридизацией специфического зонда, относятся: RFLP и минисателлиты. Способ RFLP анализа сводится к обработке ДПС рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Основными недостатками этого метода являются сложная техника проведения и высокая стоимость анализа. Анализ минисателлитов (VNTR) по технике проведения аналогичен RFLP, однако природа анализируемых фрагментов иная. Минисателлиты представляют собой участки ДНК, содержащие тандемные повторы длиной 10 16 п.н., фланкированные консервативными сайтами рестрикции. Основной причиной полиморфизма длин этих фрагментов является разное количество повторов. Этот тип маркеров обладает высокой степенью полиморфизма и хорошей воспроизводимостью. Следует также отметить, что данный тип маркеров может детектироваться не только при помощи гибридизации, но и ПЦР (Spooner et al., 2005).
К маркерам, в основе работы которых лежит ПЦР, относятся: RAPD, SCAR, ISSR, микросателлиты (SSR/STR). В основе метода RAPD лежит амплификация ДЕЖ с короткими праймерами (около 10 п.н.), случайно выбирающими участки генома (sequence-arbitrary methods). Далее полученные спектры фрагментов разделят методом электрофореза и анализируют. Метод очень-производителен, прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, однако полученные результаты недостаточно воспроизводимы. Поэтому в последние годы этот метод чаще всего используют только на предварительной стадии изучения полиморфизма ДНК. Далее RAPD фрагменты, специфичные для оцениваемого генотипа, картируют и секвенируют, а затем на основе полученных последовательностей конструируют специфичные праймеры, позволяющие амплифицировать определенные охарактеризованные участки генома (sequence characterized amplified region — SCAR). SCAR маркеры позволяют проводить быстрый и довольно простой в исполнении анализ, обладают очень хорошей воспроизводимостью и являются локус-специфичными, кроме того, благодаря использования техники ПЦР, требуют очень малого количества анализируемого материала. Основным недостатком этого метода является необходимость секвенирования маркера. В других методах амплификации ДНК используют праймеры, комплементарные известным транскрибируемым и нетранскрибируемым участкам генома (sequence tagged sites — STS; sequence tags; sequence-dependent markers). Эти методы позволяют оценить полиморфизм экзонов и интронов генов, транскрибируемых межгенных участков рибосомальных генов и нескольких классов повторяющихся последовательностей, среди которых наибольший практический интерес представляют микросателлиты (simple tandem repeats — STR; simple sequence repeats — SSR). Среди STS сегодня наиболее распространенными являются SSR технологии. При амплификации ДНК с праймерами, фланкирующими SSR, получают кодоминантные маркеры, соответствующие множественным аллелям с различным числом тандемных повторов, каждый из которых чаще всего насчитывает от двух до шести нуклеотидов. Существует большое количество методик, позволяющих детектировать микросателлиты: высокоразрешающий электрофорез, денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения (denaturating high-performance liquid chromatography — DHPLC), метод капиллярного электрофореза. Область применения SSR огромна: фингерпринтинг, филогения, восстановление родословных, таксономические исследования, картирование генов.
К маркерам, основанным на сочетании гибридизации с ПЦР, относятся AFLP маркеры. В этом случае к рестриктазным фрагментам ДНК присоединяют короткие последовательности адаптеров, а затем проводят ПЦР-амплификацию с помощью праймеров, узнающих эти последовательности. Этот метод надежен, обладает очень высокой информативностью и может быть автоматизирован, и хотя он дает только доминантные маркеры, гетеро- и гомозиготные формы можно различить по величине сигнала. В последние годы метод AFLP все шире используют для генетического картирования.
CAPS маркеры представляют собой фрагменты ДНК, амплифицированные при помощи специфичных праймеров с последующей рестрикцией ампликонов. Таким образом, CAPS анализ представляет собой сочетание ПЦР с RFPL,
Различные подходы к флуоресцентной детекции результатов ПЦР
Система TaqMan была предложена в! 1991 г. П. Холландом с соавторами и основана на использовании; 5 — 3 -экзонклеазной, активности Taq-полимеразы для. контроля за зффеїо ивностьюпрохождениящиклов НЦР по освобождению в реакционную смесь- флуоресцентной, метки- связанной; с 5 -концевым нуклеотидом зонда (Holland et all,. 1991), В разработке фирм Perkin-Elmer-Applied Biosystems данный ,метод получил название «TaqMan». В реакционную смесь кроме двух обычных праймеров добавляют олигонуклеотидныи зонд, меченый; по 5 -концу флуорофором; и содержащий в своей центральной или 3 -концевой части тушитель флуоресценции.; Более эффективными являются зонды, где тушитель находиться в центральной части. В. качестве флуорофора обычно используют различные производные флуоресцеина и родамина, а также другие красители (даны длины волн возбуждения/испускания в нм): карбоксифлуоресцеин (FAM; 492/520), 6-карбоксиродамин (R6G; 524/557), карбокси-Х-родамин (ROX; 580/605), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA; 546/576), 6-карбокси-4 ,5 -дихлор-2 ,7 -диметоксифлуоресцеин (6-JOE; 520/548), карбоксиродамин (R110; 503/528), цианины (СуЗ, Су5; 550/570 и 649/670, соответственно) и др. В качестве тушителей используют: Dabsyl (поглощение 453 нм), BHQ1 - BHQ3 (поглощение 534, 579, 620 нм, соответственно) и др. Ассортимент красителей постоянно пополняется.
В ходе ПЦР зонд отжигается на центральный участок ампликона между двумя праймерами. Далее на стадии элонгации праймера Taq-полимераза, достигнув 5 -конца зонда, начинает расщеплять его из дуплекса, при этом детектируется флуоресценция высвободившихся флуорофоров; зонд, находящийся в реакционной смеси в свободном состоянии, остается интактным (погашенным). По мере прохождения ПЦР интенсивность флуоресценции реакционной смеси увеличивается. Свободный зонд, находясь в растворе в контакте с тушителем флуоресценции, создает небольшой фоновый уровень флуоресценции (резонансное гашение), который преодолевается по мере накопления свободного флуорофора в реакционной смеси.
Одной из модификаций метода является использование зондов к универсальному шаблону (UT-probe, universal template probe). В этом методе один из праймеров для ПЦР содержит на своем 5 -конце последовательность, комплементарную зонду. В ходе реакции этот праймер отжигается, и с него удлиняется новая цепь ДНК, на которою затем отжигается зонд, который далее разрушается полимеразой, удлиняющей цепь ДНК с другого праймера. Этот метод позволяет использовать один идеально оптимизированный зонд в любой реакции (Zhang et ai, 2003). ПЦР-РВ с зондами типа TaqMan широко применяется в диагностике фитопатогенов (Saponari et al, 2008; Osman et al, 2008; Gil-Salas et al, 2007; Agindotan et al, 2007; Angelini et al, 2007).
Система FRET. Функционирование зондов этого типа основано на резонансном переносе энергии флуоресценции (fluorescent resonance energy transfer - FRET, hybridization probes) (Kubista et al, 2006). В этом случае два олигонуклеотида, специфичные в отношении продукта ПНР, тандемно гибридизуют с продуктом в каждой фазе отжига праймеров. Выше расположенный зонд содержит на своем 3 -конце возбуждающий краситель, а следующий за ним олигонуклеотид мечен по 5 -концу красителем-репортером. Таким образом, в этой системе два упомянутых выше красителя оказываются пространственно сближенными друг с другом после гибридизации с продуктом ПНР. После этого возбуждение сопровождается переносом электронов на акцепторную молекулу, которая испускает кванты света в более длинноволновой части спектра. Интенсивность флуоресценции четко коррелирует с количеством связавшихся зондов, а, следовательно, и с количеством образовавшегося продукта ПЦР. Этот метод в диагностике используется значительно реже (Abu-Halaweh et al, 2005).
«Молекулярный маячок» (molecular beacons) (Tyagi et al, 1998). К 5 - и 3 -концам «молекулярного маячка» присоединены тушитель флуоресценции и флуорохром, соответственно. Последовательности, непосредственно примыкающие к этим красителям, самокомплементарны, поэтому в реакционной смеси такие зонды приобретают структуру типа «стебель-петля», в которой тушитель и флуорохром пространственно сближены, и флуоресценция флуорохрома-репортера сильно подавлена (контактное гашение). В качестве тушителей флуоресценции в этих системах часто используют нефлуоресцирующие хромофоры, которые, получив энергию от флуорофора, рассеивают ее в виде тепла. Область петли зонда содержит последовательность, комплементарную анализируемому продукту ПНР. При температурах более низких, чем температура отжига зонда на продукт ПЦР, структура стебля сохраняется, и «молекулярный маячок» находится в выключенном состоянии. После образования гибрида между зондом и продуктом ПЦР или денатурации зонда тушитель и флуорохром пространственно разделяются, флуорохром начинает флуоресцировать, то есть «маячок» зажигается и начинает функционировать (Kubista et al, 2006). Несмотря на то, что авторы делают упор на отсутствие разрушения зондов за счет 5 -экзонуклеазной активности фермента, в настоящей работе продемонстрировано, что при использовании фермента с этой активностью принцип действия «молекулярного маячка» не отличается от принципа действия TaqMan.
Системы ПЦР-РВ, основанные на «молекулярных маячках», обладают гораздо большей специфичностью, чем система TaqMan и позволяют обнаруживать одиночные замены нуклеотидов в анализируемой ДНК. Кроме того, в отличие от системы TaqMan, они пригодны для качественной оценки содержания продукта ПЦР в реакционной смеси по завершении реакции с помощью флуориметра.
К недостаткам этой группы методов следует отнести необходимость проведения очень тщательного дизайна зондов, для каждого из которых требуется проводить определение индивидуальных профилей плавления. Многие зонды такого типа имеют тенденцию к образованию в процессе рефолдинга после тепловой денатурации альтернативных пространственных структур, что сопровождается резким усилением фоновой флуоресценции со всеми вытекающими отсюда негативными последствиями для чувствительности системы.
Выравнивание нуклеотидных последовательностей, дизайн прапмеров и зондов
В работе были использованы следующие наборы реагентов и реактивы: Rapid DNA Ligation & Transformation Kit, InstA Clone PCR Cloning kit, GeneJet plasmid Miniprep Kit, IPTG, X-Gal, GeneRuler 1 kb DNA ladder, GeneRuler lOObp DNA ladder, («Fermentas», Литва). Трис(гидроксиметил)амино-метан, хлорид натрия, гуанидинтиоцианат, натрия цитрат, натрия лаурил-саркозин, этилендиаминотетроацетат, додецилсульфат натрия, агар бактериологический, LB, хлорид магния, 2-меркаптоэтанол, Tween-20, Triton-XlOO, этанол, изопропанол, ацетон, глицерин, минеральное масло, агароза, бромфеноловый синий, бромистый этидий («Amresco», США). Ампициллин («Синтез», Россия). Фенол сатурированный («Хеликон», Россия). Штамм Esherichia coli XL-1 Blue (Stratagene). Наборы для выделения нуклеиновых кислот «Проба-НК», «Проба-ГС», комплект реагентов для проведения обратной транскрипции, Taq-полимераза, дезоксинуклеотидтрифосфаты, ПЦР-буфер производства ЗАО «НПФ ДНК-технология» (Россия), фермент без 5 -3 экзонуклеазной активности NseqPol (ЗАО «Синтол», Россия).
Все олигонуклеотиды были синтезированы фирмой ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Секвенирование молекул ДНК проводили в ЗАО «НПФ ДНК-Технология».
В работе было использовано следующее оборудование: амплификатор «Терцик», детектор флуоресценции «Джин», термостат «Гном» (ЗАО «НПФ ДНК-технология»), насос с колбой-ловушкой («Литех», Россия). Спекрофотометр Ultrospec 4050 («LKB», Швеция), центрифуга-вортекс Microspin FV-2400 («Biosan», Латвия), шейкер-инкубартор G24 Enwiromental inkubator-shaker («New Brunswick Scientific», США), шейкер IKA-Vibrax-VXR («IKA-Labortechnik», Германия), источник постоянного тока EPS-300 («GE Healthcare», США), камера для горизонтального электрофореза SE-2, система гель-документирования Gellmager2 («Хеликон», Россия), настольная центрифуга MiniSpin («Eppendorf», Германия), термостат В5060 ЕК-С02 («Heraeus», Германия), Германия), рН-метр рН-150М (Россия), трансиллюминатор ЕСХ-15.М («Vilber-Lourmat», Франция). Капиллярный электрофорез проводили на приборе ABI PRISM 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Растения картофеля как здоровые, так и зараженные вирусами, бактериями {Ralstonia и Clavibacter) и вироидом предоставлены ВНИИ картофельного хозяйства имени А.Г Лорха (Московская обл., Красково) и ВНИИ фитопатологии РАСХН (Московская обл., Бол. Вяземы). Вирус метельчатости верхушки картофеля был предоставлен доктором Я. Валконеном (Университет Хельсинки, Финляндия). Нематоды рода Bursaphelenchus и Globodera предоставлены ВНИИ карантина растений МСХ РФ (Быково, Московская обл.). Бактерии родов Clavibacter, Pectobacterium (Envinia), Pseudomonas, Xanthomonas, Ralstonia; грибы родов Fusarium и Phoma предоставлены ВНИИ фитопатологии. Образцы карантинных организмов {Bursaphelenchus, Globodera, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) были предоставлены в инактивированном виде.
Растительный материал и культуры, использованные в работе, проверяли методом ИФА, используя наборы производства фирмы Agdia (США) по протоколу производителя. Для тестирования диагностических систем отбирали растения с разной степенью зараженности. Выделение нуклеиновых кислот и реакция обратной транскрипции Для выделение НК использовали наборы «Проба-НК» (выделение РНК из растительной ткани) и «Проба-ГС» (выделение ДНК). Выделение ДНК из нематод проводили методом кипячения в STE-буфере. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием комплекта реагентов фирмы ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Поиск последовательности нуклеотидов генов различных организмов производили в банке генов GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/). Сравнение соответствующих последовательностей нуклеотидов проводили, выравнивая их с использованием алгоритма Clustal W и путем построения филогенетических деревьев в программе MEGA 4.0 (Tamura et al, 2007) при, помощи метода связывания ближайших соседей (Neighbor Joining, NJ). Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили также с помощью программы BLAST 2.2.18, доступной на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Подбор- праймеров и зондов типа «молекулярный маячок» проводили с помощью программы Oligo 6.71. Для проверки вторичной структуры зондов использовали программу mfold 3.2 (http://mfold.bioinfoirpi.edu). В целях унификации диагностических тест-систем использовали один и тот же состав реакционной смеси (за исключением олигонуклеотидов) и одинаковую программу амплификации. ПЦР проводили по универсальной программе, для оптимизации использовали две температуры отжига праймеров (64С/67С): 93С — 90 сек; 93С — 20 сек, 64С/67С — 5 сек, 67С — 5/10 сек, 5 циклов; 93С — 1 сек, 64С/67С — 5 сек, 67С — 5/10 сек, 40 циклов. Составреакционной смеси для амплификации включал в 35 мкл: 3.5 мкл 10х буфера (750 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 200 мМ сульфат аммония, 0.1% Твин-20), 1 мМ каждого dNTP, 1- мкМ праймеров, 0.1-0.2 мкМ зондов, 2.5 ед. Taq-полимеразы, 5 мкл раствора ДНК и 0.5 мкл раствора плазмиды для внутреннего контроля (ВК, см. Результаты и обсуждение). Для снижения уровня неспецифической амплификации мы применяли разделение реакционной смеси слоем парафина на две части: олигонуклеотиды, буфер и dNTP — в одной, ДНК и Taq-полимераза — в другой. Таким образом, реакция начиналась только после прогрева смеси до 60С.
Подбор и апробация зондов, проверка ингибирования ПЦР амплификацией ВК
После проверки праймеров и оптимизации ПЦР были подобраны зонды для ПЦР в формате FLASH. Для близкородственных видов старались подобрать универсальный зонд к консервативному участку ДНК, так как специфичность тест-системы определяется праймерами.
Для нематод Bursaphelenchus, бактерий С. michiganensis и грибов DidymellafAscochita зонды были подобраны к консервативным регионам ВТС1, для нематод Globodera — к 18S РНК, для бактерии P. carotovorum subsp. carotovorum — к консервативному гену 5.8S рРНК, для бактерий Pantoea и Ralstonia — к консервативным регионам генов flicC и HPRS, соответственно, для ВСЛК, ВМВК, ВНПЖС, МВК и ХВК — к консервативным регионам гена БО, для АВК и YBK — к консервативным З -концевым регионам генома, для ВВКК — к консервативному участку генома, для SBK -— к консервативному участку гена РЗРП, для мРНК гена актина — к консервативному участку экзона 2. Подобранные зонды проверяли, смоделировав вторичную структуру в программе mfold: они должны формировать характерную для «молекулярных маячков» структуру (рис. 34).
Проверка эффективности зондов проводилась методом FLASH-ПЦР с добавлением зонда в количестве 0.1 мкМ. В случае если сигнал был очень мал, пробовали использовать концентрацию зонда 0.2 мкМ, если это не помогало — подбирали другой зонд. На рис. 33 приведены смоделированные вторичные структуры зондов. В таблице 4 суммированы данные о подобранных зондах.
Зонды didyp-dydip3 несмотря на предсказанную вторичную структуру, характерную для «молекулярных маячков», не показали хорошего разгорания. Первый вариант зонда для ВСЛК (LRVp640) оказался неудачным. При фоновом уровне флуоресценции в 100 ед. он не давал разгорания. Несколько-изменив первичную структуру, мы сконструировали второй вариант зонда (LRVp640). Зонд VM2p980 для детекции МВК оказался не очень удачен. Несколько изменив первичную структуру, мы получили зонд VM2p980b, который давал уровень флуоресценции 7 ед. при фоновом уровне 90 ед. и концентрации 0.2 мкМ. К гену репликазы SBK нами были подобрано два зонда: VSlp518 и VSlp590. Первый из них оказался неудачным - высокий уровень фоновой флуоресценции (130) и слабое разгорание, второй, напротив, показал высокий уровень сигнала. Для АВК мы подобрали два зонда VAp510 и Vap480. Первый оказался не очень удачным, так как при фоновом уровне 150 ед. этот зонд демонстрировал очень слабое разгорание. Второй показал разгорание до 9 при фоновом уровне в 150 ед. и концентрации 0.2 мкМ.
Для проверки эффективности ПЦР и отсутствия ингибирования специфической реакции амплификацией ВК мы провели ПЦР в формате FLASH в двух вариантах: с ВК и без него (Табл. 5, Приложение 1). Для этого подбирали такое разведение плазмиды для ВК, при котором ингибирование отсутствовало (исходнаяг концентрация плазмиды 400 нг/мкл). Для систем с температурой отжига праймеров 64 и 67С это разведение составило 10"8 и 10"7 раз, соответственно. Как видно из этих рисунков, положительный сигнал виден при одном и том же разведении (нематоды Bursaphelenchus, МВК, YBK — 10"4, нематоды Globodera, SBK — 10 6, грибы Didymella, бактерии Clavibacter, Ralstonia, Pectobacterium, Pantoea, BMBK, АВК, ВНПЖС — 105, BBKK, XBK, мРНК гена актина — 10"9, BMBK — 10"8) при амплификации как с ВК, так и без него. Это свидетельствует о том, что нет ингибирования специфической реакции амплификацией ВК.
В мире разработано множество тест-систем для диагностики фитопатогенов. В связи с этим возникает вопрос: какие преимущества дает применение FLASH-ПЦР по сравнению с уже имеющимися? При сравнении мы рассмотрим характеристики тест-систем, позволяющие применять их в рутинной диагностике. Помимо классических методов диагностики, в основе применяемых в мировой практике диагностических тест-систем лежат и трудоемкие методы, применяемые в настоящее время только в научных лабораториях, такие как ПЦР-ПДРФ с праймерами к ВТС1-2 для нематод Bursaphelenchus (Han et all, 2008), RAPD-анализ (Braasch et al, 1995), а также, классическая ПЦР с, праймерами к межгенным и внутренним транскрибируемым спейсерам рДНК (Kang et al, 2004; Matsunaga & Togashi, 2004), генам белков теплового шока (Leal et al., 2005) и сателлитной ДНК (Castagnone et al., 2005); для нематод Globodera: ПДРФ-анализ, RAPD-анализ (Diagnostic protocols for regulated pests PM 7/40), ПЦР с оценкой конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (PCR-SSCP) с праймерами к ВТС2 (после ПЦР проводят электрофорез в денатурирующих условиях) (Clapp et al, 2000), ПЦР с праймерами к ВТС (Zouhar et al, 2000); для бактерий рода Clavibacter используют как методы диагностики, основанные на классической ПЦР, так и мультиплекс на 16S-23S ВТС с ВК с праймерами к ДНК картофеля (Pastrik, 2000); ПЦР-РВ/ с TaqMan с праймерами на межгенные спейсеры 16-23S рРНК и 18S РНК картофеля в качестве эндогенного ВК (Bach et al, 2003); гнездовую ПЦР-ПДРФ на 16S рДНК (Lee et al, 1997); ПЦР с праймерами к 16S рРНК с последующей гибридизацией ампликонов с биотинилированными олигонуклеотидными зондами и детекцией результатов в ИФА (Mills&Russel, 2003); гибридизация ДНК.
