Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1 ПЦР в диагностике фитопатогенов 9
1.1.1 Требования к характеристикам диагностических систем, основанным на методе ПЦР. 9
1.1.2 Возможные ошибки и ограничения в применении метода ПЦР для диагностики фитопатогенов 16
1.2 Метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH 18
1.3 Краткая характеристика биологических свойств и вредоносности грибов, являющихся объектами исследования, и трудно сти их идентификации 22
1.4 Системы идентификации исследуемых видов, основанные на методе ПЦР. 28
1.4.1 ПЦР-системы для идентификации видов S. tritici и S. nodorum 28
1.4.2 ПЦР-системы для идентификации видов F. graminearum, К culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. tricinctum, F. poae, F. langsethiae 31
1.4.3 ПЦР-системы для идентификации видов P. striiformis и P. graminis 36
Глава II. Материалы и методы 38
2.1 Материалы 38
2.2 Методы 43
Глава III. Результаты исследований и их обсуждение 49
3.1 Разработка системы идентификации видов S. tritici и S. nodorum 49
3.1.1 Подбор праймеров для идентификации видов S. tritici и S.
nodorum и проверка их видоспецифичности ,д
3.1.2 Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной детекции видов S. tritici и S. nodorum
3.2 Разработка системы идентификации грибов рода Fusarium
3.2.1 Подбор праймеров для идентификации видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae и проверка их видоспецифичности г л
3.2.2 Подбор и проверка ПЦР-зондов для флуоресцентной детекции видов рода Fusarium „.,
3.3 Подбор праймеров для идентификации видов P. graminis и P. striiformis и проверка их видоспецифичности
Выводы 84
Практические рекомендации 85
Список работ, опубликованных по теме
Диссертации 86
Список использованной литературы
- Возможные ошибки и ограничения в применении метода ПЦР для диагностики фитопатогенов
- ПЦР-системы для идентификации видов F. graminearum, К culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. tricinctum, F. poae, F. langsethiae
- Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной детекции видов S. tritici и S. nodorum
- Подбор праймеров для идентификации видов P. graminis и P. striiformis и проверка их видоспецифичности
Введение к работе
Актуальность работы. Болезни сельскохозяйственных растений, вызываемые грибами, наносят существенный ущерб урожаю и приводят к экономическим потерям (Eyal, 1999; Санин и др., 2010). Применение интенсивных технологий при возделывании зерновых культур зачастую приводит к ухудшению фитосанитарной ситуации не только с наиболее распространенными и вредоносными грибами, такими как Septoria tritici и Stagonospora nodorum и возбудителями корневых гнилей и фузариоза колоса из рода Fusarium (Иващенко и др., 2004; Санин и др., 2010), но также способствует расширению ареала и увеличению вредоносности возбудителей ржавчины Puccinia striiformis и P. graminis (Назарова и др., 2008).
Для своевременного применения средств защиты растений от болезней и контроля зараженности зерна фитопатогенными грибами на разных стадиях его производства и переработки необходима их детекция и точная идентификация (Kristensen et al., 2005; Lievens et al., 2005). В полевых условиях предварительный диагноз болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, ставят по проявлению симптомов заболевания, а точную идентификацию возбудителя проводят в лаборатории главным образом по морфологии спор и другим морфолого-культуральным признакам патогена с применением методов микроскопии и культивирования на питательных средах. Однако, морфологические характеристики спор у близкородственных видов микромицетов могут совпадать, а внутри одного вида значительно варьировать. Кроме того, симптомы болезни могут проявляться нетипично или заболевание может проходить в скрытой форме (Пыжикова, 1984; Иващенко и др., 2004; Shcherbakova, 2007). В связи с этим применение более чувствительных методов является актуальным и востребованным в диагностике фитопатогенов.
В последние годы для идентификации и детекции фитопатогенных микроорганизмов все чаще применяется метод ПЦР. Он превосходит традиционные методы по специфичности, чувствительности, быстроте проведения анализа, производительности, и служит их существенным дополнением. Кроме того, его применение не требует глубоких знаний биологии и морфологии исследуемых микромицетов (McCartney et al., 2003; Lievens et al., 2005).
Усовершенствование методов секвенирования и создание электронных баз данных, хранящих информацию о структуре геномов различных фитопатогенов (Geiser et al., 2004; Geer et al., 2010), дает возможность при разработке в идо специфичных прайм еров наиболее полно учитывать и
использовать вариабельность анализируемых последовательностей нуклеотидов. Это обеспечивает высокую специфичность диагностическим системам, создаваемым на их основе.
Среди методов, основанных на полимеразной цепной реакции, одним из наиболее адаптированных для практического применения является метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция). Использование флуорогенных зондов повышает чувствительность метода. Детекцию флуоресценции проводят сразу после окончания амплификации, что существенно ускоряет процесс получения результатов, по сравнению с электрофорезом в геле. Кроме того, при соблюдении правил работы исключается возможность контаминации рабочей зоны продуктами амплификации, а программное обеспечение облегчает сбор и хранение информации о проводимых тестах. Наличие внутреннего контроля (ВК) прохождения реакции повышает надежность метода и позволяет контролировать появление ложноотрицательных результатов.
Метод FLASH-ПНР ранее был применен для создания систем диагностики фитопатогенных вирусов, бактерий, нематод и грибов, в том числе и карантинных (Кулинич и др., 2008; Рязанцев, 2009; Рязанцев и Завриев, 2009).
Цель и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы являлась разработка праймеров и зондов для идентификации грибов -возбудителей септориоза (Septoria tritici, Stagonospora nodorum), фузариозов (Fusarium graminearum, F culmorum, F. sporotrichioides, F avenaceum, F tricinctum, F poae, F langsethiae), желтой (Puccinia striiformis) и стеблевой (P. graminis) ржавчины зерновых культур.
Основные задачи:
-
Выявить в геноме исследуемых грибов локусы, наиболее перспективные для их идентификации.
-
Разработать прайм еры для идентификации и диагностики исследуемых видов.
-
Оптимизировать условия ПЦР с разработанными прайм ерами и проверить их специфичность на изолятах исследуемых видов грибов, собранных на территории РФ.
-
Разработать зонды и оптимизировать условия ПЦР для диагностики возбудителей септориоза и фузариоза в формате FLASH.
Научная новизна исследований. Разработаны высокоспецифичные праймеры для основанной на ПЦР идентификации и диагностики одиннадцати
видов экономически значимых грибных патогенов зерновых культур. Для девяти из них сконструированы зонды и создана система детекции с помощью ПЦР в формате FLASH, что позволило сократить время анализов и обеспечить надежную и точную идентификацию фитопатогенов.
Практическая значимость исследований. Разработанные праймеры и зонды стали основой для создания и внедрения в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология» коммерческих наборов для идентификации и детекции возбудителей септориоза и фузариозов методом ПЦР в формате FLASH, а, впоследствии, и для наборов в формате ПЦР в реальном времени. Праймеры для идентификации возбудителей ржавчины подобраны с учетом требований к системам детекции в формате FLASH и могут быть использованы для разработки таких систем.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Россия, 2008) и на семинаре «Школа молодых ученых и аспирантов по молекулярной биологии - NOVA» (Финляндия, 2008).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Объем работы составляет 105 страниц. В диссертации содержится 9 таблиц и 31 рисунок. Список литературы содержит 154 источника, из них 132 иностранных авторов.
Возможные ошибки и ограничения в применении метода ПЦР для диагностики фитопатогенов
При разработке систем диагностически фитопатогенов на основе метода ПЦР для необходимо учитывать факторы, касающиеся специфичности, чувствительности и производительности диагностической системы. Кроме того, важны такие факторы, как быстрота проведения анализа, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов (Lievens, Thomma, 2005).
Специфичность. Применение любого метода диагностики рассчитано на специфичное определение патогена. Одним из существенных преимуществ молекулярных методов диагностики, по-сравнению с традиционными, является возможность различать близкородственные организмы. Для молекулярной диагностики фитопатогенов в качестве мишеней часто используются консервативные гены, нуклеотидные последовательности которых у близкородственных микроорганизмов зачастую отличаются лишь несколькими нуклеотидными заменами (single-nucleotide polymorphism, SNP). Однако, высокая специфичность методов детекции нуклеиновых кислот, с использованием ПЦР-праймеров и (или) гибридизационных зондов, позволяет выявлять полиморфизм, связанный с этими незначительными различиями (Ward et al., 2004). Это особенно важно для различения близкородственных патогенов.
Очевидно, что специфичность методов детекции нуклеиновых кислот определяется выбором целевой нуклеотидной последовательности. Существует два подхода в выборе гена-мишени. Наиболее распространенный, заключается в выборе такого консервативного гена, для которого известна нуклеотидная последовательность, и который обладает достаточным полиморфизмом. В настоящее время, наиболее часто для диагностики грибов используется рибосомальная РНК (рРНК). Ее интенсивное использование в филогенетических исследованиях привело к накоплению в электронных базах данных нуклеотидных последовательностей этого региона генома для многих видов микроорганизмов (Atkins, Clark, 2004). Это дает возможность проводить более полное сравнение последовательностей и выявлять диагностические регионы, обладающие требуемым уровнем полиморфизма. Кроме того, высокая копийность генов рРНК в любом геноме обеспечивает высокую чувствительность ГЩР при диагностике фитопатогенов. В геноме грибов каждая копия рРНК представлена тремя генами, разделенными внутренними транскрибируемыми регионами (internal transcribed spacers, ITS), которые имеют особое значение для успешной идентификации возбудителей болезней растений. Регионы ITS содержат консервативные и вариабельные области, что позволяет проводить классификацию грибов на разных таксономических уровнях, иногда даже на внутривидовом уровне (Atkins et al., 2003). Тем не менее, нуклеотидные последовательности рРНК не всегда обладают достаточным уровнем вариабельности для различения отдельных видов (Tooley et al., 1996). Поэтому, альтернативно или в дополнение к системам, основанным на различении ITS-регионов, интенсивно исследуется возможность использования генов «домашнего хозяйства», включая гены бета-тубулина (Fraaije et al., 1999), актина (Weiland, Sundsbak, 2000), и фактора элонгации трансляции 1-альфа (O Donnell et al., 1998).
Другой подход в выборе целевой нуклеотидной последовательности для детекции фитопатогенов основан на скрининге произвольных частей генома и выявлении среди них последовательностей, потенциально пригодных для диагностических целей. Это достигается при использовании ряда методов, включая метод произвольно амплифицированной полиморфной ДНК (random amplified polymorphic DNA, RAPD) (Williams et al., 1990) и его аналог - метод полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (amplified fragment length polymorphism, AFLP) (Vos et al., 1995). Однако, локализация полученной таким образом нуклеотидной последовательности в геноме остается неизвестной. Для подтверждения специфичности выявленного фрагмента ДНК необходимо не только сравнение его последовательности с геномами других организмов, но и массовый скрининг коллекции близкородственных видов и видов, занимающих ту же экологическую нишу, что и исследуемый (Schaad, Frederick, 2002).
Чувствительность. Высокочувствительная детекция патогена до заражения растений или до развития симптомов болезни важна для предотвращения их инфицирования или сдерживания развития и распространения заболевания а, следовательно, и для уменьшения экономических потерь. Диагностические процедуры должны обладать достаточно высокой чувствительностью. До открытия методов амплификации нуклеиновых кислот, в частности ПЦР, для обнаружения конкретного организма использовались методы, основанные на применении специфичных гибридизационных зондов. Однако, из-за низкой чувствительности такие методы зачастую приводили к получению «ложноотрицательных» результатов (Ward et al., 2004). Благодаря высокой чувствительности метод ПЦР дает возможность детекции даже следовых количеств ДНК патогена (Ward et al., 2004). Однако, высокая чувствительность метода может приводить к получению «ложноположительного» результата. Поэтому, для обеспечения достоверности получаемых результатов необходимо строгое соблюдение правил постановки реакции, использование контролей, ограждение образцов и реактивов от возможной ДНК-контаминации через аэрозоли, а также наличие отдельных зон для процедур пробоподготовки и анализа продуктов ПЦР (Kwok, Higushi, 1989).
На практике, для принятия решений о проведении мер по защите урожая, методы более чувствительные, чем традиционная ПЦР, вряд ли потребуются, поскольку пороговый уровень инфекции может быть легко детектирован с помощью ПЦР. Однако, для обнаружения карантинных организмов могут потребоваться молекулярные методы, обладающие более высокой чувствительностью.
Мультиппексность. Большинство молекулярных диагностических систем, используемых в фитопатологии, разработаны для определения лишь одного целевого патогена. Поскольку возделываемые культуры зачастую поражаются несколькими патогенами одновременно, разработка мультиплексных тестов, способных детектировать несколько микроорганизмов, стала бы существенным достижением. Первые стратегии применения мультиплексной ПЦР задействовали несколько наборов праимеров в одной реакции. Однако, разработка воспроизводимой мультиплексной системы с возможностью различать несколько ампликонов при гель-электрофорезе имеет серьезные технические затруднения (Henegariu et al., 1997; Elnifro et al., 2000).
ПЦР-системы для идентификации видов F. graminearum, К culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. tricinctum, F. poae, F. langsethiae
Возбудители фузариозов на протяжении жизненного цикла встречаются в форме мицелия в тканях семян и корней растений, спородохий на надземных частях растений, аскоспор и конидий в воздухе, хламидоспор в почве и перитециев на растительных остатках (Snyder, Toussoun, 1965). Нарастание скрытого фузариоза проходит в два этапа: на первом этапе у вегетирующих растений формируется доля зерновок, зараженных в процессе увеличения первичного очага инфекции (генотипические различия по степени колонизации связаны с устойчивостью); на втором - зараженность увеличивается в период от раздельной уборки до обмолота или в результате нахождения влажного зерна на току (первичные генотипические различия в степени колонизации могут нивелироваться) (Шипилова, 1994).
Возбудители желтой и стеблевой ржавчины пшеницы. Виды рода Puccinia являются важными патогенами многих растений семейства Злаковые, однако больший вред причиняют зерновым культурам и особенно пшенице. Например, три вида этого рода отвечают за потери урожая пшеницы: P. graminis, P. striiformis и P. triticina. Вид P. triticina поражает только пшеницу, в то время как P. graminis и P. striiformis имеют относительно широкий спектр растений-хозяев, который включает как пастбищные травы, так и другие дикорастущие злаковые (Liu, Hambleton, 2010; Dean et al., 2012). В зависимости от сорта пшеницы и наличия подходящих погодных условий, потери от ржавчины могут составлять от 10 до 70% урожая (Saari, Prescott, 1985).
В настоящее время в России отмечена тенденция к усилению развития и вредоносности желтой ржавчины, которая в предыдущие 20 лет не имела хозяйственного значения. В Северо-Кавказском районе в 2001-2005 г.г. желтая ржавчина отмечалась ежегодно. Дважды в течение пяти лет заболевание носило умеренный характер (2003 и 2005 г.г.). При благоприятных условиях возможно дальнейшее нарастание заболевания. Доля желтой ржавчины в структуре патогенного комплекса в разные годы составляла 5-22 %. В условиях эпифитотийного развития потери урожая от этой болезни могут варьировать от 20 до 30 % (Назарова и др., 2008).
В последние годы на посевах озимой пшеницы в РФ наблюдается появление стеблевой ржавчины (возбудитель P. graminis), что ранее отмечалось крайне редко. В 2004 - 2005 г.г. значительное поражение растений наблюдалось в Поволжье, Северо-Кавказском и Центрально-Черноземном регионах (Назарова и др., 2008). При возникновении эпидемии стеблевой ржавчины на пшенице потери урожая могут составлять 5-50% (Rees, 1972; Leonard, 2001; Roelf et al., 1992).
Как правило, первые симптомы стеблевой ржавчины проявляются, начиная с фазы колошения-цветения, и достигают массового развития к фазам формирования зерновки, молочной и восковой спелости. Для защиты растений от поздно появляющихся видов ржавчины важна заблаговременность обработки фунгицидами (до естественной инокуляции). Чем меньше срок между обработкой и заражением, тем более эффективной и длительной будет защита. Желтая ржавчина, как правило, проявляется раньше стеблевой и бурой (Санин и др., 2010).
Традиционно идентификация видов рода Puccinia проводится на основании определения растения-хозяина, формы спермогониев (пикниев), морфологии спор и расположения спороношения на растениях (Лекомцева, 2003). Практически, структура видов ржавчинных грибов на злаках изучена только в урединио стадии. В результате этих исследований выделены специальные формы, различающиеся по паразитизму на отдельных родах злаков и физиологические расы - на сортах культурных видов (Наумов, 1939; Дьяков, 1998). Однако было выявлено, что границы между отдельными формами по признаку вирулентности к хозяевам относительны. Так, гриб Р. graminis f. sp. tritici зарегистрирован на растениях, относящихся к 40 родам и 140 видах злаков. Другие формы P. graminis также характеризуются большим спектром поражаемых ими видов злаков. Хотя вид P. graminis имеет в жизненном цикле 5 типов спороношений, отличить его от других видов, которые паразитируют на тех же семействах растений-хозяев, можно только по некоторым морфологическим признакам (Baum, Savile, 1985).
В телиальной и эциальной стадии определение по кругу растений-хозяев также затруднено, поскольку для 35% грибов, развивающихся на злаках, эциальные хозяева неизвестны (Gummins, 1971).
Быстрая детекция и правильная идентификация возбудителей ржавчины важна не только для эффективной борьбы с этими патогенами, но и для лучшего понимания эпидемиологии ржавчинных болезней зерновых культур и пастбищных трав, а также для изучения природных популяций возбудителей ржавчины.
Одна из первых систем идентификации S. tritici и S. nodorum, праймеры в которой были подобраны к региону рРНК, была разработана Beck и Ligon (1995). При детекции результатов амплификации в геле чувствительность праймеров для обоих видов составляла 2,5 пг. При проведении ПЦР с праймерами для S. tritici перекрестной реакции с близкородственными видами М. fijiensis и М. musicola не наблюдалось. Однако, с праймерами для S. nodorum был получен ПЦР-продукт с ДНК S. avenaef. sp. tritici, равный по размеру ПЦР-продукту полученному с ДНК изолятов S. nodorum. Таким образом, эта система имела ограничения в специфичности.
На основе гена хитин-дезацетилазы были разработаны праймеры для идентификации S. nodorum и была показана возможность обнаружения с их помощью данного патогена в тканях инфицированных листьев пшеницы. В данной системе при разработке праймеров не были проанализированы последовательности вида S. tritici, а при постановке ПЦР не проводилось тестирование праймеров с ДНК вида S. tritici. Анализ продуктов ПЦР проводился методом гель-электрофореза (Валеев и др., 2008), что непроизводительно и повышает риск контаминации продуктами амплификации рабочей зоны.
Еще одна ПЦР-система для идентификации вида Septoria tritici была создана на основе гена Р-тубулина, с помощью которой можно было обнаружить 2 пг геномной ДНК в образце, используя для анализа продуктов амплификации гель-электрофорез (Fraaije et al., 1999). На основе тех же праймеров была разработана система с детекцией ПЦР-продуктов в формате микротитровальных плашек с использованием красителя PicoGreen, способного связываться с двухцепочечной ДНК; чувствительность системы составила 10 пг геномной ДНК Septoria tritici в 200 нг ДНК пшеницы. Эта тест-система была использована для количественного определения целевого гриба в листьях начиная со второго дня после инокуляции, чтобы отследить пути распространения патогена при возделывании культуры в полевых условиях. При помощи PicoGreen-ПЦР была возможна быстрая детекция и измерение концентрации образовавшегося продукта в конечной точке. Неудобство системы заключалось в необходимости построения новой калибровочной кривой в каждом эксперименте.
Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной детекции видов S. tritici и S. nodorum
Эти результаты наглядно демонстрируют неоспоримое преимущество разработанного подхода для четкой видовой идентификации исследованных видов возбудителей фузариозов.
В результате анализа из всех подобранных к исследуемым видам рода Fusarium пар праймеров были отобраны только по одной (указаны в таблице 6 жирным шрифтом), а именно те из них, которые позволяли получать специфичные продукты при проведении ПЦР по оптимизированной программе и не давали соответствующие ампликоны с ДНК других видов грибов.
Кроме того, нами были протестированы изоляты грибов рода Fusarium, выделенные из растений ячменя из разных регионов России, которые на основании морфологии колоний и конидий (Билай и др., 1988) были отнесены к виду F. sporotrichioides (табл. 2). ПЦР-анализ его изолятов с праймерами, специфичными к данному виду выявил принадлежность десяти из тринадцати изолятов к виду F sporotrichioides (рис. 21).
Номера дорожек соответствуют названиям изолятов из таблицы 7. (к-) - отрицательный контроль, (к+) - положительный контроль (ДНК изолята 2у-1 К sporotrichioides). Маркер молекулярного веса для ДНК 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н. Идентификацию трех изолятов проводили используя наборы разработанных нами праймеров, специфичных для видов F. gram іnearит, F. culmorum, F poae, F avenaceum, F tricinctum и F. langsethiae. В результате было выяснено, что изоляты № 8 и Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК изолятов 8-Ю с праймерами для: А - К tricinctum, Б — К culmorum Номера дорожек соответствуют названиям изолятов из таблицы 7. (к-) - отрицательный контроль, (к+) - положительный контроль (А - ДНК F. Mcinctum изолят 50202, Б - ДНК К culmorum изолят 70715). Маркер молекулярного веса для ДНК 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н. Из приведенных выше данных можно сделать вывод о возможности применения разработанных нами праймеров не только в диагностических целях, но и, при необходимости, для определения или уточнения видовой принадлежности изолятов грибов рода Fusarium (табл. 7).
Для регистрации результатов ПНР в формате FLASH на область гена TEF, фланкированную видоспецифичными праймерами, для грибов F. graminearum, F culmorum, F tricinctum и F. avenaceum был разработан общий зонд FuATCGp типа «молекулярный маячок»: 5 - (BHQ1) CCGAGCAATAGGAAGCCGCCGAGCTCGG (FAM) - 3 (подчеркиванием выделены нуклеотиды, комплементарные матричной ДНК). Пять не подчеркнутых нуклеотидов добавлены для стабилизации стебля и придания зонду характерной вторичной структуры.
Для зонда FuATCGp с помощью программы infold 3,2 были смоделированы возможные варианты вторичной структуры, которые отвечали требованиям к зондам данного типа (рис. 23).
Структура зонда FuATCGp, общего для видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum и F. avenaceum, смоделированная с помощью программы mfold 3,2
Эффективность зонда FuATCGp проверяли с праймерами для видов К graminearum, F. culmorum, F. tricinctum и F. avenaceum (рис. 24) на изолятах семи исследуемых видов. Было показано, Оптимальный уровень флуоресценции зонда FuATCGp, выше уровня фоновой флуоресценции в 2,1 раза и больше, наблюдался при концентрации зонда равной 7 пмоль. Уровень же фоновой флуоресценции этого зонда оказался равен 70,5 ед., то есть не превышал предельно допустимого значения в 150 ед. Следует подчеркнуть, что во всех вариантах ГТЦР проходила специфично.
На участок гена tefla, фланкируемый праймерами для видов F. sporotrichioides, F. роае и F langsethiae, был подобран общий зонд FuSPLp 5 - (BHQ1) GCGCGATCGAGGAAAATGAGACCAACGCGC (FAM) - 3 (подчеркиванием выделены нуклеотиды, комплементарные матричной ДНК).
Четыре не подчеркнутых нуклеотида добавлены для стабилизации стебля и придания зонду характерной вторичной структуры. С помощью программы mfold 3,2 для зонда FuSPLp были смоделированы две структуры, характерные для зондов типа «молекулярный маячок» (рис. 25). 10 A G с v« «%»» Рис. 25. Структура зонда FuSPLp, общего для видов К sporotrichioides, К роае и F. langsethiae, смоделированная с помощью программы mfold 3,2
При тестировании зонда FuSPLp с праймерами, специфичными к видам F. sporotrichioides, F роае, F langsethiae (рис. 26), и ДНК изолятов семи видов грибов рода Fusarium методом FLASH-ПЦР было показано, что фоновый уровень флуоресценции не превышал максимальное значение и был равен 50,5 ед. при оптимальной концентрации зонда в реакционной смеси 3,5 пмоль. При этом, образование продуктов реакции проходило строго специфично без перекрестной реакции праймеров с изолятами других видов. 6 8 10 12 Флуоресценция Є 8 Ю
Подбор праймеров для идентификации видов P. graminis и P. striiformis и проверка их видоспецифичности
Подбор праймеров для идентификации видов К graminearum, Е culmorum, Е tricinctum, Е avenaceum, Е sporotricltioides, F. роае, Е langsethiae и проверка их видоспецифичности
Для создания праймеров для идентификации видов рода Fusarium был выбран ген фактора элонгации трансляции 1-альфа (tefla), кодирующий белок, вовлеченный в процесс регуляции трансляции. Данный ген широко используется в филогенетических исследованиях фузариевых грибов, поскольку его нуклеотидные последовательности высокоинформативны на уровне вида и неортологичные копии его не были обнаружены для видов рода Fusarium. Кроме того, на основе последовательностей данного гена была создана база данных FusariumID, которую используют для идентификации видов рода Fusarium, сравнивая полученные с помощью универсальных праймеров последовательности с депонированными в ней. Таким образом, нуклеотидная последовательность гена tefla хорошо изучена у видов рода Fusarium (Geiser et al., 2004). Кроме того, ген tefla представлен в геноме единственной копией, поэтому тест-системы, основанные на амплификации его участка, обладают потенциалом для полуколичественного анализа (Kristensen R. et al., 2005, 2007).
Гомология нуклеотидных последовательностей гена tefla, задействованных из ГенБанка (табл. 4), у видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F poae и F langsethiae составляла около 53%. Полиморфные для данных видов области гена tefla были использованы в качестве 3 -участков при конструировании праймеров (табл. 6).
Примечания: Жирным шрифтом выделены праймеры, выбранные для создания системы в формате FLASH. Tm рассчитана в программе Oligo 6,71 Праймеры для видов F. graminerum и F. culmorum фланкировали участок гена tefla длиной около 340 п.н., внутри которого также были подобраны праймеры для видов F. avenaceum и F. tricinctum, фланкировавшие регион длиной 240 п.н. (рис. 11).
Сравнение нуклеотидной последовательности участка гена tefla с указанием расположения прямых и обратных праймеров для видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum и общего для четырех видов зонда (А), а также обратных праймеров для видов F graminearum и К culmorum (Б)
В кодах выравниваемых последовательностей Fa обозначает F. avenaceum, Ftr - F tricinctum, Fc - F. culmorum, Fg - F. graminearum Для видов F роае, Flangsethiae, Fsporotrichioides при анализе нуклеотидных последовательностей гена tefla были выявлены полиморфные сайты, фланкирующие участок длиной около 330 п.н., к которым для этих видов были подобраны прямые и обратные праимеры (рис. 12).
Сравнение нуклеотидной последовательности участка гена tefla с указанием расположения прямых и обратных праймеров для видов F роае. F sporotrichioides, F langsethiae и общего для трех видов зонда (А) и обратного праймера для вида F. sporotrichioides (Б)
В кодах выравниваемых последовательностей Fp обозначает F. роае, FI - F. langsethiae, Fsp - F. sporotrichioides Локусы, гомологичные праймерам и зондам, были соотнесены со структурой гена tefla. На основании этого было показано, что прямые праимеры для видов F. graminearum, F culmorum, F tricinctum, F avenaceum гомологичны к участку интрона 2, обратные праимеры для этих видов -экзона 4, а зонды гомологичны области экзона 3. Прямые праимеры для видов F. роае, F. sporotrichioides, F. langsethiae локализованы на участках интрона 1, а обратные праймеры и зонд гомологичны к областям интрона 2 гена tefla (рис. 13). Таким образом, большая часть олигонуклеотидов была подобрана к нуклеотидным последовательностям интронов.
Схематическое изображение гена tefla грибов рода Fusarium с указанием локализации праймеров и зондов, сконструированных для идентификации исследуемых видов
Для того чтобы оценить эффективность подобранных праймеров их тестировали с изолятами того вида, к которому они были подобраны, затем проверяли специфичность праймеров, тестируя их на изолятах шести других видов рода Fusarium. Для проведения ГЩР использовали универсальную программу с температурами отжига 64С/67С/70С: (93С - 90 сек) - 1 цикл; (93С - 20 сек, 64С/67С/70С - 10 сек) - 5 циклов; (93С - 1 сек, 64оС/67С/70С - 10 сек) - 40 циклов. Праймеры, дававшие перекрестную реакцию с ДНК изолятов других видов выбраковывались.
При проведении ПЦР с праймерами fGtefF и fGtefR для вида F. graminearum, наряду с образованием ПЦР-фрагментов с ДНК изолятов вида F. graminearum длиной около 350 п.н., наблюдалась перекрестная реакция с ДНК изолята 46504 вида F. culmorum с образованием ампликона той же длины (данные не приводятся). При тестировании комбинации праймеров fGtefF и GRMtR2 с ДНК изолятов вида F. graminearum были получены фрагменты ожидаемой длины (рис. 14), а с изолятами остальных шести видов перекрестной реакции не наблюдалось.
