Введение к работе
Актуальность исследования. Blastocystis hominis – полиморфный паразит кишечника человека и животных. Он вызывает интерес не только с точки зрения дифференциальной диагностики простейших кишечника, но и с точки зрения недостаточно установленной патогенной роли [Сергиев В.П. и др., 2008; Cekin . et аl. 2012]. Длительное время считалось, что бластоцисты принадлежат к дрожжам, в дальнейшем на основании данных электронной микроскопии в 1967 году . Zierdt отнес их к типу Рrotozoa и получил первые указания на возможную этиологическую роль этих простейших в возникновении кишечной патологии у лиц с иммунной недостаточностью [., 1996].
В последние годы выявлены высокие показатели зараженности B. hominis у различных групп населения [Державина Т.Ю. и др., 2011]. На протяжении нескольких лет ведется изучение биологии паразита [. et аl., 1996; .W. et аl., 2002]. В настоящее время имеется достаточное число эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль В. hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма [de Silva et al. 1997; Dagci H. et аl. 2002; Ласкин А.В. 2006]. По мнению Г.Г. Онищенко в группе «другие протозойные болезни» наиболее часто встречаемым паразитозом является бластоцистоз. На большинстве территорий Российской Федерации не проводится расшифровка острых кишечных инфекций неясной этиологии, которые могут быть вызваны инвазией бластоцист [Онищенко Г.Г., 2006].
В литературе имеются данные о наличии кожных высыпаний у больных при выявлении у них кишечных паразитов [Hameed D.M et аl., 2011]. R. Gupta и K. Parsi [2006] рекомендуют всем больным хронической идиопатической крапивницей, имеющим в анамнезе эпизоды диареи, проводить культуральное или микроскопическое исследования кала с целью возможного выявления бластоцист, как фактора, утяжеляющего течение основного заболевания.
Существуют работы, подтверждающие возможную роль B. hominis в этиологии синдрома раздраженного кишечника (СРК). Однако только присутствие B. hominis в кишечнике у лиц с СРК не ассоциируется с его повреждением, что подтверждено эндоскопическим обследованием этих пациентов. Поэтому все большее внимание исследователей привлекает определение факторов, которые могут быть связаны с клиническим проявлением болезни у носителей бластоцист [ J. et аl. 2004; 2010]. По данным разных источников при исследовании фекалий больных ВИЧ/СПИДом микроскопическим методом в 45,6% обнаруживаются кишечные паразиты, в том числе B. hominis – от 2,2% до 2,5%, что указывает на необходимость паразитологического исследования фекалий у больных СПИД-ом и наблюдения за консистенцией стула [ A. et аl. 2009; W. et аl. 2009].
В постановке диагноза бластоцистоза ведущую роль играет обнаружение бластоцист в кале микроскопическим и культуральным методом. Однако диагностика бластоцистоза затруднена обилием различных морфологических форм бластоцист [ R. et аl. 2006; Смирнова М.О. и др. 2010]. В качестве альтернативных и наиболее перспективных методов обнаружения B. hominis рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция [ R. et аl. 2006; U. et аl. 2007].
Для детекции возбудителей таких паразитарных болезней как малярия, лейшманиозы, токсоплазмоз, дирофиляриоз активно применяют ПЦР, однако, для определения бластоцист в клиническом материале (фекалии) на территории РФ не существует отечественных тест-систем. Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что изучение проблемы бластоцистоза и разработки методов лечения этой инвазии в значительной степени сдерживается отсутствием эффективных стандартизованных методов лабораторной диагностики этой нозоформы.
Цель исследования. Разработка оригинальных праймеров для верификации Blastocystis spp. в клиническом материале на основе метода ПЦР и их апробация, а также изучение клинических особенностей диарейного синдрома у лиц с бластоцистной инвазией.
Задачи исследования.
-
Провести анализ данных международного интернет-банка генов, подобрать и синтезировать праймеры, оценить их лабораторную перспективность для использования при детекции Blastocystis spp. методом классической ПЦР.
-
Определить оптимальный для проведения ПЦР метод выделения ДНК из биологического материала (кал), апробировать работу выбранных праймеров и оптимизировать временные и температурные режимы реакции.
-
Провести сравнение эффективности идентификации бластоцист в клиническом материале (кал) микроскопическим методом и методом ПЦР.
-
Определить частоту встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и клинически здоровых жителей Москвы, а также выявить особенности клинического течения диарейного синдрома, ассоциированного с Blastocystis spp.
Научная новизна исследования. Впервые в России разработаны и апробированы праймеры, перспективные для разработки отечественной тест-системы с целью идентификации ДНК бластоцист в клиническом материале (фекалии), в том числе оптимизированы температурные режимы амплификации, определены параметры применения метода ПЦР, подобрана методика выделения ДНК бластоцист.
Уточнена частота встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и у лиц из группы «декретированные контингенты», жителей Москвы и Московской области, определен симптомокомплекс для проведения целенаправленного паразитологического обследования больных с диарейным синдромом.
Установлено, что обнаружение генома бластоцист молекулярно-биологическим методом в испражнениях больных с диарейным синдромом не уступает микроскопическим методам исследования. В случаях низкой численности бластоцист в исследуемом материале, он может служить дополнительным методом исследования.
Практическая значимость. Оптимизированный молекулярно-биологический метод подтверждения бластоцистной инвазии кишечника больных с диарейным синдромом рекомендуется для практического использования при популяционных обследованиях организованных мигрантов из эндемичных стран, при расследовании вспышек ОКИ на предприятиях общественного питания, благодаря высокой чувствительности, специфичности и быстроте получения результата.
Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании 414 пациентов, лично проводил лабораторную подготовку 231 пробы и исследовал их методом ПЦР, организовал проведение лабораторных и инструментальных исследований. Диссертантом выполнена статистическая обработка и обобщение полученных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Амплификационный метод для идентификации генома бластоцист, сконструированный на основе специфических праймеров fBh2 и rBh2 для выявления рода Blastocystis spp. обладает чувствительностью 94,4 % при анализе клинического материала. Экстракция ДНК бластоцист сорбентным методом является наиболее эффективным способом подготовки проб при исследовании клинического материала методом ПЦР.
-
Повышение эффективности лабораторной диагностики бластоцистной инвазии при использовании комплексного подхода диктует необходимость применения как амплификационного, так и микроскопического методов, что наиболее целесообразно при проведении обследования больших групп населения, в том числе профилактических осмотрах декретированных лиц.
Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты внедрены в диагностических целях при консультации пациентов в отделении медицинской паразитологии КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова; используются в научно-педагогической работе на кафедре тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова для подготовки студентов лечебного и медико-профилактического факультетов; в работе специализированной клинико-диагностической лаборатории по паразитарным болезням КЦ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Инфекция и иммунитет» (Москва, апрель 2012 г.) и на заседании кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Диссертация была представлена и обсуждена на заседании специализированной комиссии в Научно-исследовательском Институте медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (протокол № 2 от 19 марта 2013).
По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Последний содержит 167 публикаций, из которых 94 отечественных и 73 зарубежных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 15 таблицами, приведено 2 клинических примера.
