Введение к работе
Актуальность проблемы
Основной функцией вкусовой системы является оценка качества пищи, проверка ее съедобности. В ходе эволюции животными была развита высокая чувствительность к горькому, так как большинство горьких веществ являются ядовитыми. С другой стороны, имеющие сладкий (т.е. привлекательный) вкус вещества являются высококалорийными. Считается, что человек способен различать пять базовых вкусов: кислый, соленый, сладкий, горький и умами (umami), который вызывается глутаматом и некоторыми другими аминокислотами. Поведенческие эксперименты, а также регистрации активности вкусовых нервных волокон свидетельствуют о том, что вкусовой анализатор животных также способен различать эти базовые вкусовые модальности. Это предполагает существование специфических молекулярных структур на рецептирующей поверхности вкусовых клеток, которые отвечают за распознавание вкусового стимула определенной модальности. Исследования вкусовой системы методами молекулярной биологии подтверждают, что это действительно так. В частности, в последние годы идентифицированы мембранные рецепторы для сладких и горьких веществ и аминокислот, вызывающих вкус умами.
Несмотря на заметный прогресс, достигнутый в последние годы в исследованиях вкусовой системы млекопитающих в целом, молекулярные механизмы вкуса во многом остаются неизученными. Прежде всего, мало что известно о принципах кодирования вкусовой информации и о механизмах, лежащих в основе информационного процессинга, протекающего в периферическом вкусовом органе - вкусовой почке. По аналогии с другими сенсорными системами, можно думать, что коммуникации между клетками вкусовой почки принципиально важны для обработки вкусовой информации. Они также важны и с той точки зрения, что вкусовые клетки - одни из самых быстро обменивающихся клеток организма млекопитающих. Их среднее время жизни составляет примерно 2 недели. Это приводит к необходимости постоянно обновлять синаптические связи афферентного нервного окончания со вновь образующейся вкусовой клеткой, что несомненно происходит при участии химических коммуникаций между клетками.
В нашей лаборатории установлено, что во вкусовой почке функционируют несколько сигнальных систем, включая пуринергическую, холинергическую, серотонинергическую и адренергическую системы. В силу определенных причин, основное внимание уделялось исследованию пуринергической системы и выявлению ее роли в физиологии периферического вкусового органа. Прежде всего, это было связано с тем, что генетический нокаут ионотропных Р2Х2/Р2ХЗ рецепторов, которые функционируют в афферентном вкусовом нерве, приводит к полному подавлению вкусовой чувствительности у
генетически модифицированных животных (Finger et al., 2005). Это является убедительным аргументом в пользу того, что АТФ выполняет функцию афферентного нейротрансмиттера в акте вкусовой трансдукции. В полном соответствии с этой идеей, было показано, что вкусовые клетки типа II высвобождают АТФ в ответ на деполяризацию и стимуляцию вкусовыми веществами (Romanov et al., 2007; Huang et al., 2007). Как оказалось, вкусовые клетки типа II не используют классический экзоцитозный механизм для секреции АТФ, но высвобождают последний при участии АТФ-проницаемых ионных каналов. Кроме того, было установлено, что внеклеточный АТФ мобилизует Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток типа I при участии пуринорецепторов P2Y типа и фосфолипазного каскада (Baryshnikov et al., 2003, Romanov et al., 2007; Romanov et al., в печати). Это свидетельствует о том, что пуринергическая система может быть также вовлечена в паракринную регуляцию клеток типа І в зависимости от физиологической активности клеток типа II.
Приведенные выше данные физиологических экспериментов поставили вопрос об исследовании пуринергической системы и ряда других сигнальных систем, функционирующих во вкусовой почке, на молекулярном уровне. Представлялось целесообразным установить, какие изоформы рецепторных, сигнальных и канальных белков вовлечены в физиологические процессы, протекающие во вкусовой почке при участии внеклеточного АТФ.
Цель работы
Исследовать на молекулярном уровне сигнальные процессы, прежде всего - пуринергическую сигнализацию, протекающие во вкусовой почке млекопитающих.
Основные задачи исследования
Используя методы молекулярной биологии и иммуногистохимии и основываясь на данных физиологических исследований, идентифицировать рецепторные, канальные и другие сигнальные белки пуринергической системы и ряда других сигнальных каскадов.
Научная новизна
Впервые показано, что вкусовые клетки экспрессируют несколько генов метаботропных пуринорецепторов P2Y типа, выключая P2Yi (АДФ рецептор), P2Y2 и P2Y4 (АТФ/УТФ рецепторы) и P2Y6 (УДФ рецептор). Во вкусовых клетках мыши идентифицированы два типа фосфолипаз С - G-белок-активируемая фосфолипаза С(32 и впервые Са2+-активируемые фосфолипазы С81 и С83. Впервые показано, что вкусовые клетки экспрессируют гены канальных белков из семейства коннексинов и паннексинов, включая Сх26, СхЗО.З, СхЗІЛ, СхЗЗ, СхЗб, Сх43 и Pxl. На уровне транскриптов во вкусовых клетках
идентифицированы следующие сигнальные белки: аценилатциклаза (изоформы АС1, АСЗ, АС6, АС7, АС8); фосфодиэстераза (PDE8, PDE9); а 1-субъединица Са2+ канала Са„1.2; метаботропный Са2+ рецептор CaSR; рецепторы, активируемые протеазами, PARI и PAR2.
Научно-практическая ценность
Проведенное исследование позволило установить какие изоформы исследовавшихся рецепторных, сигнальных и канальных белков функционируют во вкусовых клетках мыши. Это расширяет существующие представления о молекулярной организации периферической вкусовой системы. Кроме этого, полученные данные позволяют с большей эффективностью проводить ингибиторный анализ сигнальных процессов во вкусовых клетках, поскольку различные изоформы перечисленных белков в разной степени чувствительны к ингибиторам, блокаторам и модуляторам их активности.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 7-ой и 9-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003, 2005), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005), на 19-ом съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на 14-ом международном симпозиуме по обонянию и вкусу и 38-ом ежегодном собрании японской ассоциации изучения вкуса и запаха (Киото, 2004), на 1-ом съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008).
Публикации
Основные результаты работы опубликованы в 14 печатных работах, в том числе в 2 реферируемых журналах.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 121 странице, содержит 51 таблицу и рисунок. Список литературы включает 198 ссылок.
