Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль экзосом в процессе канцерогенеза .11
1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков .11
1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования 13
1.1.3. Подавление систем наследственного и приобретенного иммунитета 18
1.1.4. Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза .19
1.1.5. Анализ протеома опухолевых экзосом 21
1.2. Методы иммуноанализа белков 24
1.2.1. Общий обзор 24
1.2.2. Радиоиммуноанализ (РИА) 29
1.2.3. Иммуно-ферментный анализ (ИФА) 30
1.2.4. Иммуно-ПЦР .33
1.2.5. Электрохимический анализ 37
1.2.6. Коиммунопреципитация хроматина (ChIP) .38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Антисыворотки .41
2.2. Коммерческие антитела и их конъюгаты .42
2.3. Коллекция образцов 42
2.4. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул .43
2.5. Экстракция белков 44
2.6. Электрофорез белков в ПААГ 44
2.6.1. Трис-глициновая система 44
2.6.2. Трис-трициновая система 44
2.7. Окрашивание гелей 45
2.7.1.Окрашивание гелей Кумасси 45
2.7.2.Окрашивание гелей солями серебра .45
2.8. Вестерн-блот анализ 46
2.9. Дот-блот анализ .46
2.10. Разделение продуктов ПЦР 47
2.11. Выделение сывороточных экзосом 47
2.11.1. Выделение экзосом ультрацентрифугированием 47
2.11.2.Выделение экзосом с использованием препарата Exoquick .47
2.12. Иммунопреципитация 48
2.12.1.Иммунопреципитация дефензина 5 из образцов сыворотки крови 48
2.12.2.Иммунопреципитация экзосом из образцов сыворотки крови 48
2.13. Получение рекомбинантных фрагментов белков 48
2.14. Масс-спектрометрический анализ .49
2.15. Получение моноклональных антител .50
2.16. Очистка моноклональных антител 51
2.17. Получение высокоаффинных поликлональных антител .52
2.18. Очистка поликлональных антител 52
2.19. Иммуно-ПЦР 53
2.19.1. Синтез праймеров 53
2.19.2.Конъюгация антител и ДНК-репортера JW с магнитными микрошариками 54
2.19.3. Иммуно-ПЦР в прямом формате .54
2.19.4. Иммуно-ПЦР в сэндвич формате .55
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Сбор коллекции образцов 57
3.2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом .57
3.3. Получение рекомбинантных фрагментов отобранных белков .61
3.4. Получение высокоаффинных поликлональных антител к фрагментам рекомбинантных белков 64
3.5. Получение моноклональных антител .70
3.6. Разработка нового формата иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки 72
3.6.1. Очистка экзосом из образцов сыворотки крови 72
3.6.2. Обнаружение рака толстой кишки на основе анализа белков опухолевых экзосом сыворотки крови .75
3.6.2.1.Синтез бинарного конъюгата детектирующих антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками 78
3.6.2.2. Амплификация ДНК-репортера .78
3.6.2.3.Оценка чувствительности протокола в модельном эксперименте .79
3.6.2.4. Иммуно-ПЦР сывороточных экзосом 80
Выводы 84
Список литературы .85
- Общая характеристика эукариотических микропузырьков
- Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза
- Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул
- Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии является разработка новых способов молекулярной диагностики заболеваний, одним из наиболее распространённых типов которых является рак толстой кишки (РТК). Современные методы сывороточной диагностики рака основаны на количественном анализе содержания проникающих в кровоток биомаркеров (белков, ДНК и некодирующих РНК), содержание которых заметно возрастает в сыворотке крови при развитии опухоли. Однако идентифицированные до настоящего времени потенциальные белковые маркеры РТК пока недостаточно надежны, а имеющиеся методы их детекции недостаточно чувствительны для диагностики рака в образцах сыворотки крови населения из групп повышенного риска.
Одним из наиболее перспективных подходов к созданию клинических тестов для обнаружения опухолей является анализ молекулярного состава опухолевых экзосом. Экзосомы (т.е. покрытые липидной мембраной микропузырьки) экспортируются в кровоток большинством типов клеток в процессе межклеточной коммуникации. Молекулярный состав и количество экзосом заметно изменяются при возникновении опухолей и целого ряда других заболеваний. Многочисленные исследования показали, что количество экзосом в крови (в норме составляющее 100-400 миллионов частиц на мл) резко возрастает в процессе канцерогенеза. На последних стадиях развития опухолей различных типов (в отсутствие метастазирования) количество опухолевых экзосом может составлять до 30% от общего количества экзосом сыворотки крови.
Полученные в последние годы результаты показывают, что анализ белкового и РНК-состава сывороточных экзосом позволяет заметно увеличить чувствительность диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга различных видов опухолей. Анализ биомаркеров опухолевых экзосом обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами детекции сывороточных биомаркеров. Поскольку опухолевые экзосомы формируются из эндоплазматической мембраны клетки, репертуар имеющихся на их поверхности мембранных белков хорошо коррелирует с репертуаром мембранных белков экспортирующих их опухолевых клеток. Аффинная очистка опухолевых экзосом с использованием иммобилизованных антител к опухолеспецифичным или тканеспецифичным поверхностным белкам позволяет полностью удалить компоненты сыворотки (или другой биологической жидкости), а также экзосомы неопухолевой природы и тем самым резко повысить специфичность диагностического теста. Дополнительным преимуществом анализа экзосом является то, что число копий индивидуального белка в их мембране обычно весьма велико. В результате, вследствие амплификации сигнала, тесты, основанные на детекции присутствия индивидуального белка или другого биомаркера в составе экзосом, заметно более чувствительны, чем при использовании традиционных методов иммуноанализа.
Большинство современных иммунологических тестов включают как минимум три основных компонента: 1) детектируемый белок (антиген образца); 2) антитело и 3) присоединенную к антителу метку, которая детектируется с использованием высокочувствительного химического, биологического или физического метода. Перед началом тестирования антитела или антиген иммобилизуют на носителе (в лунке плашки, на магнитных шариках и т.п.) в результате адсорбции или ковалентного присоединения. После взаимодействия антигена с антителом неспецифические комплексы, образуемые антителами, разрушают хаотропным агентом (т.е. веществом, частично дестабилизирующим трёхмерную структуру макромолекул), а затем проводят количественный анализ специфичных комплексов. Дополнительное повышение чувствительности иммунологических тестов может быть достигнуто в результате использования методов пробоподготовки повышающих концентрацию антигена в анализируемом образце. Наиболее эффективные способы такого типа основаны на фишинге, а в случае анализа биологических жидкостей - на выделении экзосом.
Одним из наиболее чувствительных методов иммуноанализа в настоящее время является иммуно-ПЦР. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является уникальным по специфичности и чувствительности способом детекции комплексов антиген-антитело, поскольку позволяет экспоненциально амплифицировать и детектировать присутствие конъюгированной с детектирующим антителом ДНК-метки (вплоть до одной молекулы) с использованием простого оборудования. Использование иммуно-ПЦР понижает предел детекции антигена по сравнению со стандартным методом колориметрического иммуно-ферментного анализа в 10 тыс. раз. Однако достижение низких пределов детекции требует как высокой аффинности антител, так и использования методов конъюгации ДНК с антителами, не изменяющих активности антител.
Для конъюгации как одно- так и двухцепочечных ДНК-меток (репортеров) с детектирующими антителами используется три основных способа. Первый способ основан на введении в один из концов ДНК-репортера молекулы биотина в процессе химического синтеза. Для последующей конъюгации используется рекомбинантный белок-химера, в состав которого входят: 1) связывающийся с биотином белок стрептавидин, имеющий четыре сайта связывания биотина; 2) присоединённый к стрептавидину белок A, образующий прочные комплексы с Fc-фрагментом антител. Второй способ конъюгации (т.н. «универсальный иммуно-ПЦР») предполагает введение биотиновой метки, как в конец ДНК-репортера, так и в детектирующее антитело (в этом случае присоединение биотина к антителу происходит по остаткам лизина и аргинина, что вызывает частичную инактивацию детектирующих антител). Конъюгация происходит в результате добавления стрептавидина в смесь детектирующих антител и ДНК-репортера. Одна из модификаций этого протокола предполагает образование больших надмолекулярных комплексов, включающих несколько молекул стрептавидина одновременно связывающихся с молекулой антитела. Часть иммуно-ПЦР протоколов такого типа основана на использовании липосом, что позволяет более чем в сто раз повысить чувствительность иммуноанализа. Используемая в этом случае метка, присоединяемая к детектирующему антителу, представляет собой окруженную липидной мембраной частицу, внутри которой находится большое количество молекул ДНК-репортера. Для конъюгации с антителом (которая также как и в базовом протоколе происходит через стрептавидин) в состав липидной мембраны вводится биотинилированное производное полиэтиленгликоля. Наконец, последний описанный в литературе способ конъюгации антител с репортером предполагает прямую ковалентную пришивку ДНК к лизиновым и аргининовым аминокислотным остаткам антител, что также приводит к частичной потере их активности.
Цели и задачи работы. Целью работы являлась разработка нового способа обнаружения опухолей толстой кишки, основанного на сывороточной детекции белков опухолевых экзосом с использованием иммуно-ПЦР.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей толстой кишки, а также сывороток здоровых доноров и сывороток крови пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.
-
Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом.
-
Получение высокоаффинных антител к идентифицированным белкам.
-
Разработка новой модификации метода очистки опухолевых экзосом из образцов сыворотки пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки.
-
Разработка нового формата иммуно-ПЦР, основанного на использовании бинарных конъюгатов ДНК-репортера и антител к активированной поверхности микрошариков. Определение предела чувствительности детекции антигена разработанного формата иммуно-ПЦР.
-
Сравнительный анализ содержания идентифицированных в п. 2 мембранных белков в составе опухолевых экзосом аффинно очищенных из сыворотки крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки и здоровых доноров с использованием разработанного формата иммуно-ПЦР.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертации были разработаны:
1. Новый алгоритм биоинформатического поиска мембранных белков, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом.
2. Новый протокол синтеза бинарного конъюгата детектирующих моноклональных антител и ДНК-репортера с активированной поверхностью магнитных микрошариков.
3. Новый протокол связывания опухолевых экзосом с иммобилизованными на мембране захватывающими антителами.
4. Новый высокочувствительный формат иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки.
Практическая ценность. Сывороточные тесты для обнаружения опухолей толстой кишки в группах повышенного риска позволяют увеличить выживаемость пациентов и уменьшить затраты системы здравоохранения на их лечение.
Апробация работы. Результаты работы были представлены в марте 2013 г. на отчётной конференции РФФИ (грант № 11-04-12082-офи-м «Разработка высокоэффективного метода иммуно-ПЦР для анализа низкокопийных белков»).
Публикация. По теме диссертации опубликовано восемь работ в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (136 наименований). Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 27 рисунков.
Общая характеристика эукариотических микропузырьков
Значительное повышение чувствительности и специфичности иммуноанализа может быть достигнуто в результате предварительного удаления из образца большинства посторонних белков. Одним из наиболее часто используемых методов такого рода является аффинная очистка из образцов биологических жидкостей экзосом, т.е. покрытых мембраной микропузырьков секретируемых в окружающее пространство прокариотическими и эукариотическим клетками в процессе межклеточной коммуникации [2, 3]. Первоначально секретируемые во внеклеточный матрикс, микропузырьки в дальнейшем попадают в кровь, лимфу и другие биологические жидкости и переносятся на значительное расстояние от клетки-донора. Слияние микропузырьков с клеткой-реципиентом приводит к проникновению в ее цитоплазму белков, липидов, мРНК, а также некодирующих РНК клетки-донора, что приводит к «перепрограммированию» клетки-реципиента [10]. Этим действие микропузырьков не ограничивается, поскольку содержащиеся в них металлопептидазы участвуют в деградации внеклеточного матрикса при перестройке и регенерации тканей [11]. Многолетние исследования показали, что микропузырьки играют важную роль в функционировании приобретённого иммунитета [12, 13], воспалительных процессах [14. 15] и эмбриогенезе [16]. В норме уровень секреции микропузырьков и их состав меняются в ответ на различные стимулы, например, при изменении концентрации кальция в клетках крови [17], деполяризации нейронов [18], а также сразу после потери клетками способности к адгезии к поверхности чашки Петри в процессе культивирования [19]. Кроме того, уровень секреции и состав микропузырьков заметно изменяются при целом ряде патологий [20, 21]. Выявление тканеспецифичных маркеров микропузырьков, секретируемых в кровоток пораженными клетками, может найти применение в клинической практике для диагностики и мониторинга целого ряда заболеваний, включая вирусные инфекции [22], нейродегенеративные и сердечнососудистые заболевания [23, 24], болезни печени и почек [25], а также различных видов рака [26]. Эукариотические микропузырьки подразделяются на экзосомы (диаметром 40–100 нм), более крупные микровезикулы (100–1000 нм) и апоптотические тельца (1–5 мкм) [27, 28]. Наиболее изученным классом микропузырьков являются экзосомы, которые образуются из интралюминальных мультивезикулярных частиц, в свою очередь формирующихся в результате отпочкования частей мембраны поздних эндосом. В процессе отпочкования мембраны происходит захват мембранных, цитоплазматических и ядерных белков клетки, а также цитоплазматических мРНК, микроРНК и длинных некодирующих РНК содержащихся в эндосомах. Возникает вопрос, каким образом клетка-реципиент узнает микропузырьки, адресованные ей клеткой-донором для последующего слияния? Исследования последних лет показали, что в процессе узнавания участвуют трансмембранные рецепторы межклеточной адгезии, относящиеся к семействам интегринов, кадгеринов и селектинов [29]. При этом взаимодействующие друг с другом рецепторы, расположенные на поверхности микропузырька и клетки-реципиента, не только принадлежат к одному и тому же семейству, но и имеют одинаковую первичную структуру. Таким образом, процесс узнавания микропузырьков, адресованных клеткой-реципиентом, основан на образовании димеров или олигомеров идентичных молекул (так называемом гомофильном связывании). На следующей стадии происходит слияние микропузырька с клеткой-реципиентом и частичное перепрограммирование ее метаболизма [30], обусловленное действием трёх процессов: 1) прямого влияния содержащихся в микропузырьках молекул белков, а также транслируемых в белки мРНК [31, 32]; 2) регуляции уровня трансляции клеточных мРНК экзосомальными микроРНК [10]; 3) эпигенетических изменений структуры и функции хроматина в ядре клетки-реципиента содержащимися в экзосомах ядерными белками и длинными некодирующими РНК [33].
Радикальное повышение уровня секреции опухолевых экзосом происходит при возникновении рака. При этом опухолевые экзосомы приобретают способность к связыванию и перепрограммированию трех основных типов клеток-реципиентов, проникающих в очаги воспаления и поражения тканей: 1. Зрелых клеток (главным образом фибробластов, клеток периферической иммунной системы и клеток эндотелия). 2. Клеток-предшественников зрелых клеток. 3. Циркулирующих в кровотоке мультипотентных стволовых клеток костного мозга, из которых образуются клетки-предшественники, играющие основную роль в регенерации и репарации тканей [31]. Такие клетки были впервые описаны в работе российского ученого Фриденштейна с соавторами в 1974 году [34].
Наиболее часто при изучении роли опухолевых экзосом в процессах перепрограммирования клеток используется экспериментальный подход, основанный на анализе результатов слияния опухолевых экзосом с клеточными культурами. Многолетние исследования показали, что очищенные из культуральной среды экзосомы, продуцируемые опухолевыми клетками, индуцируют дифференцировку зрелых стромальных (мезенхимных) клеток и их предшественников в миофибробласты [35, 36]. Одной из причин изменения направления клеточной дифференцировки считается проникновение в клетку-реципиент комплексов трансформирующего фактора роста бета (TGF-) с его рецептором, находящихся на поверхности опухолевых экзосом (Рис. 1). Последующая активация сигнальных путей клетки-реципиента приводит к фосфорилированию проникающих в ядро факторов транскрипции семейства SMAD и эпигенетически наследуемым изменениям структуры хроматина, в результате чего повышается уровень экспрессии генов, кодирующих -актин гладкой мускулатуры (ACTA2) и фактор роста фибробластов (FGF2). Кроме того, в результате слияния стромальных клеток с опухолевыми экзосомами инициируется массовая секреция аутокринных факторов, стимулирующих рост и пролиферацию клеток-реципиентов, а также паракринных факторов, стимулирующих пролиферацию опухолевых клеток-доноров экзосом [30, 37].
Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза
Прогрессию опухолей, размер которых достиг 1 мм, ограничивает активация процесса новообразования сосудов из циркулирующих в кровотоке ангиобластов (васкуляризация), а также роста и разветвления уже существующих сосудов (ангиогенез). Показано, что слияние опухолевых экзосом с клетками-предшественниками эндотелия (ангиобластами) приводит к локальной активации обоих процессов, что позволяет увеличить доставку в опухоль кислорода и питательных веществ [38; 55]. Анализ белкового состава экзосом, секретируемых опухолевыми клетками в культуральную среду привел к идентификации ряда активаторов пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. В перечень идентифицированных активаторов входят: 1. Белки семейства фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и ангиопоэтина (ANG и ANGPTL) (Рис. 1) [36, 38]. 2. Фактор роста фибробластов (FGF) и гепарин-связывающий фактор роста эпидермиса (HB-EGF) [38]. 3. Хемоаттрактант эндотелиальных клеток и их предшественников SDF-1 [36] 4. Проангиогенный комплекс факторов свертывания крови TF и VIIa [55]. 5. Металлопептидазы MMP2 и MMP9, деградирующие внеклеточный матрикс [38]. Показано, что миграция клеток-предшественников эндотелиальных клеток мигрирующих из костного мозга в район опухолевой гипоксии значительно усиливается в результате их слияния с опухолевыми экзосомами. Усиление миграции является следствием изменений в содержании белков межклеточной адгезии [56, 57] и ингибирования сигнального пути белка Notch [58]. Наконец, было показано, что слияние экзосом, секретируемых клетками мышиной меланомы, с ангиобластами приводит к эпигенетически наследуемому (в результате метилирования промотора и перестройки хроматина) повышению уровня экспрессии протоонкогенов с-Met и c-Kit, а также гена, кодирующего рецептор семейства ангиопоэтинов Tie2 (Рис. 1) [31]. Анализ результатов слияния опухолевых экзосом с находящимися в опухоли зрелыми клетками эндотелия и их предшественниками продемонстрировал, что следствием слияния является локальная индукция васкуляризации и ангиогенеза [38, 58]. Эти данные были получены в эксперименте, основанном на сравнении количества сосудов, которые образовались после подкожной имплантации иммунодефицитным SCID-мышам клеток пуповинной вены человека (HUVEC) и тех же клеток, предварительно обработанных in vitro опухолевыми экзосомами, секретируемыми опухолями почек человека. При этом было показано, что резкая активация образования сосудов происходит лишь при слиянии с экзосомами, секретируемыми мезенхимными, мультипотентными стволовыми опухолевыми CD105+-клетками, но не экзосомами, секретируемыми обычными опухолевыми клетками эпителиальной природы [38, 59].
В качестве маркеров для диагностики рака наиболее часто используются белки и микроРНК опухолевых экзосом [9]. В исследованиях последних лет с использованием масс-спектрометрии и Вестерн-блоттинга были идентифицированы экзосомальные белки, секретируемые нормальными и опухолевыми клетками доноров [60-64]. Подробный перечень белков, содержащихся в экзосомах и микровезикулах секретируемых нормальными и опухолевыми клетками, содержится в базах данных ExoCarta и Vesiclepedia. Однако имеющиеся данные часто не воспроизводятся вследствие следующих причин: 1. Различиям в методах очистки экзосом (центрифугирование в градиенте плотности, ультрафильтрация и аффинная хроматография). 2. Трудности надежного разделения экзосом и более крупных микровезикул, белковый состав которых заметно отличается от состава экзосом [65]. 3. Различиям в методах разделения экзосомальных белков и продуктов их трипсинолиза (одно- или двумерный электрофорез, различные варианты хроматографии) и методах масс-спектрометрической идентификации пептидов (MS/MS, MALDIOF-MS и MALDIOF/TOF) [63, 66, 67]. Результаты анализа, проведенного с использованием различных технологических платформ, показали, что протеомы экзосом и производящих их клеток заметно различаются. При этом в протеоме экзосом можно выделить как группу белков синтезируемых повсеместно, вне зависимости от разновидности клетки-продуцента, так и ткане-специфичные и опухоле-специфичные экзосомальные белки. Важным результатом сравнительного протеомного анализа стало обнаружение того факта, что большое количество специфичных белков секретируемых в составе опухолевых экзосом принимают участие в опухолевой прогрессии [67, 57]. Показано, что наиболее распространенные функции экзосомальных белков состоят в регуляции формирования клеточного цитоскелета, адгезии клеток, а также в регуляции сигнальных путей, активность которых заметно меняется в процессе канцерогенеза: ингибировании апоптоза, активации образования сосудов и подавлении иммунного ответа. Наконец, интересные данные были получены при сравнительном анализе посттрансляционных модификаций белков опухолевых экзосом секретируемых клетками инсулиномы мыши и белков самой опухоли [68]. Результаты анализа показали, что паттерны фосфорилирования и убиквитинилирования белков в составе экзосом и опухолевых клеток заметно различаются. Это может приводить к заметным изменениям в структуре и составе образуемых белками комплексов [65].
Особенно детально был исследован белковый состав экзосом, секретируемых клетками аденокарциномы толстой кишки и производными клеточными линиями HT29, LIM1215 и LIM1863, а также состав высокоочищенных препаратов опухолевых экзосом асцитной жидкости [69, 70]. Результаты исследований показали, что 36% ткане- и опухолеспецифичных экзосомальных белков определяют независимость опухолевой клетки от сигналов регулирующих ее рост и пролиферацию, 25% участвуют в иммортализации клетки, 17% играют роль в процессах метастазирования и 6% ингибируют апоптоз. В список белков с наибольшим содержанием в препаратах опухолевых экзосом в основном входят нижеперечисленные белки, уровень синтеза которых заметно возрастает при возникновении РТК: 1. Поверхностные рецепторы клеточной адгезии (CD9, CD44, CD82, CEACAM 1 и 5, CDH17, EpCAM, белки из семейства клаудинов и галектинов), количество которых заметно возрастает при инвазии опухолей. 2. Рецептор фактора роста гепатоцитов c-MET, участвующий в процессах клеточной пролиферации и метастазирования. 3. Рецепторы из семейства эфринов, определяющие пространственную ориентацию стволовых клеток эпителия толстой кишки. 4. Белок бета-катенин из сигнального пути WNT, определяющего дифференцировку клеток эпителия толстой кишки. Ингибирование этого сигнального пути, приводящее к накоплению в ядре бета-катенина, зарегистрировано в 95% случаев рака толстой кишки. 5. Белки сигнального пути RAS (мутации в генах кодирующих белки этого пути происходят в половине случаев РТК). 6. Белок клеточной пролиферации PCNA, повышение уровня синтеза которого инициирует иммортализацию клеток. 7. Белок амфирегулин – аутокринный фактор из семейства эпидермального фактора роста, участвующий в процессе инвазии опухолей [71]. 8. Протеазы, участвующие в деградации внеклеточного матрикса в процессах опухолевой инвазии и ангиогенеза (аминопептидаза N и металлопептидаза ADAM10). Результаты сравнительного протеомного анализа нормальных и опухолевых тканей открывают возможность использования идентифицированных белковых маркеров для неинвазивной диагностики, прогнозирования и мониторинга социально значимых заболеваний.
Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул
На начальном этапе был проведен анализ литературы и скрининг баз данных дифференциальной экспрессии микроРНК в различных видах рака, в результате чего отобрали 54 микроРНК с повышенной экспрессией в РТК и 75 - с пониженной. Далее для каждого гена человека был выполнен расчёт скоринг-функции, отражающей вероятность потери негативной регуляции экспрессии данного гена в результате действия микроРНК (и насколько, соответственно, вероятно повышение уровня синтеза белка) [105]: , где: – score parameter базы TargetScan, взятый с обратным знаком; – сумма значений параметра для всех пар определенной мишени со всеми микроРНК, экспрессия которых понижается в опухоли относительно нормальной ткани; – сумма значений параметра для всех пар определенной мишени со всеми микроРНК, экспрессия которых повышается в опухоли относительно нормальной ткани;
В скоринг-функции отражено два наиболее важных фактора, определяющих надёжность предсказания – на каким числе ресурсов/баз данных выполнено предсказание и насколько вероятно взаимодействие микроРНК и мРНК-мишени по оценке TargetScan. Для оценки надёжности предсказания помимо TargetScan использовали следующие базы данных (БД): DIANA [106], MicroCosm [107], PITA [108], miRDB [109], RNA22 [110]. Стадия 2. На этой стадии проводился отбор генов, кодирующих мембранные белки с использованием веб-ресурса Gene ontology (GO, [111]), описывающего различные характеристики каждого гена, структурированные и каталогизированные по категориям: GO:0005887 : integral to plasma membrane; GO:0009986 : cell surface; GO:0007155 : cell adhesion.
Нормальные и опухолевые ткани (140-380мг) гомогенизировали с помощью шаровой мельницы Sartorius Mikro Dismembrator U при 7200 об/мин в течение 60 сек при охлаждении жидким азотом. Материал растворяли в 5х буфере для образцов Лэммли (см. ниже) (10 мин. при 100С) из расчета 200 мкг гомогената на 100 мкл 5х буфера.
Электрофорез проводили по методу Лэммли [112] в геле с 0,1%-ным SDS (SDS-ПААГ). Для растворения белков использовали 5Х буфер Лэммли для образцов (0.4 М Трис–HCl, pH 6.8, 20% глицерин, 4% SDS, 0.2 M DTT). Пробы инкубировали в течение 5-10 минут при 100С. Электрофорез проводили в электрофоретической ячейке MiniPROTEANR Tetra Cell (Bio-Rad) при напряжении 70V в концентрирующем геле, 120V в разделяющем геле, используя прибор PowerPac HV (Bio-Rad). Электродный буфер состоял из 0.015 М Трис, 0.225 М глицин, 0.1% SDS, pH 6,8. В качестве белковых стандартов использовали PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder и Precision Plus Protein Unstained Standards (Fermentas).
Электрофорез проводили в 16.5% разделяющем геле при 80V по методу Шагера и Джагова [113] с использованием следующих растворов: катодный буфер: 0.1 M Трис–HCl, 0.1 M трицин, 0.1% SDS, pH 8.25; анодный буфер: 0.2 М Трис–HCl, pH 8.9; буфер для образцов (2х): 0.1 M Трис–HCl, pH 6.8, 24% глицерин, 8% SDS, 4% 2-меркаптоэтанол, 4мМ ЭДТА, 3мМ азид натрия, 0,02% Coomassie Blue G-250; буфер для геля: 3.0 M Трис-HCl, pH 8.45. В качестве стандартов использовали Kaleidoscope Polypeptide Standarts (Bio–Rad).
Окрашивание проводили в растворе, содержащем 0,25 % Кумасси R-250, 45 % этиловый спирт и 10 % уксусную кислоту, в течение 2 мин при 100С, с последующей отмывкой геля 10 % уксусной кислотой при комнатной температуре.
Окрашивание проводили по протоколу [114] с небольшими модификациями. Перед окрашиванием гель фиксировали в растворе, содержащем 40% этанол и 10% уксусную кислоту в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем после трёхкратной отмывки деионизированной водой (mQH2O), гель обрабатывали 0.03% раствором тиосульфата натрия (Na2SO3х5H2O) в течение 5 минут. После трёхкратной отмывки геля mQH2O, его окрашивали раствором нитрата серебра (0.1% AgNO3, 37% формалина, разведение раствора 1 мл/л) в течение 10–15 минут. После трёхкратной отмывки mQH2O окраску проявляли визуально в растворе: Na2CO3 40 г/л, 0.03% Na2SO3х5H2O 20 мл/л, 37% формалин, разведение раствора 1 мл/л. Остановку окрашивания проводили 10% уксусной кислотой.
После разделения белков их подвергали электропереносу на нитроцеллюлозную мембрану Hybond C Extra (GE Healthcare), используя MiniPROTEANR Tetra Cell c mini Trans-Blot Module (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя при 100V в течение 1-1,5 часов, используя прибор PowerPac HV (Bio-Rad). Мембраны обрабатывали в течение 2 часов блокирующим буфером (PBS, 1% Tween-20 и 5% обезжиренное сухое молоко) и инкубировали с первичными антителами в 0.4х блокирующем буфере согласно рекомендации производителя. После трёхкратной отмывки мембран буфером PBS с 0,01% Tween-20 их инкубировали в течение часа с конъюгатами пероксидазы хрена со вторичными антителами, разводённми в 0.4х блокирующем буфере. После трёхкратной отмывки мембран PBS с 0,01% Tween-20, проводили детекцию сигнала с помощью набора ECL (GE Healthcare) согласно рекомендации производителя на пленке Amersham HyperfilmTM ECL (GE Healthcare).
При проведении Вестерн-блот анализа на стрипах на гель без лунок наносили образец в буфере Лэммли и проводили электрофорез в Трис-глициновой системе, как описано выше. Белки подвергали электропереносу на нитроцеллюлозную мембрану Hybond C Extra (GE Healthcare), мембрану подсушивали и разрезали на полосы шириной около 4мм. Каждую полосу инкубировали в блокирующем буфере. Далее каждую полоску мембраны проводили вестерн-блот анализу в Mini-Incubation Trays (Bio-Rad), как описано выше.
Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом
Поиск мембранных белков, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом, осуществляли с использованием модификации разработанного нами ранее алгоритма [105], схема которого показана на рисунке 11. Уникальность алгоритма состоит в том, что он основан на отборе мРНК-мишеней регулируемых микроРНК, уровень синтеза которых наиболее часто понижается в опухолях по сравнению с нормой. Это должно приводить к увеличению содержания кодируемых этими мишенями белков в оразцах опухолей. На первом этапе поиска на основе анализа литературных данных и имеющихся баз данных отбирали микроРНК, уровень синтеза которых наиболее заметно и часто понижается в опухолях толстой кишки. Затем с использованием имеющихся в интернете компьютерных программ были идентифицированы мРНК-мишени отобранных микроРНК, которые ранжировали в соответствии с рассчитанной интегральной скоринг-функцией SI (см. формулу расчета в разделе материалы и методы). Столбцы: A-название гена, B – значение интегральной скоринг-функции, C - значение скоринг-функции по микроРНК с пониженным содержанием в опухоли, D - значение скоринг-функции по микроРНК с повышенным одержанием в опухоли, E - значение скоринг-функции по микроРНК со стабильным содержанием в опухоли, F - число микроРНК с пониженным содержанием в опухоли, G - число микроРНК с повышенным в содержанием опухоли. На последнем этапе были введены три дополнительных критерия отбора потенциальных белковых маркеров: 1. Локализация белка в клеточной мембране (интегральные и ассоциированные с мембраной поверхностные белки). 2. Максимальный уровень синтеза в опухолях толстой кишки при минимальном уровне синтеза в других тканях. 3. Присутствие белка в экзосомах, секретируемых клетками толстой кишки, но не в кровяном протеоме (на основе анализа БД ExoCarta, построенной на основе экспериментальных данных [121]. В результате было отобрано пять белков (отмеченных в таблице зелёным), присутствие которых в экзосомах, секретируемых опухолями толстой кишки, было подтверждено по результатам поиска в базе данных PubMed: 1) MMP14 [122]; 2) CLDN3 [123]; 3) EPCAM [124]; 4) CEACAM5 [125] и 5) TSPAN8 [126]. Белок MMP14 был удален из списка, поскольку согласно базе данных The Human Protein Atlas повышение уровня синтеза этого белка происходит в целом ряде карцином, гораздо чаще, чем опухолях толстой кишки [127]. Кроме того, по результатам анализа литературных данных к списку белковых маркеров опухолевых экзосом был добавлен белок CDH17, специфически синтезируемый в клетках желудочно-кишечного тракта, поскольку: 1) уровень синтеза этого белка заметно повышается в опухолях толстой кишки [128]; 2) показано присутствие этого белка в составе секретируемых опухолями экзосом [129].
Анализ литературных данных показал, что отобранные белки обладают следующими свойствами: 1. CDH17 – трансмембранный белок, играющий важную роль в клеточной адгезии, специфически синтезируемый в клетках желудочно-кишечного тракта. 2. TSPAN8 – гликопротеин клеточной поверхности, который участвует в регуляции клеточного развития, роста и движения (этот белок синтезируется в различных карциномах). 3. CEACAM5 – гликопротеин клеточной поверхности, участвующий в клеточной адгезии и передаче внутриклеточных сигналов. 4. CLDN3 – белок, формирующий (в комплексе с другими белками) плотные межклеточные соединения (tight junctions). 5. EPCAM – белок, специфически синтезируемый в эпителиальных тканях и большинстве карцином, включая опухоли толстой кишки.
С использованием стандартного программного обеспечения были идентифицированы наиболее иммуногенные внеклеточные участки полипептидной цепи отобранных белков, не имеющие гомологий с другими белками человека .
Результаты Вестерн-блот анализа клеточных лизатов рекомбинантных штаммов бактерий с использованием антител к гексагистидиновой метке (вектор - pET29b, в дорожки нанесено по 0,005 ОЕ600 клеток E. coli, электрофорез в 12% ПААГ, трис-глициновая система). Дорожки: 1 – лизат рекомбинантного штамма до индукции экспрессии белков IPTG (контроль; лизат штамма после индукции нанесён в дорожку 2), 2-6 - лизаты рекомбинантных штаммов после индукции фрагментов кДНК кодирующих фрагменты белков CDH1724-132 (2), CDH17581-678 (3), TSPAN831-57/110-209 (4), CEACAM5331-460 (5), CLDN346-80 (6) и EРCAM24-265 (7). Слева - молекулярные массы полипептидов белкового стандарта (кДа).
