Введение к работе
Актуальность работы
Группа патогенных для человека ортопоксвирусов принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae и включает в себя такие вирусы, как вирус натуральной оспы (VARV), вирус оспы обезьян (MPXV), вирус оспы коров (CPXV) и вирус осповакцины (VACV). Входящие в эту группу виды морфологически тождественны, близки антигенно и иммунологически и в то же время разительно отличаются друг от друга по спектру их патогенности, контагиозности вызываемой инфекции и другим показателям
В 1980 году, после многолетней борьбы, ВОЗ официально декларировала ликвидацию натуральной оспы. Это событие стало эпохальным. Впервые была полностью прекращена трансмиссия вируса Были уничтожены хранилища этого вируса во всех странах мира, за исключением России и США. Из-за прекращения вакцинации население всех стран мира в возрасте до 30 лет не имеет иммунитета ни против натуральной оспы, обусловливаемой VARV, ни против других ортопоксвирусных инфекций человека. А люди старшего возраста, ранее вакцинированные против оспы, имеют ослабленный иммунитет против ортопоксвирусных инфекций, и с каждым годом человечество становится все менее защищенным от них. По-видимому, именно поэтому в последние годы появляется все больше сообщений о вспышках заболеваний людей, вызванных зоонозными вирусами MPXV, CPXV и VACV-like в разных странах. Обсуждается возможность появления VARV-like вируса в результате естественной эволюции существующих зоонозных ортопоксвирусов, или применение VARV в качестве агента биотерроризма.
Для предупреждения угрозы перехода локальных вспышек ортопоксвирусных инфекций в распространенные эпидемии необходимо иметь быстрые и точные методы видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека. Существующие морфологические, биологические и серологические методы не подходят для целей быстрой видоспецифичной диагностики.
Наиболее подходящим методом для экспресс идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, может быть ПЦР в реальном времени. На основе этого метода создан ряд методик для родоспецифичной идентификации и
Г) i0
дифференциации одного из видов ортопоксвирусов. Коммерчески доступной является тест-система для исследовательских целей для родоспецифичного выявления ортопоксвирусов с последующей дифференциацией анализом температуры плавления вируса натуральной оспы. Однако метод одновременной дифференциации VARV, MPXV, CPXV и VACV в одной реакционной смеси до сих пор не создан.
На основе углубленного анализа современных данных о нуклеотидных последовательностях ортопоксвирусов, нами в данной работе выявлены видоспецифичные районы ДНК ортопоксвирусов и разработана простая и надежная методика одностадийной экспресс идентификации четырех видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, основанная на применении мультиплексной полимеразнои цепной реакции (МПЦР) в реальном времени. Цель и задачи исследования
Цель работы: Разработка одностадийного метода видоспецифичной идентификации четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины - на основе мультиплексной полимеразнои цепной реакции в реальном времени.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
На основе компьютерного анализа геномных ДНК ортопоксвирусов выбрать олигонуклеотидные праймеры и гибридизационные зонды, обеспечивающие в мультиплексной ПЦР в реальном времени видоспецифичную детекцию ортопоксвирусных ДНК.
Оптимизировать параметры МПЦР в реальном времени с учетом выбранных олигонуклеотидных праймеров и зондов.
Для диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов сконструировать положительный контроль методики МПЦР в реальном времени на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов.
Определить основные аналитические и диагностические характеристики разработанной методики видоспецифичной диагностики патогенных для человека ортопоксвирусов методом МПЦР в реальном времени.
Научная новизна и практическая значимость работы
-
Впервые осуществлен выбор олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для детекции и дифференциации четырех патогенных для человека видов ортопоксвирусов: VARV, MPXV, CPXV и VACV.
-
Впервые разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени, учитывающий все новейшие данные по структуре генома ортопоксвирусов и проверенный на ДНК 29 штаммов различных видов ортопоксвирусов.
-
Показана эффективность видоспецифичной экспресс диагностики вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени при анализе клинического материала -легких, селезенки, печени и крови мышей, зараженных интраназально CPXV штамм GRI-90.
-
Впервые разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, использующий одностадийную МПЦР в реальном времени.
-
Показана эффективность использования МПЦР в реальном времени при анализе клинического материала: корочек с кожных поражений людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой; корочки с кожного поражения человека, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.; образцов легких, селезенки, печени и крови мышей, зараженных интраназально CPXV штамм GRI-90; образцов крови, селезенки, легких, печени, смыва рта и пустулы сурков, зараженных MPXV штамм CDC#v79-I-00S.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Метод видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе ПЦР в
реальном времени. Метод, в условиях проведенных экспериментов (на приборе Applied Biosystems 7500), имеет следующие характеристики:
аналитическая чувствительность, определенная при помощи
рекомбинантной плазмиды, содержащей видоспецифичный район CPXV: 6-60
копий/реакции.
аналитическая чувствительность, определенная при помощи препарата полноразмерной ДНК CPXV: 2-20 копий/реакции.
диагностическая чувствительность - 100 %;
диагностическая и аналитическая специфичность - 100 %.
2. Метод, позволяющий в одну стадию мультиплексной полимеразной цепной
реакции в реальном времени детектировать и дифференцировать четыре вида ортопоксвирусов, патогенных для человека: вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Метод, в условиях проведенных экспериментов, имеет следующие характеристики:
аналитическая чувствительность, определенная при помощи
рекомбинантных плазмид, содержащих видоспецифичные районы OPV:
VARV - 2-20 копий/реакции,
MPXV - 2-20 копий/реакции, CPXV - 5-50 копий/реакции, VACV - 7-70 копий/реакции.
аналитическая чувствительность, определенная при помощи препаратов
полноразмерной ДНК OPV:
CPXV - 2-20 копий/реакции, VACV - 9-90 копий/реакции.
диагностическая чувствительность - 100 %;
диагностическая и аналитическая специфичность -100%.
Апробация работы и публикации
По материалам диссертации опубликованы 1 статья в реферируемом научном журнале, получен патент РФ. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: International life sciences student's conference, Kyiv, Ukraine 2009 (Ukraine, Kiev, 2009); Актуальные проблемы природной очаговости болезней (Омск, 2009); Медицинская геномика и протеомика (Новосибирск, 2009). Вклад автора
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей и поиск видоспецифичных районов геномов VARV, MPXV, CPXV и VACV выполнен автором при участии Гавриловой Е.В. и Максютова Р.А. Разработка метода диагностики и конструирование положительного контроля методики МПЦР на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов выполнены лично автором. Эксперимент по интраназальному заражению мышей проводился совместно с
Кочневой Г.В. и Гражданцевой А.А. Заражение сурков вирусом оспы обезьян и выделение препаратов вирусной ДНК проводилось в лаборатории 4-го уровня биобезопасности ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Булычевым Л.Е. и Бодневым С.А. Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы (170 ссылок). Работа изложена на 108 страницах, содержит 11 таблиц и 19 рисунков.
