Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий
1.2 Характеристика вируса гепатита С 20
1.2.1 Методы диагностики гепатита С 22
1.2.2 Серологические белковые маркеры гепатита С 25
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1 АСМ-чипы 28
2.2 Препараты белков и реактивы 29
2.3 АСМ-анализ 30
2.4 Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа 31
2.5 Масс-спектрометрический анализ 33
2.5.1 МАЛДИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 33
2.5.2 ЭСИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа 34
Глава 3. Результаты и их обсуждение 35
3.1 МС -идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита
3.2 МС-идентификация белков, биоспецифически выловленных на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита
3.3 МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из образцов сыворотки крови
Выводы 82
Заключение 83
Литература
- Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий
- Методы диагностики гепатита
- АСМ-чипы
- -идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита
Введение к работе
Актуальность работы.
Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий. Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спектрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой
о о
концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10" "10" М и высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови в области концентраций 10" Ми менее.
Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехнологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы белков и подсчитывать их количество. При использования АСМ в качестве биомолекулярного детектора необходимо применение специальных чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы аналита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной поверхности чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий (АСМ-биоспецифический фишинг).
Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что несмотря на возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в исследовании сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора аналита.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
Разработана схема МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;
Разработаны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;
Проведена МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипа;
Проведена МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки).
Научная новизна работы.
В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-идентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что по сравнению со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади
поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анализ и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протеотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации {MALDI и EST) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифический фишинг и МС также была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (HCVcoreAg и Е2) в образцах сыворотки крови.
Практическая значимость работы.
Результаты данной работы дают возможность создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и дополнительных процедур подготовки образцов для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.
Подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.
Апробация работы.
Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м и 3-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2010); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ: 2 статьи в российских научных изданиях и 5 публикаций в докладах научных конференций.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.
Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий
Одним из приоритетных направлений в современной науке является обнаружение и выяснение роли различных типов белков в организме, а также понимание молекулярных механизмов, приводящих к развитию заболеваний.
.Несмотря на постоянное совершенствование протеомных методов, количество вновь открытых биомаркеров заболеваний остается практически / неизменным за последнее десятилетие [1]. Это связано с тем, что концентрационный предел детекции традиционных протеомных методов не превосходит 10"9 М [2]. В то же время важным для протеомики является разработка новых аналитических подходов идентификации белков более низкого концентрационного диапазона, в частности низкокопийных белковых молекул (с концентрацией 10"13 М и менее), в том числе биомаркеров в биологическом материале. Поскольку можно предполагать, что именно в этих концентрационных диапазонах находятся белковые маркеры большинства заболеваний [2].
Одно из активно развивающихся направлений, позволяющее, несколько повысить концентрационную чувствительность анализа, заключается в создании аналитических комплексов на основе нанохроматографических и наноэлектрофоретических систем, совместимых с масс-спектрометрами.
Нанохроматографическая система в комбинации с масс-спектрометрией и электроспрейным типом ионизации- позволили повысить чувствительность выявления белков на два порядка по сравнению с хроматографией высокого разрешения (ВЭЖХ) [4]. Предел концентрационной чувствительности таких сопряженных систем ограничен чувствительностью стадии электрофореза/хроматографии, и не превосходит 10"12 М для отдельных белков (например, для цитохрома С и брадикинина) [5].
В настоящее время хроматографические методы развились в отдельные самостоятельные направления - SELDI МС анализ {surface enhanced laser desorption and ionization/time of flight mass spectrometry) [6-12], методы фишинга белков с использованием магнитных микрочастиц [13-17]. В этих технологиях, гидрофобные или заряженные поверхности SELDI-чипов -. или магнитных микрочастиц в, комбинации с масс-спектрометрическим анализом, успешно используются: для? выявления- и идентификации, как отдельных типов; белков, так и для белкового/пептидного профилирования сыворотки крови [в, 8; \Ъ, 15]. SEbDIi МЄ представляет собой: мощный подход, позволяющий исследовать биоматериал за- счет адсорбции биомолекул (белковj. пептидов) на химически активированную? поверхность (катионо-/анионообменные чипы) с последующим масс-спектрометрическим анализом адсорбированных: молекул:. SEEDPМЄ подход применяется; для-белкового- профилирования биоматериала;. а в последнее время: стал использоваться в качестве «диагностики,по протеомным штрих-кодам» [ 17].. Суть такой «штрих-кодовой диагностики» заключается в выявлении? особенностей белкового профиля биологического образца; связанных с определенным заболеванием: Так, известно; что г при. раковых заболеваниях «протеомный штрих-код» бйоматериала- значительно отличается от такого у здоровых1 групп» лиц: Поэтому,, контроль над изменением белкового; состава биоматериала может стать основой для раннешдиагностики заболеваний. На; сегодняшний день, с помощью подхода SELDI? МЄ были выявлены маркеры. рака желудка, яичников, простаты, и молочной железы [18-19]: Ограничение этого метода5 заключается вь невозможности идентифицировать белки с высоким разрешением и достоверностью, что особенно важно при; анализе многокомпонентных смесей, таких как биологическийгматериал.
Помимо проблемы низкой концентрационной чувствительности существующих аналитических систем, камнем преткновения для протеомного анализа биологического материала стал широкий динамический диапазон концентраций белков, особенно в сыворотке крови, который варьирует от 1(Г М вплоть до отдельных белковых молекул. Высококопийные (мажорные) белки препятствуют в таких системах выявлению и идентификации низкокопийные (минорных) белков [20-24].
Проблему широкого концентрационного диапазона белков в биоматериале возможно решить путем применения методов обеднения сыворотки крови от мажорных фракций белков, методов сепарации многокомпонентных смесей и нанотехнологических методов, основанных на биоспецифическом и химическом фишинге белковых молекул аналита из сложных смесей на поверхность чипов к различным биосенсорам или на активированную поверхность магнитных микросфер [3, 15, 24, 25].
Традиционно для разделения многокомпонентных белковых смесей используют одномерный, чаще двумерный гель-электрофорез [26-29]. Принцип разделения белков методами- двумерного гель-электрофореза основан на различии белков по значениям их изоэлектрических точек Hf молекулярных масс [30]. В протеомике данные подходы применяются для белкового картирования биоматериала (ткань, плазма крови и др.) [30-32]. Комбинация одномерного и/или двумерного электрофореза с масс-спектрометрией позволяет идентифицировать разделенные и визуализированные белки [32-35]. Однако процедура двумерного гель-электрофореза до сих пор не автоматизирована, достаточно, сложна и трудоемка в исполнении, требует высокой квалификации оператора, а результаты анализа зачастую плохо воспроизводимы [36].
Более удобная по сравнению, с двумерным электрофорезом процедура разделения белков - это хроматография высокого разрешения (ВЭЖХ); которая представляет собой автоматизированную процедуру, позволяющую удалять высококопийные белки из сложной смеси с целью последующего выявления низкокопийных белков [37].
С целью прямой идентификации белков в сложных смесях, хроматографическая колонка может быть соединена с масс-спектрометром. Однако интактные белки практически не поддаются высококачественному разделению с помощью ВЭЖХ, поскольку денатурируют при проведении анализа (из-за низких значений рН среды и высокой- концентрации органических растворителей), а также вследствие низкой точности масс-спектрометрического анализа, поэтому, прямая идентификация большинства интактных белков, особенно с молекулярной массой превышающей 10 кДа, зачастую невозможна. Аналитическую точность измерения можно улучшить путем гидролитического расщепления белков до пептидных фрагментов , молекулярной массой от 700 до 4000 Да с помощью протеаз; таких как трипсин (технология "bottom-up"). Чтобы достигнуть качественного разделения белков в смеси, применяют- комбинацию нескольких хроматографических процедур, так называемая, многомерная хроматография [38].
Методы диагностики гепатита
В настоящее время для белковой диагностики гепатита С используются тест-системы на выявление анти-HCVcore. Первые ИФА-тесты, детектирующие наличие антител анти-HCVcore, стали доступны в начале 1990-х г., но они обладали низкой чувствительностью и селективностью. Позднее, в конце 90-х гг., появились ИФА-тесты на анти-HCVcore нового поколения, которые обладали достаточно высокой чувствительностью около 95-99% и могли выявлять ВГС спустя несколько месяцев после инфицирования [122, 123].
Например, в 1996 г. на российском рынке появились тест-системы, разработанные в «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Диагностических системах» (Нижний Новгород) для выявления антител - анти-HCV класса IgM. Роль антител класса IgM в серодиагностике изучена недостаточно, однако некоторыми исследованиями показано значение данного маркера для выявления хронического гепатита С [124-130]. Установлено также, что корреляция между выявлением РНК вируса и анти-HCV IgM у больных составляет 80-95% [129, 130]. Для определения фазы развития вирусного гепатита С Афанасьев А.Ю. с соавторами использовали коэффициент, отражающий отношение содержания в крови больных анти-HCV IgG к анти-HCV IgM [123, 130]. На сегодняшний день разработано множество систем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), которые обнаруживают циркулирующие антитела ко многим эпитопам,вируса гепатита Є.
Современная лабораторная диагностика: вирусного гепатита Є в большинстве лечебных учреждений г.. Москвы, осуществляется; в соответствии с существующими приказами Минздрава РФ и Департамента Здравоохранения: г. Москвы [131-133] и заключается в определении иммуноглобулинов? класса G к вирусу гепатита Є (анти-HGV IgG) в сыворотке крови больных. Выявление данного маркера позволяет судить, о наличии текущешили перенесенной инфекции.
Недостатки методов;. детекции на основе EEISA, помимо, низкой чувствительности (более ГО"12 M)j обусловлены также ложной- детекцией; вирусного гепатита Є у пациентов- вследствие постинфекционного-иммунитета,., кросс-реактивности антител, а также недостаточной чувствительностью в. период острой) фазы BFG [134]. BI СВЯЗИ? С: ЭТИМ продолжаются активные поиски; чувствительных,, специфичных, быстрых и простых в исполнении методов детекции1маркеров «гепатита Є [135].
Другая- группа методов детекции, вирусного гепатита в сыворотке: крови заключается-ВІрегистрации;РНК ВЕЄ с помощью ПЦР; Определение РНК. BFG методами; ГЩР не может использоваться в качестве первичного теста для - подтверждения или исключения; диагноза; но; может быть; полезен для подтверждения диагноза: Диагностика1 BFG осуществляется посредством анализа 5 -некодируемого участка РНК. Однако результаты анализа варьируют.среди разных генотипов BFG.
На российском рынке появились биологические микрочипы, позволяющие проводить- генотипирование BFG и- определять, эффективную, схему противирусной; терапии. Данный биочип- представляет собой олигонуклеотидныйшикрочип для генотипирования BFG на основе анализа области NS5B. Полученные результаты свидетельствуют о способности биочипа идентифицировать все 6 генотипов и 36 подтипов ВГС, в том числе наиболее вирулентные и лекарственно устойчивые формы.
С одной стороны, методы ПЦР-анализа сверхчувствительны и позволяют детектировать и амплифицировать сигнал всего от одной молекулы РНК в образце, но с другой стороны, для этих методов характерны ложноположительные результаты вследствие случайной контаминации образцов, ложноотрицательные результаты из-за высокой мутируемости вируса и сравнительно высокая стоимость анализа. Даже у одного и того же человека уровень РНК ВГС может периодически изменяться более чем в миллиотраз, приводяк ложноотрицательным результатам, в случае низкой? репликации вируса или если вирус сохраняется в тканях, не попадая в кровь. Результаты количественного определения РІЖ, ВГС в.разных лабораториях недостаточно хорошо согласуются [136-138].
Особую ценность для ранней детекции вирусного гепатита С Bt биоматериале представляют белковые антигены ВГС в связи с тем, что появляются1 в сывороткекрови на несколько недель раньше, еще до-развития полноценного иммунного ответа организма.
Поверхностныйантиген HCVcoreAg вируса гепатита С является основным маркером инфицирования- вирусом, гепатита С. Он обнаруживается за 16 недель до появления антител в крови вследствие иммунного ответа организма и до развития клинических признаков, при этом- он регистрируются как в,острую, так и в хроническую фазы заболевания [139]. Существует лишь один зарубежный коммерческий продукт («Ortho Clinical Diagnostics») ИФА-диагностики гепатита С в период острой фазы, основанный, на детекции HCVcoreAg.
Структурный белок HCVcoreAg, состоящий из 121 аминокислотного остатка, расположен на N-конце полипептида и образуется под воздействием клеточных протеаз [140-144]. Первый протеолитический гидролиз происходит между остатками 191 и 192 (сайт С1) и-приводит к образованию гликопротеина Е1 [144]. Второе место разрезания (С2) находится-между 174 и 191 аминокислотами.. Соответствующие продукты разрезания получили названия р21 и р23 [145]. Анализ экспрессии в ряде клеток млекопитающих показал, что р21 является основным продуктом, а, р23 обнаруживается в минорных количествах. Возможно, что расщепление по сайтам С1 и С2 -взаимосвязанные процессы, поскольку р21 образуется в условиях, когда гидролиза по G2 не наблюдается [Г45]. HCVcoreAg представляет собой основные РНК-связывающий белок, который по-видимому, формирует вирусный нуклеокапсид. Биохимические- свойства этого- белка до сих пор плохо охарактеризованы. Исследования методом- АСМ" вирусных частиц гепатита С позволили получить изображение капсида HCV [89] .
АСМ-чипы
В экспериментальной части работы использовались два типа АСМ-чипов. С помощью первого типа проводилась МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипов. Эти чипы представляли собой подложки с функционально активными химическими группами, (далее называемые АСМ-чипы с химически активированной поверхностью), на которую были выловлены исследуемые молекулы и необратимо иммобилизованы за счет ковалентных связей, так называемая процедура «химического фишинга». Второй- тип АСМ-чипов использовался для МС-идентификации на- их поверхности белков, биоспецифически выловленных из,раствора аналита. На поверхности данных чипов- в- рабочих зонах, предварительно были иммобилизованы биологические зонды. В качестве биологических зондов использовались моноклональные антитела против- маркерных белков вирусных гепатитов В и.С (BFB и BFC) илиаптамерьр против белка gpl20 и тромбина. Для, процедуры биоспецифического-фишинга чипы с ковалентно иммобилизованными молекулами-зондами инкубировались. в% растворе аналита, содержащий только детектируемый белок, либо образцы сыворотки кровш
Для выполнения задачи МС-идентификации модельных белков, ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов первого типа, в работе были использованы: авидин (Agilent, США), HSA (Agilent, США), Р450 ВМЗ (любезно предоставленный профессором А.В. Мунро, Манчестерский университет, Великобритания), тромбин (Sigma, США), a-FP и анти-a-FP (USBio, США); Для выполнения задачи МС-идентификации белков на поверхности АСМ-чипов второго типа, биоспецифически выловленных из раствора аналита, в качестве молекул-зондов использовались моноклональные антитела (МКА): анти-HCVcore (Virogen, США), анти-HBVcore (НИИ молекулярной диагностики, Москва), анти-HBsAg (Aldevron, США), в качестве молекул-мишени: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, США) и HBsAg (Aldevron, США), gpl20 (Sigma, США), тропонин (USBio, США).
Кроме того, в работе использовались следующие вещества: ацетонитрил, изопропанол, муравьиная кислота, дистиллированная вода (Merck, США), трифторуксусная кислота (ТФУ), бикарбонат аммония (Sigma, США), а-циано-4-гидроксикоричнаЯі кислота (НССА), дигидроксибензойная кислота-(DHB) (Bruker Daltonics, Германия), трипсин (Promega, США).
Образцы сывороток крови для АСМ-исследованияг были предоставлены Кафедрой инфекционных- болезней у детей РГМУ, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, МНИИЭМ" им. Габричевского: Наличие частиц вируса гепатита С (HCV) в, образцах сывороток крови подтверждалось с помощькь метода полимеразной{цепнойфеакции(ПЦР) с использованием тест-системы "Амплисенс HCV Монитор" (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).
АСМ-анализ проводился в лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН. Подсчет белков и комплексов антиген/антитело- на поверхности АСМ-чипа проводился на- основе соотнесения высот соответствующих изображений белков и их комплексов, измеренных с помощью- АСМ, согласно методике, изложенной в [89]. Был использован» ACM NTEGRA (NT-MDT, Россия). АСМ-измерения проводились в полуконтактношмоде. В качестве зондов использовались кантилеверы фирмы NT-MDT серии NSG10. Типичный радиус кривизны игл составлял 10 нм, резонансная частота лежала в пределах от 190 до 325 кГц. Площадь сканирования чипа составляла 400 мкм2. Каждое измерение проводилось не менее 3 раз.
Иммобилизацию белков и аптамеров на поверхность АСМ-чипа проводили по следующей процедуре.
К белковому раствору (0,1 цМ) объемом 2 мкл добавляли 8 мкл раствора смеси NHS/EDC (v/v=l/l) и тщательно перемешивали. Полученную смесь наносили на поверхность силанизированного-чипа и инкубировали в течение 2 минут при комнатной температуре. Чип затем дважды промывали в термошейкере 1 мл деионизованной воды при 800 rpm и 37С. Качество иммобилизации .белков на поверхности АСМ-чипа контролировалось атомно-силовой микроскопией.
Иммобилизация аптамеров на химически активированную поверхность АЄМ-чипа проводилась следующим образом. К стоковому раствору DSP концентрацией 1,2 мМ в DMSO/этанол (v/v=l/l)4 добавляли раствор буфера PBS 50 мМ (рН 7.4,) также в соотношении 1/1 по объему. Полученный-таким образом рабочий раствор наносили, на поверхность АСМ-чипа и инкубировали в течение 10 минут. После чего проводили отмывку 50%-ным раствором-этанола в, воде объемом 1 мл при 15С в течение 10 минут. Раствор аптамера с концентрацией 3 JIM наносили на активированную зону АСМ-чипа и инкубировали в течение 4 минут и при перемешивании со скоростью 800 об./мин. Блокирование непрореагировавших аминогрупп кросс-линкера DSP осуществлялось в присутствии 5 мМ раствора Tris-HCl в течение 10 минут при 37С Заключительная стадия отмывки проводилась дважды водным раствором объемом 1 мл в течение 10 минут при 25С.
На поверхность АСМ-чипа с иммобилизованными молекулами-зондами наносилась трипсинолитическая смесь, содержащая буферный раствор 150 мМ NH4HCO3, ацетонитрил, 0,5 М гуанидин гидрохлорид, глицерол (рН 7,4). Затем к буферному раствору добавлялось 0,5 мкл раствора свиного модифицированного трипсина с концентрацией 0,1 мкМ. АСМ-чип инкубировался во влажной среде в течение 2 часов при постоянной температуре 45С, на его поверхность снова добавлялось 0,5 мкл раствора трипсина (0,1 мкМ), и инкубация продолжалась еще 12 часов. Трипсинолитическая смесь смывалась с поверхности АСМ-чипа раствором элюции объемом 10 мкл, содержащим 70% ацетонитрил в 0,7% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Полученный таким образом с поверхности АСМ-чипа гидролизат высушивался в вакуумном испарителе при 45С и 4200 об./мин. Далее пептидная смесь растворялась в 10 мкл 5% раствора муравьиной кислоты или в 10 мкл 0,7% раствора ТФУ для проведения последующего МС-анализа.
При проведении МС-анализа с МАЛДИ-типом ионизации подготовка образцов осуществлялась следующим образом. Пробы, растворенные в 0,7% растворе ТФУ объемом 10 мкл, концентрировались и обессоливались с использованием микронаконечников ZipTip С18 (Millipore, США) в соответствии с протоколом производителя и смешивались с насыщенным раствором матрицы, содержащей НССА или DHB в 50% растворе ацетонитрила с 0,7% ТФУ. Полученную смесь наносили на МАЛДИ-мишень размера МТР.
-идентификация белков, выловленных с помощью «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита
На данном этапе экспериментальной работы были получены МС-спектры для модельных белков, химически иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов из раствора аналита. Диапазон концентраций исследуемых белков в растворе аналита для авидина, HSA, анти-aFP составлял 10" -10"9 М, тропонина, aFP и Р450 ВМЗ - 10"6-10"8 М.
МС-анализ проводился для 6 типов белков, различных по своему происхождению, молекулярной массе, количеству сайтов трипсинолиза и их пространственной доступности, степени гидрофобности аминокислотной последовательности (соотношение гидрофобных аминокислот к гидрофильным), которые были ковалентно иммобилизованы на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита (таблица 1). В, данных экспериментах использовались АСМ-чипы, которые содержали рабочую и контрольную зоны. Рабочая зона являлась химически» активированной областью поверхности АСМ-чипа, на которой происходил «химический фишинг» модельных белков; контрольной зоной являлась химически неактивная область поверхности чипа. Подсчет визуализированных выловленных молекул регистрировали с помощью АСМ. Экспериментальные данные АСМ-анализа, полученные для вышеперечисленных модельных белков, а именно число молекул, выловленных на поверхности рабочей зоны АСМ-чипа, представлены в таблице 2. В колонке «концентрация белковых молекул в растворе» таблицы 2 приведены данные для минимально зарегистрированной концентрации соответствующего- белка в растворе аналита.
Как видно из таблицьг2, число молекул, зарегистрированных в рабочей зоне АСМ-чипа для всех представленных белков, составило -1040 молекул. Предел чувствительности МС-детекторов составляет около 105 молекул. Таким образом, для представленных модельных белков была проведена успешная необратимая иммобилизация на поверхности АСМ-чипа, и количества АСМ-зарегистрированных белковых объектов было достаточно для последующей МС-идентификации. При этом минимально зарегистрированная концентрация модельных белков в инкубационном растворе была при этом достаточно низкой 10" -10" М.
Масс-спектрометрический анализ образцов проводили с использованием МАЛДИ- и ЭСИ-типов ионизации. АСМ-чипа после инкубации в соответствующем растворе авидина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать авидин {Gallus Gallus) по двум его протеотипическим пептидам: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) и VGINIFTR (m/z=460,4). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двухзарядных ионов (МС-спектры). С помощью АСМ-МС анализа химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в растворе белка аналита концентрацией 10"8 М был выявлен другой небольшой белок — тропонин I. Соответствующие пептидному двухзарядному иону 1449 Да МС- и МС/МС-спектры представлены на рисунке 3. МС-анализ экспериментально полученных спектров, позволил достоверно с вероятностью более 95% выявить и идентифицировать тропонин человека (gi 2460249) на поверхности АСМ-чипа.
На рисунке 5 представлены тандемные спектры фрагментации глобулярного белка - сывороточного альбумина человека (HSA), который выполняет в плазме крови транспортные функции. Спектры были получены с химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в соответствующем- растворе альбумина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать альбумин человека по двум его протеотипическим пептидам: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756,5) и YLYEIAR (m/z=464,3). Оба пептида имели хорошо выраженные пики своих двузарядных ионов (МС-спектры).
МС/МС спектры трипсинолизованных объектов с химически активированной поверхности АСМ-чипа, инкубированного в растворе сывороточного альбумина человека (С=10 9 М). Пептид VPQVSTPTLVEVSR с m/z=756,5 (А), пептид YLYEIAR с m/z=464,3 (Б). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).
Таким образом, МС-анализ позволил идентифицировать белки, обнаруженные с помощью АСМ. На основании- полученных данных была выявлена зависимость между числом идентифицированных протеотипических пептидов на поверхности АСМ-чипа и содержанием искомого белка в растворе аналита. Такая зависимость, например, для белков Р450 ВМЗ и HSA, ковалентно иммобилизованных на химически активированной поверхности АСМ-чипа, приведена на рисунке 6. Как видно на рисунке 6, чем выше концентрация белка в растворе аналита (-КГ6 М), тем большее число пептидов удается достоверно идентифицировать как в случае МАЛДИ-МС-, так и ЭСИ-МС-анализа. Значительных различий между числом идентифицированных пептидов в диапазоне концентраций 10"6-10"9 М среди анализируемых белков в растворе аналита не наблюдалось.
Зависимости числа идентифицированных пептидов молекул аналита от концентрации белка в инкубационном растворе. (А) — анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометрах с МАЛДИ-типом ионизации Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Германия) и Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия); (Б) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометре с ЭСИ-типом ионизации LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, США).
Полученные результаты позволили заключить, что АСМ-МС (МАЛДИ и ЭСИ) позволяет выявлять и идентифицировать ковалентно выловленные из раствора аналита на поверхности АСМ-чипа белковые молекулы, различные по своим физико-химическим свойствам.
В то же время, в контрольной зоне АСМ-чипа (неактивированной) после его инкубации в растворе аналита, методом АСМ не было зарегистрировано наличия на поверхности чипа объектов, соответствующих по высоте белковым молекулам. МС-анализ также не выявил объектов белковой природы. Таким образом, экспериментально было доказано, что АСМ адекватно регистрирует искомые объекты - белковые молекулы аналита.
Следующим этапом данной работы стала отработка схемы комбинации АСМ-МС для идентификации белков, выловленных из раствора за. счет биоспефических взаимодействий.
Схема проведения, масс-спектрометрического анализа- в случае биоспецифического АСМ-фишинга белков из раствора представлена на рисунке 7. Согласно приведенной схеме сначала проводилась иммобилизация молекул-зондов на поверхность рабочей, области АСМ-чипов, в качестве которых выступала моноклональные1 антитела против белковых маркеров вирусных гепатитов В и С или аптамеры против белков гликопротеина ВИЧ-1 gpl20 и тромбина, при этом поверхность контрольной зоны» не содержала иммобилизованных молекул-зондов. Контроль качества иммобилизации молекул-зондов проводили путем AGM-визуализации. Затем такой чип инкубировали в растворе аналита, содержащий исследуемый белок. После стадии отмывки от неспецифически сорбированных молекул на поверхности чипа, и этапа подготовки образца для последующего масс спектрометрического анализа на поверхности АСМ-чипа проводили МС-анализ АСМ-зарегистрированных белков.
Экспериментальная часть данного раздела подразумевала проведение двух этапов анализа. На первом этапе необходимо было провести МС-идентификацию ковалентно иммобилизованных на АСМ-чипе белковых молекул-зондов, на втором этапе - белков-мишеней, выловленных на соответствующие молекулы-партнеры из раствора или из образцов сыворотки крови за счет биоспецифических взаимодействий. Для этого был проведен МС-анализ ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов МКА против маркерных белков ВГС и ВГВ: анти-HCVcore и анти-HBVcore. Для МКА против белков анти-HCVcore и анти-HBVcore в настоящей работе впервые были получены тандемные спектры фрагментации и спектры пептидных карт.
