Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Малые нуклеиновые кислоты как регуляторы экспрессии генов ... 12
1.1.1 Антисмысловые олигонуклеотиды (Рациональный подход) 13
1.1.1.1 Влияние олигонуклеотидов основанное на конкуренции с нуклеиновыми кислотами 13
Подавление транскрипции 14
Подавление сплайсинга 14
Подавление трансляции 15
Изменение структуры РНК 15
1.1.1.2 Активация РНКазы Н 16
1.1.1.3 РНК - интерференция 16
1.1.2 Нуклеиновые аптамеры (Иррациональный подход) 18
1.1.3 Механизмы проникновения малых нуклеиновых кислот в клетки 18
1.1.3.1 Жидкофазный эндоцитоз 19
1.1.3.2 Рецептор-опосредованный эндоцитоз 19
1.1.4 Распределение олигонуклеотидов внутри клетки 21
1.2 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа... 23
1.2.1 Структура фермента 25
1.2.2 Участие GAPDH в слиянии клеточных мембран, взаимодействии с микротрубочками и везикулярном транспорте 27
1.2.3 Взаимодействие GAPDH с нуклеиновыми кислотами 39
1.2.3.1 GAPDH - ДНК/РНК-связывающий белок (физико-химические характеристики взаимодействия GAPDH с нуклеиновыми кислотами) 39
1.2.3.2 Модификации и полимерные структуры GAPDH и их роль во взаимодействии фермента с нуклеиновыми кислотами 46
1.2.3.3 Сайт GAPDH, ответственный за связывание нуклеиновых кислот 4$
1.2.3.4 Влияние взаимодействия GAPDH с нуклеиновыми кислотами на оксидоредуктазную активность фермента 51
1.2.3.5 Функциональная роль взаимодействия GAPDH с нуклеиновыми кислотами 52
Транспортная функция 52
GAPDH - регулятор транскрипции 54
Защита нуклеиновых кислот от гидролиза 56
GAPDH - катализатор активности рибозимов 56
GAPDH и патогенез РНК-содержащих вирусов 57
Хеликазные свойства GAPDH 59
Участие GAPDH в поддержке структуры теломер 60
GAPDH и репарация ДНК 61
1.2.4 GAPDH и клеточный апоптоз. Взаимодействие с SiaHl протеазой 61
1.3 Заключение .62
2 Экспериментальная часть 65
2.1 Реактивы н материалы . ...65
2.1.1 Реактивы 65
2.1.2 Олигонуклеотиды 66
2.1.3 Ферменты 67
2.1.4 Клеточные линии, использовавшиеся в работе, и условия их культивирования 67
2.1.5 Буферы, среды и основные стоковые растворы 68
2.2 Методы 70
2.2.1 Электрофорез олигонуклеотидов, белков, ДНК 70
2.2.2 Определение концентрации белка 71
2.2.3 Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов 72
2.2.4 Получение и очистка 32Р-меченных олигонуклеотидов 72
2.2.5 Синтез модифицированных олигонуклеотидов 72
2.2.6 Приготовление ядерного экстракта клеток HeLa 73
2.2.7 Определение молекулярной массы белков 74
2.2.8 Приготовление компетентных клеток Е. coli 74
2.2.9 Подготовка плазмиды pBlueScript Н(ТА) для прямого клонирования ПЦР продуктов 74
2.2.10 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 75
2.2.11 Активация ультрагеля А2 бромцианом 76
2.2.12 Приготовление слайдов и микроскопия 76
2.2.13 Получение клеточных фракций. Анализ распределения олигонуклеотид-связывающих белков по фракциям 77
2.2.14 Ступенчатое сульфат-аммонийное фракционирование белков ядерного экстракта 78
2.2.15 Аффинная хроматография олигонуклеотид-связывающих белков 78
2.2.16 Выделение глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы из эритроцитов человека 79
2.2.17 Исследование стабильности олигонуклеотидного производного ClR-pN16 и ClR-p(N)t6 79
2.2.18 Определение величин констант диссоциации (Kj) олнгонуклеотид-белковых комплексов 80
2.2.19 Исследование влияния потенциальных конкурентов различной природы на взаимодействие глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы с олигонуклеотидами 81
2.2.20 Исследование влияния олигонуклеотидов на оксидоредуктазную активность глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы 81
2.2.21 Исследование олигонуклеотид-связывающего центра глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы 82
2.2.22 Определение урацил-ДНК-гликозилазной активности препарата GAPDH 82
2.2.23 ПЦР-сплайсинг гена gapdh человека 83
2.2.24 Клонирование и экспрессия гена gapdh человека в Е. coli 84
2.2.25 Выделение рекомбинантного препарата глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы
человека из клеток Е. coli 86
2.2.26 Поиск олигонуклеотидов, обладающих повышенным сродством к GAPDH методом молекулярной селекции 87
2.2.27 Получение и характеризация поликлональных антител кролика против GAPDH 88
2.2.28 Выделение пула антител, специфически взаимодействующих с GAPDH 89
2.2.29 Иммунопреципитация комплекса GAPDH-олигонуклеотид антителами против GAPDH из ядерного экстракта клеток HeLa 90
3 Результаты и их обсуждение 91
3.1 Исследование олигонуклеотид-связывающего белка р38 клеток линии HeLa... 91
3.1.1 Модификация белков ядерного экстракта алкилирующими производными олигонуклеотидов различных последовательностей 92
3.1.2 Исследование внутриклеточного распределения р38 в клетках линий HeLa, А431 и HaCat 95
3.1.3 Определение константы диссоциации олигонуклеотид-белкового комплекса 98
3.2 Выделение и идентификация олигонуклеотид-связывающего белка ... 99
3.2.1 Выделение р38 из ядерного экстракта клеток линии HeLa 99
3.2.1.1 Ступенчатое сульфат-аммонийное фракционирование ядерного экстракта клеток
линии HeLa 100
3.2.1.2 Аффинная хроматография 102
3.2.2 Определение первичной структуры р38 102
3 .3 Исследование олигонуклеотид-связывающих свойств глицеральдегид-3-фосфат
дегидрогеназы 104
3.3.1 GAPDH - клеточный белок р38, участвующий в селективной доставке олигонуклеотида
pN21 в ядра клеток 104
3.3.2 Изучение олигонуклеотид-связывающего центра GAPDH. Влияние взаимодействия
нуклеиновых кислот с GAPDH на ее" ферментативную активность 107
3.3.2.1 Изучение влияния потенциальных конкурентов различной природы на взаимодействие GAPDH с олигонуклеотидами 108
3.3.2.2 Влияние ДНК и РНК на ферментативную активность GAPDH 110
3.3.2.3 Локализация сайта, ответственного за связывание GAPDH с олигонуклеотидами, методом пептидного гидролиза 112
3.3.3 Поиск олигонуклеотидов, обладающих повышенным сродством к GAPDH методом
молекулярной селекции 115
3.3.3.1 ПЦР-сплайсинг гена ga/к/й 115
3.3.3.2 Клонирование и экспрессия гена gapdh человека в Е. coli 117
3.3.3.3 Молекулярная селекция 119
3.3.3.4 Определение величины Ка комплекса GAPDH с олигонуклеотидом pN42 120
3.3.4 Сравнительное исследование распределения GAPDH и комплекса GAPDH-олигонуклеотид между ядром и цитоплазмой клеток линий А431, HeLa и HaCat 121
Выводы 126
Список литературы 127
- Малые нуклеиновые кислоты как регуляторы экспрессии генов
- Механизмы проникновения малых нуклеиновых кислот в клетки
- Клеточные линии, использовавшиеся в работе, и условия их культивирования
- Модификация белков ядерного экстракта алкилирующими производными олигонуклеотидов различных последовательностей
Введение к работе
В последнее десятилетие стало очевидно, что малые одно- и двуцепочечные нуклеиновые кислоты играют важную роль в процессах модуляции экспрессии генов и в регуляции ферментативной активности белков [2]. Доступность полной последовательности генома многих организмов, в том числе и человека, а также успехи в разработке методов молекулярной селекции, позволяют создавать синтетические аналоги малых нуклеиновых кислот и использовать их, для влияния на процессы, происходящие как внутри одной клетки, так и в организме в целом [2-5]. К сожалению, сложность доставки нуклеиновых кислот в клетки и клеточные компартменты, проблема направленной доставки нуклеиновых кислот в органы и ткани, а также неспецифические эффекты, вызываемые нуклеиновыми кислотами, стоят на пути их массового внедрения в медицинскую практику [2,6]. Эти препятствия в будущем будут преодолены благодаря появлению новых данных о поведении малых нуклеиновых кислот в биологических системах [6]. Накопление эмпирических знаний позволит создать модели, с высокой точностью предсказывающие биологические эффекты таких молекул, что сделает возможным внедрение нуклеиновых кислот в повседневную медицинскую практику в качестве средств индивидуальной терапии специфического действия.
Данная работа посвящена изучению поведения синтетических малых дезоксирибонуклеиновых кислот в клетках карциномы человека. В основе работы лежит наблюдение Griffoni и соавторов, которые, изучая влияние антисмысловых олигонуклеотидов на экспрессию гена фосфолипазы А2, обнаружили, что олигонуклеотид cPLA2 специфически взаимодействуют с одним из белков ядерного экстракта и, что такое взаимодействие, возможно, способствует более эффективному проникновению олигонуклеотида в ядра клеток [1]. Идентификация такого белка представляет большой интерес, поскольку открывает перспективы для сиквенс-специфичной доставки нуклеиновых кислот в ядра клеток, что потенциально позволит достигать специфический эффект при более низкой дозе препарата, снижать общую токсическую нагрузку и расход олигонуклеотидов. Кроме того, изучение физико-химических характеристик взаимодействия нуклеиновых кислот с таким белком и влияния нуклеиновых кислот на функционирование связывающих их белков, дополнит общую модель поведения малых нуклеиновых кислот в клетке и организме. Материал, представленный в работе, демонстрирует, что таким белком, способствующим более эффективной доставке антисмыслового олигонуклеотида cPLA2 в ядра клеток, является глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH).
На протяжении длительного времени GAPDH считалась белком "домашнего хозяйства", катализирующим в процессе гликолиза реакцию окисления D-глицеральдегид-3-фосфата, сопряженную с фосфорилированием [7]. Фермент, так же как и кодирующий его ген, представлен во многих научных работах и учебниках как образец понимания механизма ферментативной реакции, организации структуры гена и регуляции его экспрессии. Интересно, что GAPDH является очень консервативным белком, медленно меняющемся в ходе эволюции. Так, разница между белком человека и Е. coli составляет всего 30 аминокислотных оснований (из 334). Столь высокая степень консервативности может свидетельствовать о том, что помимо гликолиза, GAPDH возможно выполняет другие функции в клетке. Действительно, на протяжении последних трех десятилетий было показано участие белка во многих клеточных процессах, зачастую не связанных с гликолизом, таких как, например, ядерный экспорт RNA [8,9], фосфотрансферазная активность [10], участие в репликации и репарации ДНК [11,12], регуляция экспрессии генов гистонов [13], участие в процессе слияния ядерных мембран [14] и сборке микротрубочек [15-19]. Было также обнаружено, что при определенных условиях GAPDH в значительных количествах перемещается в ядро клетки. Более того, GAPDH может эффективно связываться с нуклеиновыми кислотами, и такое взаимодействие, по-видимому, играет немаловажную роль в функционировании клетки [20,21].
В настоящей работе дана оценка эффективности такого взаимодействия, определен участок фермента, ответственный за связывание нуклеиновых кислот, а так же оценено влияние взаимодействия на оксидоредуктазную активность фермента. Использование генно-инженерного препарата GAPDH и метода молекулярной селекции, позволило установить последовательность одноцепочечной ДНК, наиболее эффективно взаимодействующая с ферментом. В клеточной системе показано, что комплексы GAPDH-оцДНК эффективно транспортируются в ядра клеток.
Целью настоящей работы являлась идентификация клеточного олигонуклеотид-связывающего белка р38 и исследование его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- Выделить и идентифицировать олигонуклеотид-связывающий белок р38 клеток человека. - Определить специфичность связывания р38 с олигонуклеотидами определенной
последовательности, поиск нуклеотидного мотива - сайта связывания белка.
- Локализовать олигонуклеотид-связывающий домен р38.
- Получить антитела против р38 и с их помощью исследовать локализацию белка в клетке и роль в транспорте нуклеиновых кислот.
Малые нуклеиновые кислоты как регуляторы экспрессии генов
Одним из путей изменения биологической активности белков является связывание с ними конкурентов природного лиганда. Таким же образом взаимодействие, либо конкуренция, олигонуклеотидов со специфическими последовательностями может подавлять взаимодействия РНК или ДНК с белками, другими нуклеиновыми кислотами или факторами, необходимыми для процессинга РНК или утилизации ее клеткой. Подавление транскрипции
Поскольку транскрипция ведет к увеличению копийности гена в клетке, ингибирование экспрессии гена на этом этапе требует гораздо меньших количеств антисмысловых олигонуклеотидов.
Теоретически, олигонуклеотиды могут связываться с частично денатурированными фрагментами ДНК и, таким образом, ингибировать инициацию, либо элонгацию транскрипции. В настоящее время экспериментальные данные, доказывающие существование такого механизма, отсутствуют. Более того, многообразие транскрипционных факторов делают практически невозможным создание теоретических моделей такого механизма в отсутствии достаточного количества экспериментальных данных. Тем не менее, в научных публикациях встречаются сообщения о биологических эффектах вызываемых олигонуклеотидами, которые лучше всего описывается именно этим механизмом [2].
Альтернативный способ ингибирования транскрипции предполагает взаимодействие олигонуклеотидов не с одноцепочечным участком ДНК, а с двухцепочечным, что в результате приводит к формированию триплекса, препятствующего связыванию с ним факторов транскрипции [31]. Однако использование олигонуклеотидов, формирующих триплексы, сопряжено с определенными трудностями, так как эффективность формирования такого комплекса не может быть оценена теоретически и требует экспериментальных подходов для поиска первичной последовательности олигонуклеотидов, эффективно взаимодействующих с мишенью. К тому же, такой механизм подавления транскрипции обладает очевидным недостатком, поскольку ведет к увеличению мутагенности, канцерогенности и тератогенности [31].
Подавление сплайсинга
Вырезание нитронов является ключевым этапом созревания РНК. Реакции сплайсинга сиквенс-специфичны и требуют согласованного действия различных факторов сплайсинга РНК и белковой природы. Взаимодействие олигонуклеотидов с последовательностями, необходимыми для связывания факторов сплайсинга может ингибировать вырезание интронов, что должно приводить к снижению продукции зрелой мРНК и, как следствие, экспрессии гена.
К настоящему времени получены данные, позволяющие утверждать, что одним из механизмов действия антисмысловых олигонуклеотиды является влияние, оказываемое ими на механизмы сплайсинга пре-мРНК. Sierakowska и соавторы [32] продемонстрировали коррекцию сплайсинга талассемической пре-мРНК р-глобина при обработке клеток HeLa и NIH ЗТЗ катионными липосомами, содержащими 2 -0-метил-олигорибонуклеотиды. Condon и Bennet [33] показали нарушение сплайсинга пре-мРНК гена Е-селектина после обработки клеток линии HUVEC олигонуклеотидами, комплементарными З -нетранслируемой области РНК. Таким образом, влияние олигонуклеотидов на сплайсинг экспериментально доказано.
Подавление трансляции
Считается, что подавление трансляции является одним из основных механизмов действия антисмысловых олигонуклеотидов. Структура большинства таких соединений разрабатывается с учетом этого механизма. Подавление трансляции происходит за счет связывании олигонуклеотида с сайтом инициации трансляции. Показано, что такое связывание подавляет трансляцию РНК вирусов и генов клетки. Так, Mirabelli и соавторы показали, что олигонуклеотид, комплементарный области инициации трансляции гена UL13 вируса герпеса, подавляет трансляцию этого гена. В дальнейшем связывание олигонуклеотида с комплементарной областью подтвердилось в экспериментах с РНКазойН [34]. Cowrsert [35] и соавторы показали, что 21-звенный фосфоротиатный олигонуклеотид, комплементарный области инициации трансляции вируса гапиломы человека, эффективно подавляет процесс инициации трансляции. Список работ в которых достоверно показано, что подавление трансляции является одним из механизмов действия антисмысловых олигонуклеотидов широк и может быть найден в обзоре Faria и Ulrich [27].
Изменение структуры РНК
Известно, что первичная структура молекулы РНК обуславливает ее стабильность, процессинг, внутриклеточное распределение и транспорт. 5 -кэп важен для стабилизации мРНК, связывания молекулы с ядерным матриксом и транспорта молекул мРНК из ядра. Поскольку структура кэпа уникальна и хорошо изучена, он представляет отличную мишень для антисмысловых олигонуклеотидов. Показано, что олигонуклеотиды, которые связываются в непосредственной близости от сайта кэпирования, ингибируют этот процесс предположительно за счет подавления связывания белков, требующихся для кэпирования [36].
З -Полиаденилирование так же стабилизирует молекулу мРНК. Можно предположить, что взаимодействие с 3 -нетранслируемой областью пре-мРНК может ингибировать полиаденилирование и дестабилизировать молекулу мРНК, однако четких доказательств того, что такой процесс реально происходит, не получено.
Механизмы проникновения малых нуклеиновых кислот в клетки
При исследовании влияния тринуклеотида (2 -5 ) рАз на активность киллерных клеток и макрофагов Lui и соавторы высказали предположение о существовании рецептора к нуклеиновым кислотам. Оказалось, что связывание меченного тритием тринуклеотида (2 -5 ) рАз с клетками является насыщаемым, лиганд-специфическим и обратимым [46]. Loke и соавторы выделили олигонуклеотид-связывающий белок с молекулярной массой 80 кДа из HL60 клеток хроматографией на олиго (dT) целлюлозе. Для изучения взаимодействия олигонуклеотидов с клеточными белками, Yakubov и соавторы [47] использовали реакционноспособное производное олигонуклеотида, способное алкилировать нуклеофильные центры в нуклеиновых кислотах и белках. При добавлении алкилирующего производного олигонуклеотида в среду культивирования клеток L 929 (фибробласты мыши), происходит модификация клеточного белка с молекулярной массой 79кДа. Взаимодействие олигонуклеотидов с этим белком является специфическим, так как тРНК, оц- и дцДНК ингибируют модификацию белка, тогда как полианионы (гепарин и хондроитинсульфаты А и Б) не оказывают ингибирующего влияния на алкилирование. Другие авторы [48] для исследования взаимодействия олигонуклеотидов с клетками использовали радиоактивномеченный реагент, имеющий фотоактивируемую группу. С помощью этого реагента было обнаружено несколько белков. Основным меченым продуктом в интактных клетках был белок с молекулярной массой 75 кДа.
В работе Goodarzi и соавторов был обнаружен мембранный белок с молекулярной массой 28 кДа, обладающий сродством к олигонуклеотиду. Взаимодействие ДНК фага X с очищенными полиморфноядерными лейкоцитами и другими субпопуляциями лимфоидных клеток также опосредовалось рецептором с молекулярной массой ЗОкДа. Связывание ДНК с этими клетками характеризовалось высокой аффинностью (Ка=10 нМ) и специфичностью. Взаимодействие конкурентно ингибировалось ДНК и не ингибировалось мононуклеотидами, РНК, поли d(AT) [49].
При выявлении олигонуклеотид-связывающих белков на поверхности клеток человеческой эритромиелоидной линии К562, Beltinger и соавторы для модификации белков использовали биотинилированный фосфоротиоатный 24-звенный олигонуклеотид, с последующей обработкой комплексов поперечносшивающим реагентом бис -(сульфосукцинимидил) субератом. После выделения мембранно-цитозольной фракции и разделения модифицированных белков при помощи SDS-диск-электрофореза было выявлено 5 основных групп олигонуклеотид-связывающих белков с молекулярными массами 137-147, 79-85, 43-46, 29-32 и 20-22 кДа. Поскольку для этих же клеток было показано, что связывание носит рецептор-опосредованный характер, авторы полагают, что описанные белки могут принимать участие в транспорте нуклеиновых кислот в клетки [50].
Benimetskaya и соавторы [51], изучая взаимодействие фосфодиэфирных и фосфоротиоатных олигонуклеотидов с Мас-1 (гепарин-связывающий интегрин, найденный на поверхности полиморфноядерных лейкоцитов, макрофагов и натуральных киллеров), обнаружили, что стимуляция экспрессии Мас-1 сопровождается повышением связывания олигонуклеотидов с поверхностью клетки и их интернализации. Авторы сделали вывод о том, что Мас-1 является клеточно-поверхностным рецептором олигонуклеотидов, который опосредует их проникновение в клетку.
После проникновения олигонуклеотидов в клетку путем эндоцитоза в составе эндосом, они перераспределяются по клеточным компартментам. Механизм транспорта олигонуклеотидов через мембрану эндосомы пока неясен, однако на основании данных, полученных Achtar и соавторами [52], можно исключить вариант пассивной диффузии. После высвобождения из эндосомального компартмента олигонуклеотиды могут связываться с нуклеиновыми кислотами, находящимися как в цитоплазме, так и в ядре, причем, было показано, что фосфоротиоатные производные локализуются преимущественно в цитозольной фракции, тогда как фосфодиэфирные олигонуклеотиды присутствуют как в цитозольной, так и в ядерной фракции [53].
Для изучения распределения олигонуклеотидов в клетках был проведен ряд исследований, где для введения в клетку олигонуклеотидов использовался метод микроинъекций [54,55]. В результате микроинъекции олигонуклеотид минует клеточные компартменты, прохождение которых неизбежно при попадании его в клетку путем эндоцитоза. После инъекции в цитоплазму происходит очень быстрое - в течение нескольких минут - перераспределение FITS-производных олигонуклеотидов из цитоплазмы в ядро. Chin и соавторы [56] обнаружили, что фосфоротиоатные и фосфодиэфирные олигонуклеотиды, введенные в клетку с помощью этого метода, накапливаются в ядре, в районах с наибольшей концентрацией малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP), тогда как их метилфосфонатные аналоги обнаруживаются в районах геномной ДНК. Поскольку скорость этого процесса не зависит от температуры и наличия ATP, Leonetti и соавторы предположили, что олигонуклеотиды проникают в ядро посредством пассивной диффузии. Длина и последовательность олигонуклеотидов не влияют на их распределение внутри ядра [57].
Клеточные линии, использовавшиеся в работе, и условия их культивирования
В работе использовались клетки линий HeLa (карцинома шейки матки человека), А431 (эпидермальная карцинома человека), HaCat (кератиноциты человека) и HUVEC. Клетки культивировали на среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС в атмосфере 5% СОг при 37С на чашках Петри. Для диссоциации клеток при пересаживании использовали 0.25% раствор трипсина. Трипсин нейтрализовали ЭТС. Посадочная плотность клеток составляла ЗОхЮ3 клеток/см2. Клетки использовали на протяжении 10 пассажей, после чего размораживали клетки из заранее замороженных стоковых культур [194]. Для экспериментов по аффинной модификации клетки рассевали в лунки 24-ячеечных планшетов за 2-3 дня до эксперимента. Монослойные культуры клеток использовали в плотности не более 70% от монослоя, суспензионные в плотности не более 0.8x106 кл/мл. Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием клеток трипановым синим. Штаммы E.coli, использованные в работе - JM109 и M15[pREP4].
Буферы, среды и основные стоковые растворы ТБЕ: 0.05 М Трис, 0.05 М Н3В03,1 мМ ЭДТА, рН 8.4 ТАЕ: 40 мМ Трис-ацетат, 1мМ ЭДТА, рН 7.6 Буфер для нанесения SDS-ПААГ: 0.06 М Трис-HCl рН6.2, 2%SDS, 2%р-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 10 мкгБФС Буфер для блота: 48 мМ Трис-НСІ, 39 мМ глицин, 0.037 % SDS, 20% метанол PBS: 137 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 4.3 мМ Na2HP04x7H20, 1.4 мМ КН2Р04) рН 7.3, стерилизованный автоклавированием LB-cpeda (1 л): 10 г пептон, 5 г дрожжевой экстракт, 5 г NaCl Буферы для приготовления ядерного экстракта клеток: Гипотонический лизис-буфер: 10 мМ Hepes рН7.8, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ КС1, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, 10 мг/мл лейпептин, 10 мг/мл апротинин Гипертонический буфер: 20 мМ Hepes рН7.8, 25% глицерин, 420 мМ NaCl, 1.5MMMgCl2, 0.2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, 10 мг/мл лейпептин, 10 мг/мл апротинин
Буферы для приготовления компетентных клеток Е. coli: TFB1: 100 мМ RbCl, 50 мМ МпС12, 30 мМ КАс, 10 мМ СаС12, 15% глицерин, рН 5.8; стерилизованный фильтрацией через 0.2 мкМ фильтр TFB2: 10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 75 мМ СаС12, 15% глицерин, рН 6.8, стерилизованный фильтрацией через 0.2 мм фильтр NEBII (для подготовки плазмиды pBlueScript П(ТА) для прямого клонирования ПЦР продуктов): 10 мМ Трис-НСІ, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2) 1 мМ ДТТ, рН 7.9 Буферы для выделения плазмидной ДНК из клеток Е. coli: Буфер Р1:50 мМ Трис-НСІ, 10 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл RNase А, рН 8.0 Буфер Р2:200 мМ NaOH, 1% SDS (v/v) Буфер РЗ: 3.0 М КАс, рН 5.5 QBT: 750 мМ NaCl, 50 мМ MOPS, 15% изопропанол (v/v), 0.15% Тритон Х-100 (v/v), рН7.0 QC: 1.0 М NaCl, 50 мМ MOPS, 15% изопропанол (v/v), рН 7.0 QF: 11.25 MNaCl, 50 мМ Трис-НС1,15% изопропанол (v/v), рН 8.5 QR: 1.5 М КС1, 50 мМ Трис-НС1,15% изопропанол (v/v), рН 4.5
Лизис-буфер (для получения клеточных фракций): 0.6% Nonidet Р-40, 50 мМ Трис-НС1, 0.15 М NaCl, 5 мМ NaF, 1 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na3Mo04 Буферы для аффинной хроматографии олигонуклеотид-связывающих белков: Буфер I: 50 мМ Трис-HCl рН7.9, 1 мМ ДТТ, 12.5 мМ MgCl2x6H20, 1 мМ ЭДТА, IMMPMSF
Буфер II: 137 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl рН 7.9,12.5 мМ MgCl2x6 Н20, 6.2 мМ ЭДТА, 1мМ ДТТ, IMMPMSF Буфер III: 137 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl рН 7.9,12.5 мМ MgCl2x6 Н20,6.2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, 0.2% Tween 20
Буфер IV: 0.5 М NaCl, 20 мМ Трис-HCl рН 7.9, 12.5 мМ MgCl2x6 Н20, 6.2 мМ ЭДТА, 1мМ ДТТ, IMMPMSF Кислый буфер: 0.2 М глицин рН 2.5,0.5 М NaCl Щелочной буфер: 0.1 М Н3В03 рН 8.7,0.5 М NaCl Буферы для клонирования и экспрессии гена gapdh человека в Е. coli: Денатурирующий буфер: 0.5 М NaOH, 1.5 М NaCl Нейтрализующий буфер: 1.5 М NaCl, 0.5 М Трис-HCl, рН 7.4 20х SSC (500 мл): 87.65 г NaCl, 50.25 г цитрат натрия X 2Н20 TBS: 0.15 М NaCl, 0.01 М Трис-HCl, рН 7.5 TBSween: 0.15 М NaCl, 0.01 М Трис-НСІ, 0.05% Tween 20, рН 7.5 Блокирующий буфер: 0.15 М NaCl, 0.01 М Трис-НСІ, 10% бычья сыворотка, рН 7.5
Буфер V (для выделения GAPDH из эритроцитов): 0.005 М триэтаноламин, 0.01 М ЭДТА, 0.02 М р-меркаптоэтанол, рН 7.5.
Лизис-буфер (для исследования стабильности олигонуклеотидного производного ClRpN16): 0.6% NonidetP40, 50мМ Трис-НСІ, 0.15MNaCl, 5MMNaF, IMMPMSF, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ Na3Mo04
Реакционный буфер (для определения Kd олигонуклеотид-белковых комплексов): 50 мМ Трис-НСІ рН7.9, 12.5 мМ MgCl2, ІмМЗДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, 20% глицерин Буфер VI (для изучения олигонуклеотид-белковых комплексов): 50 мМ Трис-НСІ, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, рН 8.0 Буферы для выделения рекомбинантного препарата GAPDH из клеток Е. coli: Буфер А1: 0.25 М NaCl, 20 мМ Трис-НСІ, 1мМ Р-меркаптоэтанол, 20 мМ имидазол, рН8.0 Буфер В1: 0.25 М NaCl, 20 мМ Трис-НСІ, 1 мМ Р-меркаптоэтанол, 400 мМ имидазол, рН8.0 Буфер А: 200 мМ NaCl, 50 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 0.5 мМ фенилметилсульфонилфторид, 1 мМ МЭТ.
Буфер Б: 0.5 М NaCl, 100 мМ Трис-НСІ буфер, рН 7.5, 10% глицерин, 2 мМ ЭДТА, 1 мММЭТ. 1 Ох реакционный буфер для Lambda экзонуклеазы: 670 мМ глицин-КОН, 25 мМ MgCh, 500мкг/млВ8А,рН9.4 Буфер В: 80% формамид, 15% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 1 мг/мл ксиленцианол, 1 мг/мл бромфеноловый синий
Модификация белков ядерного экстракта алкилирующими производными олигонуклеотидов различных последовательностей
Очевидно, что внеклеточные нуклеиновые кислоты природного или синтетического происхождения могут действовать на внутриклеточные мишени. Для этого они должны проникнуть в клеточные компартменты, либо связываться с поверхностными рецепторами и индуцировать рецептор-опосредованные пути передачи сигнала. Идентификация поверхностных и внутриклеточных белков, связывающих экзогенные нуклеиновые кислоты, дает информацию о возможном влиянии нуклеиновых кислот на клеточный метаболизм и открывает перспективы использования природных механизмов транспорта синтетических молекул РНК или ДНК в клетки. Возможность эффективно доставлять нуклеиновые кислоты в клеточные компартменты позволит достичь специфического эффекта препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов и РНКи в более низких дозах, снижая общую токсическую нагрузку на клетку и организм. Кроме того, изучение физико-химических характеристик взаимодействия нуклеиновых кислот с белками, а также влияния нуклеиновых кислот на функционирование связывающих их белков дополнит общую модель поведения малых нуклеиновых кислот в клетке и организме.
В основу данной работы легло наблюдение Griffoni и соавторов, которые, изучая влияние антисмысловых олигонуклеотидов на экспрессию гена фосфолипазы А2, обнаружили, что олигонуклеотид cPLA2 локализуется преимущественно в ядрах клеток HeLa и взаимодействует с одним из белков ядерного экстракта - р38 [1]. Было сделано предположение, что такое взаимодействие способствует более эффективному проникновению олигонуклеотида в ядра клеток.
Основной задачей первого этапа исследования было изучение физико-химических свойств р38, его распределения в клетке, а также разработка подходов к выделению гомогенного препарата белка для его идентификации.
Grifoni и соавторы обнаружили, что антисмысловой олигонуклеотид cPLA2 накапливается преимущественно в ядрах клеток линии HeLa. При исследовании взаимодействия этого олигонуклеотида с ядерным экстрактом клеток HeLa методом задержки в геле было показано, что такой олигонуклеотид, в отличие от контрольного, специфически взаимодействует с белком молекулярной массы 38 кДа - р38. Изучение связывания олигонуклеотидов различной последовательности с белками ядерного экстракта позволило авторам предположить, что последовательность ТАААТ, входящая в состав олигонуклеотида cPLA2, является основным сайтом связывания р38 [1].
Поскольку данные, представленные в работе Grifoni и соавторов, были получены только на одной клеточной линии (HeLa) и только одним методом (задержкой в геле), для исследования специфичности взаимодействия в данной работе были использованы ядерные экстракты клеток линий HeLa и А431и аффинные реагенты, синтезированные на основе дезоксирибоолигонуклеотидов р(Т)н, pN16, pN16_2 и pN21 (раздел 2.1.2 «Материалы и методы»).
В качестве реакционноспособной группы для синтеза аффинных реагентов был выбран 4-[(М-2-хлорэтил-Ы-метил)амино] бензиламин (C1R), ранее неоднократно использовавшийся для аффинной модификации белков и нуклеиновых кислот [202,211,212].
Данные о модификации белков ядерных экстрактов клеток линий HeLa и А431 радиоактивномеченными аффинными реагентами представлены на рис.7А. Оказалось, что в ядерном экстракте клеток линий HeLa и А431 модифицируется преимущественно один белок. Поскольку модификация белка алкилирующими производными олигонуклеотидов изменяет его электрофоретическую подвижность, в качестве маркеров были использованы белки известной молекулярной массы (IgG, лизоцим и лактоферрин), модифицированные алкилирующим производным 16-звенного олигонуклеотида (раздел 2.2.7 "Материалы и методы"). Молекулярная масса белка, вычисленная, исходя из относительной подвижности (Rf) белка в SDS-диск-электрофорезе, составила 38 кДа (рис. 7Б).
Аффинная модификация (А) и определение молекулярной массы (Б) олигонуклеотид-связывающего белка ядерного экстракта клеток линии HeLa и А431. Ядерный экстракт инкубировали с I мкМ 32Р-меченными алкилирующими производными следующих олигонуклеотидов: рТ14 (1, 5), pN16 (2, 6), pN 16_2 (3, 7) и pN21 (4, 8) в течение 1 ч при 37С. Маркерные белки (IgG, лизоцим, лактоферрин) инкубировали с 32Р-меченным алкилирующим производным олигонуклеотида pN16, взятым в концентрации 1 мкМ, в течение 1 ч при 37С. Продукты модификации анализировали SDS-диск-электрофорезом в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией. реакционноспособные производные олигонуклеотидов рТ16 и pN16_2 (рис. 7а), что свидетельствует о том, что последовательность олигонуклеотида, а не его длина является важным фактором для такого взаимодействия. Введение алкилирующей группировки C1R в состав аффинных реагентов значительно упрощает проведении эксперимента, так как время полураспада реакционного производного составляет -40 мин [200,213], что является достаточным временем для образования специфичных ковалентных комплексов, стабильных в условиях денатурирующего электрофореза [200,214]. В то же время, наличие ароматического кольца в составе олигонуклеотидов может влиять на специфичность их взаимодействия с белками ядерного экстракта.
Для того чтобы исключить влияние модификации олигонуклеотида алкилирующим реагентом на связывание с белком, pN16 инкубировали с ядерным экстрактом клеток линии HeLa в течение 15 мин, с последующим облучением реакционной смеси коротковолновым ультрафиолетом в течение 1-Ю мин. Такое облучение приводит к фотоактивации оснований в составе олигонуклеотида, что ведет к образованию высокореактивных короткоживущих промежуточных соединений, способных образовывать ковалентные комплексы с белками [215]. Как видно из данных, представленных на рис. 8, при облучении ядерного экстракта клеток линии HeLa ультрафиолетом в присутствии pN16, последний формирует ковалентный комплекс
