Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации ДНК 9
1.2. Классификация и номенклатура ферментов СРМ 9
1.3. Системы рестрикции-модификации типа II:
их структурно-функциональная организация и биоразнообразие 11
1.4. Структурные особенности эндонуклеаз рестрикции типа II
в эволюционном аспекте 14
1.5. Механизмы взаимодействия эндонуклеаз типа II с ДНК 23
1.5.1. Процессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II 23
1.5.2. Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа II 26
1.6. Система рестрикции-модификации Eco29kI и ее основные характеристики 32
1.7. Анализ структурной организации эндонуклеазы Eco29kI 33
2. Методы исследований и материалы 35
2.1. Штаммы бактерий, бактериофаги и плазмидные вектора 35
2.2. Выделение и очистка ДНК 35
2.3. Клонирование гена эндонуклеазы Eco29kI-N6His 36
2.4. Сайт-специфический мутагенез in vitro 36
2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 39
2.6. Получение бактериальной массы 39
2.7. Экспрессия гена эндонуклеазы Eco29kI 39
2.8. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции Eco29kI-N6His и её мутантных форм до гомогенного состояния в нативных условиях 40
2.9. Определение ферментативной активности эндонуклеазы Eco29kI-N6His и её мутантных форм 41
2.10. Тестирование никазной (штриховой) активности мутантных форм эндонуклеазы рестрикции Eco29kI 41
2.11. Ограниченный протеолиз Eco29kI 42
2.12. Электрофорез 43
2.12.1. Электрофорез белков в ПААГ 43
2.12.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 43
2.13. КД - спектроскопия 43
2.14. Анализ специфического узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI 44
2.15. Поляризационный флуоресцентный анализ 45
2.16. Анализ комплексообразования эндонуклеазы Eco29kI 46
2.17. Стехиометрический анализ (Метод Ферпосона) 47
2.18. Реакция гидролиза плазмидной ДНК 48
2.19. Реакция гидролиза модифицированного субстрата 49
2.20. Быстрые реакции Eco29kI 50
3. Результаты исследования и их обсуждение 51
3.1. Особенности ДНК-белкового взаимодействия эндонуклеазы рестрикции Eco29kI 51
3.2. Стехиометрия комплекса Eco29kI с ДНК 56
3.3. Каталитический механизм: кинетика расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Eco29kI 57
3.4. Мутационный анализ каталитического центра эндонуклеазы рестрикции Eco29kI 63
Заключение 71
Выводы 74
Список литературы
- Классификация и номенклатура ферментов СРМ
- Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа
- Определение нуклеотидной последовательности ДНК
- Поляризационный флуоресцентный анализ
Введение к работе
Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена. К числу таких ферментов относятся эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов на ДНК и разрезать ее по определенным положениям.
Среди всех известных к настоящему времени эндонуклеаз рестрикции, наиболее популярными остаются эндонуклеазы рестрикции типа II. Благодаря высокой специфичности и относительно простой структуре, эндонуклеазы рестрикции типа II служат великолепными моделями для изучения ДНК-белковых взаимодействий и эволюционных взаимосвязей среди разных групп белков.
К настоящему моменту рентгеноструктурным анализом охарактеризовано 28 эндонуклеаз типа II. Вопреки отсутствию гомологии на уровне аминокислотных последовательностей, рентгеноструктурным анализом удалось выявить общий для эндонуклеаз рестрикции типа II структурный мотив PD...(D/E)XnK. Мотив PD...(D/E)XnK содержит аминокислотные остатки существенные для каталитической активности этих белков.
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных по функциональным особенностям белков выявил наличие мотива PD...(D/E)XnK в белках, относящихся к другим классам. Тот факт, что разные ДНК-связывающие белки имеют общий структурный мотив, дает основание предполагать существование общего, хотя и далекого предка.
Интересным оказался тот факт, что среди эндонуклеаз рестрикции типа II существуют ферменты, имеющие в своей структуре консервативные мотивы неродственных фосфодиэстераз других классов и тем самым отличающиеся от типичных систем типа II семейства "PD...(D/E)XnK". Первым ферментом типа II, в структуре которого был обнаружен каталитический мотив нуклеазы Nuc семейства "PLD", была эндонуклеаза Bfil типа IIS. Позднее с использованием современных методов сравнительного анализа аминокислотных последовательностей и структурного прогнозирования была обнаружена также гомология ряда ЭР типа II с "хоминг" - эндонуклеазами семейств "HNH" и "GIY-YIG". Так, в структуре ряда эндонуклеаз рестрикции типа II со слабо выраженным подобием (таких как, Sapl, Nspl, Kpnl, MboII) была отмечена консервативность повторяющихся Cys, которые характерны для большинства ферментов семейства "HNH".
А в последовательности эндонуклеазы Eco29kI выявлены каталитически значимые аминокислотные остатки мотива "GIY-YIG" и элементы вторичной структуры, идентифицированные экспериментально в "хоминг" - эндонуклеазе I-TevI из одноименного семейства. Наиболее консервативными аминокислотами в модуле "GIY-YIG" эндонуклеазы Eco29kI являются предположительно следующие аминокислотные остатки - тирозины в положениях 49 и 76, аргинины 86 и 104, глутаминовая кислота 142, аспарагин 154 и гистидин 108. Вполне логично предположить, что в обоих ферментах эти аминокислотные остатки выполняют одинаковые функции. По результатам рентгеноструктурного анализа N-концевого каталитического домена I-TevI была предложена модель пространственной организации каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI.
На основании этого представлялось интересным изучить структурные и биохимические характеристики Eco29kI в сравнительном аспекте с эндонуклеазами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами семейства "GIY-YIG".
Настоящая работа по теме диссертации посвящена изучению структурно-функциональных основ каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и сравнительному анализу свойств Eco29kI с эндонуклеазами типа II и классом "хоминг" — эндонуклеаз.
Для достижения поставленной в данной работе цели решались следующие задачи:
Охарактеризовать ДНК-связывающие свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI;
Изучить механизм гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI;
Получить мутации в гене eco29kIR по кодонам, кодирующим аминокислотные остатки, предположительно формирующие каталитический центр фермента;
Определить эффективность узнавания ДНК мутантными формами Eco29kI в сравнении с нативным ферментом;
Изучить каталитические свойства мутантных форм Eco29kI;
Провести сравнительный анализ свойств эндонуклеазы Eco29kI с ферментами типа II и "хоминг" - эндонуклеазами.
В настоящем исследовании впервые описаны ДНК-связывающие и каталитические свойства эндонуклеазы рестрикции Eco29kI типа П. На основании полученных данных впервые предложена модель механизма гидролиза ДНК эндонуклеазой Eco29kI. С учетом ранее установленной в лаборатории Буйницкого Я.М. гомологии аминокислотной последовательности Eco29kI с "хоминг" - эндонуклеазой I-TevI и выявленным в структуре Eco29kI мотива "GIY-YIG", было высказано предположение о роли
аминокислот, входящими в мотив "GIY-YIG", в формировании каталитического центра Eco29kI.
В работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза in vitro были получены конструкции для продукции мутантов Eco29kI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в катализе (Y49, R104, Н108, Е142 и N154). Было изучено связывание и гидролиз ими ДНК. Показано, что остатки Y49, HI08 и Е142 являются критическими для катализа. Обнаружено, что при нарушении каталитических свойств эндонуклеазы Eco29kI мутантные формы белка сохраняют способность специфически связывать ДНК. На основании полученных данных было предположено, что центры связывания и катализа имеют разную структурную основу. Сравнение значений констант диссоциации нативного фермента и его мутантных форм выявило значительное снижение эффективности связывания последних. Возможно частичное перекрывание центров связывания и катализа или влияние пространственно соседствующих аминокислот друг на друга.
Проведен сравнительный анализ Eco29kI с эндонуклеазами типа II и "хоминг" -эндонуклеазой I-Tevl.
Полученные в ходе исследования результаты доказывают наличие структурного подобия каталитических центров эндонуклеазы Eco29kI и "хоминг" — эндонуклеаз семейства "GIY-YIG". К настоящему моменту эндонуклеаза рестрикции Eco29kI является единственным представителем ферментов типа II, которого можно отнести к ceMeflcTBy"GIY-YIG".
Классификация и номенклатура ферментов СРМ
Подавляющее большинство описанных к настоящему времени систем рестрикции-модификации относятся к типу П. Это связано, главным образом, с преимущественным распространением их в природе в сравнении с системами других типов, а также обусловлено целенаправленностью поиска в связи с их практическим применением в генной инженерии и молекулярной медицине. Поэтому в данном обзоре акцент будет сделан на характеристике ферментов СРМ типа Л. Что касается ферментов СРМ других типов I, III и IV, их характерные особенности кратко представлены в таблице 1.
Особенностью СРМ типа II является то, что метилтрансферазная и эндонуклеазная активности обеспечиваются двумя разными белками, кодируемыми парой генов, и независимо друг от друга. Стоит отметить, что системы рестрикции-модификации могут кодироваться как хромосомальной, так и плазмидной ДНК.
Ортодоксальные представители эндонуклеаз рестрикции систем типа II являются гомодимерами с молекулярной массой от 20 до 40 кДа, которые узнают короткие палиндромные последовательности длиной 4-8 п.о. и в присутствии ионов металла гидролизуют ДНК внутри последовательности узнавания или в непосредственной близости от нее. Палиндромный характер сайта узнавания вытекает, вероятно, из того, что они функционируют как димеры, образующие U форму со щелью для ДНК. Вполне понятно, что симметричный белок, который состоит из двух идентичных субъединиц, узнает на молекуле ДНК симметричную последовательность нуклеотидов. Благодаря симметричной структуре фермент за один акт расщепляет обе цепи, не модифицированной ДНК. В результате гидролиза ДНК могут образовываться фрагменты с полностью спаренными (тупыми) концами, подобно действию эндонуклеазы EcoRV (Winkler F.K. et al, 1993) или же с выступающими одноцепочечными (липкими) 5 -концами (например, EcoRI (Kim Y. et al, 1990) или BamHI (Newman M. et al, 1995) и 3 -концами (эндонуклеаза Bgll (Newman M., 1998). Стоит отметить, что ортодоксальным эндонуклеазам рестрикции СРМ типа II для проявления активности не требуется АТФ или SAM, а необходимым кофактором реакции являются ионы двухвалентных металлов. В большинстве известных случаев, наибольшая активность эндонуклеаз наблюдается при добавлении в инкубационную смесь ионов Mg2+. Потребность в SAM в качестве кофактора реакции гидролиза проявляют лишь некоторые ферменты типа II, относящиеся к семействам ИВ и IIG (Sistla S. and Rao D.N., 2004).
Метилтрансферазы СРМ типа II представлены тремя типами: т4С, т5С и тбА. Большинство метилтрансфераз являются белками средних размеров с молекулярной массой 25 кДа - 58 кДа. Метилтрансферазы небольшого размера (до 32 кДа) активны обычно в форме димера и чаще являются адениновыми. т5С-МТ проявляют свою активность в форме мономера. Необходимым для метилтрансфераз кофактором реакции метилирования ДНК является SAM (Bujnicki J.M., 2001).
Выявленное разнообразие эндонуклеаз рестрикции типа II привело к делению их на несколько подтипов: ПА, ПВ, IIG, НЕ, IIF, ЦТ, IIS, IIP, ПС, ПН и ИМ. В основе такой классификации лежат характеристики сайтов узнавания, механизмов узнавания и разрыва фосфодиэфирной связи.
По узнаваемой последовательности эндонуклеазы рестрикции делят на две группы: ферменты, узнающие последовательности с элементами симметрии (тип IIP), и ферменты, узнающие асимметричные последовательности (типы ПА и IIS). При этом гидролиз ДНК может происходить как внутри последовательности узнавания (тип IIP), так и по обе стороны от него в обеих цепях ДНК-субстрата (тип ПВ) либо на некотором расстоянии от участка узнавания (тип IIS). Так, например, эндонуклеазы рестрикции типа IIS узнают ассиметричные последовательности и разрезают обе цепи ДНК за пределами сайта узнавания (такие ферменты как, StsI, Fokl). Большинство ферментов, относящихся к типу IIS, существуют в растворе в виде мономеров и гидролизуют ДНК, димеризуясь уже на субстрате, как Fokl (Bitinalte J. et al, 1998), MboII (Soundararajan M. et al, 2002), Sau3AI (Frednoff P. et al, 2001). Либо фермент, являясь мономером, имеет два активных центра на одной молекуле для взаимодействия с субстратом, например PI-SceI (Christ F. et al, 1999).
Эндонуклеазы рестрикции типа НА также узнают ассиметричные последовательности и гидролизуют ДНК либо внутри сайта узнавания, либо за его пределами. Эти системы кодируются одним REase геном и двумя MTase генами, продукты которых метилируют по одной цепи ДНК. К числу ферментов типа ПА относятся такие системы как, HphI, Sapl. Исключением является система BpulOI, в которой обнаружено два REase гена.
Ферменты типа ПВ характеризует способность узнавать как симметричные (ВрП), так и ассиметричные сайты на ДНК (например, Bcgl). Белки этого типа представляют собой бифункциональные полипептиды с эндонуклеазной и метилтрансферазной активностями. Ферменты типа ПВ расщепляют каждую цепь ДНК по специфическим положениям, удаленным от их сайтов, с обоих концов участка узнавания. Ферментам этого типа для проявления эндонуклеазной рестрицирующей активности требуется наличие SAM. Подобное свойство характерно и для эндонуклеаз рестрикции типа IIG (прежде известные, как ферменты типа IV). Эндонуклеазы типа ПТ состоят из двух разных субъединиц. Например, фермент Bpul является гетеродимером (оф) и узнает ассиметричную последовательность. А эндонуклеаза BslI функционирует как гетеротетрамер (СС2Р2) на палиндромной последовательности. Специфической особенностью эндонуклеаз рестрикции типа ИМ является узнавание и гидролиз метилированных субстратов (например, Dpnl), подобно эндонуклеазам типа IV (как, МсгВС).
Ортодоксальные димерные эндонуклеазы рестрикции (тип IIP) проявляют свою максимальную каталитическую активность, связывая одну копию последовательности узнавания. Однако, большинство ферментов типа II (НЕ, IIF и IIS) взаимодействуют с несколькими копиями их участков связывания. Так, Nael, представитель типа НЕ, гидролизует ДНК только при одновременном связывании двух копий последовательности узнавания (Kruger D.H. et al, 1995). А для действия эндонуклеазы EcoRII необходимо наличие трех копий сайта (Tamulaitis G. et al, 2006). Ферменты этого типа функционируют с ДНК как димеры. Эти эндонуклеазы гидролизуют только один сайт на ДНК, а дополнительные используют в качестве аллостерического эффектора. Эндонуклеазы рестрикции типа IIF характеризует способность последовательно гидролизовать оба участка узнавания, взаимодействуя с субстратом в виде тетрамеров (NgoMIV, CfrlOI) (Kirsanova O.V. et al, 2004; Mucke M. et al, 2003).
Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа
Одним из наиболее важных химических превращений в природе, катализируемых ферментами, является фосфорильный перенос. Эндонуклеазы рестрикции гидролизуют фосфодиэфиры, перенося фосфорильную группу с атома кислорода на активную молекулу
воды. Прямой перенос фосфорильной группы может осуществляться различными механизмами (ассоциативным или диссоциативным), зависящими от положения атакуемого нуклеофила относительно остаточной группы и угла образования связи различных точек вдоль координат реакции. Геометрия фосфорильного переноса представляет собой тригональную бипирамиду с тремя экваториальными и двумя осевыми атомами кислорода. Атомы кислорода, поступающие или оставляющие эту конфигурацию, должны быть всегда осевыми (Galburt Е.А. and Stoddard B.L., 2002).
Экспериментально было показано, что эндонуклеазы рестрикции осуществляют гидролиз по ассоциативному линейному механизму (in-line mechanisms). Для эффективного протекания каталитического расщепления фосфорных эфиров, требуется наличие определенных химических элементов: - основание - для образования активного нуклеофила; - Левис кислота - для стабилизации отрицательного заряда пентакоординированного фосфора во время переходного состояния (ионы металлов могут действовать как Левис кислоты, понижая рКа координированных молекул воды для легкой депротоинизации для обеспечения нуклеофильной атаки); - основная кислота - стабилизирует остаточную группу (З -О"); - ОН" ион, который атакует фосфор фосфодиэфирной связи. Понимание механизмов гидролиза эндонуклеазами рестрикции типа II основывается на изучении структуры активных сайтов.
Как было отмечено выше, в структуре большинства эндонуклеаз рестрикции типа II был обнаружен аминокислотный мотив PD...(D/E)XK, аминокислотные остатки которого формируют каталитический центр этих ферментов. В процессе конформационного преобразования фермента при взаимодействии с ДНК аминокислотные остатки этого мотива сближаются в пространстве вокруг фосфодиэфирной связи, которая подвергается атаке (Pingoud A. and Jeltsch А., 2001). Стоит отметить, что не у всех эндонуклеаз типа II мотив PD...(D/E)XK определяет активный центр фермента (например, у CfrlOI). А в структуре эндонуклеазы EcoRI таких мотивов два, один из которых не задействован в катализе этого фермента. Ранее было описано, что аминокислотный состав мотива PD...(D/E)XK может меняться в зависимости от фермента. Так, остаток пролина присутствует в мотиве у EcoRI и CfrlOI и не обнаруживается в структуре мотива у PvuII и ВатШ.
Как известно, для протекания процесса гидролиза эндонуклеазам рестрикции типа II в качестве кофактора необходимы ионы металлов, преимущественно ионы Mg . Количество ионов металла, вовлеченных в катализ, является определяющим критерием для классификации механизма разрезания ДНК у эндонуклеаз рестрикции типа II. По количеству связанных ионов металла эндонуклеазы условно подразделяют на две группы: "подобные EcoRI" (связывают один ион металла на субъединицу, например, Bglll, EcoRI) и "подобные EcoRV" (связывают два иона металла, такие как, BamHI, Bgll, PvuII, NgoMIV).
Сравнение кристаллических структур эндонуклеаз типа II с ДНК выявило наличие уникального сходства: все эпдонуклеазы рестрикции имеют сайт связывания I, который образуют абсолютно консервативные первый и второй аминокислотный остаток мотива PD...(D/E)XK и карбонил неполярной аминокислоты - PD...(D/E)XK. Ион металла занимает этот сайт связывания и координирует воду, которая прямо или опосредованно (через вторую молекулу воды) связывается с кислородом фосфата З -фосфодиэфирной связи. Эта молекула воды находится в положении in-line атаки на связь, которая в дальнейшем будет разрезана. Аминокислотный остаток лизина в мотиве PD...(D/E)XK, который в BamHI представлен глутаминовой кислотой -Е, а в Bglll глутамином -Q, участвует в образовании водородных связей с атакующей молекулой воды.
Второй сайт связывания с металлом у "EcoRV-подобных" эндонуклеаз формируется первым или в некоторых случаях вторым кислым аминокислотным остатком для поляризации Р-0 связи, что делает фосфат более чувствительным для нуклеофильной атаки. Это помогает также координировать молекулу воды, которая используется для протоинизации остаточной группы (З -О").
На рисунке 6 представлены схемы взаимодействия всех компонентов, участвующих в процессе гидролиза фосфодиэфирной связи, для "EcoRI-подобных " и "EcoRV-подобных" эндонуклеаз.
В процессе гидролиза фосфодиэфирных связей по каждой цепи специфической последовательности ДНК образуется продукт реакции, который в дальнейшем стимулирует диссоциацию комплекса фермент-продукт либо перемещение фермента на неспецифические сайты родственной молекулы ДНК. Образование продукта реакции идет через промежуточную стадию формирования промежуточного продукта. По количеству накопления промежуточного продукта можно говорить об особенностях гидролиза того или иного фермента.
Так, в стационарных условиях (E S) реакцию гидролиза у эндонуклеаз рестрикции можно описать как реакцию первого порядка, скорость которой строго пропорциональна концентрации одного реагирующего вещества. При этом время необходимое для того, чтобы реакция прошла наполовину не зависит от начальной концентрации субстрата. В результате реакции фермент отдает полностью расщепленный субстрат. Зависимость
Отличительной особенностью ферментативных реакций эндонуклеаз рестрикции является явление насыщения субстрата ферментом (E»S). При увеличении концентрации фермента скорость реакции у большинства типичных представителей эндонуклеаз типа II возрастает пропорционально. Исключениями являются эндонуклеазы, существующие в растворе в виде мономеров и имеющие один активный сайт на субъединицу (например, Fokl (Bitinaite J., 1998), MboII (Soundararajan M., 2002), Sau3AI (Frednoff P., 2001)). В процессе двухцепочечного разрыва ДНК такие ферменты димеризуются уже на субстрате. Изменение олигомерного статуса нарушает пропорциональность скоростей реакции от концентрации фермента. На рисунке 8 приведена процентная зависимость количества гидролизованного субстрата от концентрации эндонуклеазы Sau3AI. Скорость реакции при увеличении концентрации фермента будет меняться нелинейно, указывая на кооперативный механизм взаимодействия Sau3AI с субстратом.
Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Эндонуклеаза рестрикции Eco29kI-N6His и её мутантные варианты были выделены и очищены приблизительно с 90% степенью чистоты методом аффинной хроматографии на металл-хелатной колонке Ni-NTA фирмы "Qiagene" (США) в соответствие с прилагаемым протоколом.
Для выделения белков замороженные клетки E.coli Ml5 [pREP4, pEC029CmBglII, pQE-30-ECO29kI-N6His] оттаивали при комнатной температуре и суспендировали в 15 мл буфера А для разрушения (20мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.2), 300 мМ NaCl, 20мМ имидазола). Биомассу разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе "MSE" (Англия) в режиме: 6 циклов по 15 сек - импульс, 3 мин - охлаждение. Полноту разрушения контролировали по снижению мутности суспензии при 590 нм. Клеточные обломки и тельца включения осаждали центрифугированием в течение 1 ч при 15 000 об/мин на центрифуге "К-24" (Германия) при 4 С.
Осадок отбрасывали, а полученный супернатант наносили со скоростью 4 мл/ч на колонку с сорбентом Ni-NTA фирмы "Qiagene" (США), предварительно уравновешенную буфером А. Объём сорбента 2 мл. После промывания колонки 10 объёмами буфера А, связавшиеся белки элюировали ступенчатым градиентом концентрации имидазола (70мМ, 120мМ, 150 мМ, 170мМ) со скоростью 4мл/ч. Элюированные фракции проверяли на наличие эндонуклеазной активности Eco29kI, используя в качестве субстрата ДНК бактериофага (p80vir. Фракции, содержащие фермент Eco29kI, объединяли и диализовали против буфера, состоящего из 20мМ калий-фосфатного буфера, рН 7.2, 300 мМ NaCI, 7 мМ Р-меркаптэтанола, 0.01 мМ ЭДТА, 55% глицерина (по объёму), и хранили при -20 С.
Концентрацию белка определяли спектрофотометрическим методом при OD280, учитывая значение коэффициента экстинкции 38120 М"1 см 1. Концентрацию белка рассчитывали по формуле: ОД = %хСхХ где ОД - оптическая плотность, - коэффициент экстинкции ( = 38120 М"1 см"1), С концентрация белка, А - толщина кюветы (А=1 см). Гомогенность выделенного препарата проверяли электрофорезом в 15 % ПААГ (Рис. 12).
Эндонуклеазную активность фермента Eco29kI и его мутантных форм проверяли на линейной ДНК бактериофага (p80vir (Miller J.H., 1972). Гидролиз проводили в 10 мкл реакционной смеси (10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 10 мМ MgCb, 50 мМ NaCI), содержащей 1 мкг ДНК фага p80vir и 1 мкл препарата фермента из серии разведений, в течение 1 ч при 37С. Продукты расщепления субстратной ДНК тестировали электрофорезом в 0,8 % агарозном геле.
За одну условную единицу активности (у.е.) принималось количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага (p80vir в течение 1 ч при оптимальных условиях в 10 мкл инкубационной смеси.
Анализ штриховой активности мутантных белков проводили на меченных [у- Р] АТФ Электрофоретическое разделение в 15% денатурирующем ПААГ белков при очистке мутантных форм эндонуклеазы Eco29kI-N6His на Ni-NTA-колонке: 1 - культивирование в течение 4 ч штамма E.coli Ml 5 с мутацией в гене eco29kIR, приводящей к замене R104 на А104, без ИПТГ и 2 - в присутствии 2 мМ ИПТГ, 3 -бесклеточный экстракт, 4 - фракция белков, несвязавшихся с Ni-NTA, 5 - фракция, элюированная 70 мМ имидазола, 6 - эндонуклеаза R104A Eco29kI-N6His, очищенная до гомогенного состояния на колонке Ni-NTA. олигонуклеотидных праймерах с сайтом узнавания для Eco29kI (выделен жирным цветом): 5 TGGT ACCGC+GGCCGC AAGCTTTT-3 3 - AACCATGG+CGCCGGCGTTCGAAAA-5 Реакцию ставили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl (рН 7.5), 10 мМ MgCh, 50 мМ NaCl, 0.13 мкМ праймеров и 1 мкл мутантного белка из различных разведений. Гидролиз проводили в течение 1 ч при 37 С. Образцы наносили на 15 % ПААГ (20:1, акриламида/бисакриламида), содержащий 7 М мочевину. После электрофореза в 1 х трис-ацетатном буфере гели вымачивали в 10 % уксусной кислоте для вымывания мочевины в течение 45 мин. Затем гели высушивали и закладывали радиоавтограф.
Для изучения глобулярной структуры эндонуклеазы рестрикции Eco29kI пользовались методом ограниченного протеолиза. К гидролизуемому материалу 100 мкл Eco29kI в концентрации 0.2 мкг/мкл добавляли 1:100 трипсина (или 1:50 химотрипсина) исходной концентрации 1мг/мл. Смесь инкубировали при 37 С. Через первые пять, а затем через каждые 10 минут отбирали пробы по 20 мкл. Белок осаждали 6 % ТХУ при -70 С в течение 15 мин. Затем пробы наносили на 12% ПААГ.
Для приготовления растворов протеаз использовали буфер следующего состава: 20 мМ трис-HCl, рН 7.5-8.0, 150 мМ NaCl.
Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в вертикальных ПААГ блоках (0.75 х 135.0 х 110.0 мм) на приборе фирмы «Bio-Rad» (США). Образцы белков наносили на 12% ПААГ, состоящий из двух частей, концентрирующего и разделяющего гелей. Состав гелей указан в таблице 3.
Электрофорез проводили в течение 1.5 часа при постоянной силе тока 14-15 мА в трис-глициновом буфере (10х: 250 мМ трис-ОН, 1.90 М глицин, 1 % ДДС-Na), рН 8.3-8.5. О движении фронта судили по бромфеноловому синему.
В качестве стандартов использовали белки из набора фирмы "Pharmacia" (Швеция) с молекулярными массами: 66 кДа - БСА, 45 кДа - овальбумин, 36.0 кДа - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, 29 кДа - карбонангидраза, 24.0 кДа - трипсиноген, 20.1 кДа -ингибитор трипсина, 14.2 - сс-лактальбумин. Гели окрашивали 0.2 % кумасси бриллиантовой синей G-250 фирмы "Bio-Rad" (США).
Электрофорез ДНК проводили в 0,8 % агарозном геле в горизонтальном блоке на приборе в 1х ТВЕ при силе тока равной 100 мА, напряжении 90 В. Образцы вносили в лунки в объеме 10-15 мкл с сигнальным красителем, бромфеноловым синим. По окончании электрофореза гели окрашивали 10-20 мин в водном растворе бромида этидия (1-2 мкг/мл), отмывали и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Для определения влияния мутаций на пространственную структуру эндонуклеазы Eco29kI были выполнены спектроскопические измерения на приборе Jasco-600 спектрополяриметре (Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) с использованием 1.0 мм кювет. Измерения проводились после процедуры денатурации-ренатурации белка, чтобы снизить эффект агрегации. Мутантные варианты эндонуклеазы Eco29kI растворяли в буфере с 8 М мочевиной (ЮОмМ №НгР04, 10 мМ Трис-HCl, рН 4.5).
Поляризационный флуоресцентный анализ
Методом сайт-направленного мутагенеза in vitro были получены мутации в гене eco29kIR по кодонам, кодирующим аминокислотные остатки, предположительно формирующие каталитический центр фермента. Так, аминокислоты Y49 и Е142 были заменены на аланин, R104 и Н108 на остаток фенилаланина, а N154 был заменен на лейцин. Выбор "нейтральной" для катализа аминокислоты определялся сохранением способности белковой молекулы к правильной сборке и организации в пространстве. Полноразмерный белок с заменой по Y76 аминокислоте не был получен, в связи с делсциями в заменяемых триплетах. Вероятно, тирозин в 76 положении отвечает за специфичность белка Eco29kI и стабилизацию его структуры, чем за катализ. Мутантные формы Eco29kI по 108 и 154 аминокислотам с заменами на аланин также не были получены, вероятно, в связи с нестабильностью белковой молекулы в клетке.
Первичную последовательность рекомбинатных плазмид определяли по методу Сэнгера с использованием [а-Р ] дАТФ и последующим разделением продуктов реакции в 7% ПААГ в денатурирующих условиях. Как показал анализ, во всех плазмидах были получены необходимые мутации по гену есо29кШ (данные не приводятся).
Мутантные варианты эндонуклеазы Eco29kI были выделены методом аффинной хроматографии с 90% степенью чистоты препарата (см. Материалы и Методы). Выход мутантных белов с никелевого сорбента соответствовал точке выхода нативного белка -120 мМ имидазола. Концентрацию белков определяли спектрофотометрическим методом. Оказалось, что в очищенных препаратах нативного фермента Eco29kI и его мутантных вариантов содержится 2 мг/мл белка. Стоит отметить, что основная масса белка, приблизительно 90%, агрегировала либо в тельца включения при культивировании клеток, либо в виде хлопьев нерастворимого осадка в процессе выделения и очистки.
Возможное влияние замен каталитических аминокислот на укладку белковой молекулы в пространстве изучали методом КД-спектроскопии (Рис. 25). Поскольку агрегация препятствует выделению необходимого для анализа количества белка, спектральный анализ проводили в условиях денатурации-ренатурации мутантных вариантов Eco29kI. Процесс рефолдинга белков изучали в выбранном диапазоне времени.
На рисунке 25 приведены КД-спектры эндонуклеазы рестрикции Eco29kI и ее мутантных форм по 49, 104 и 154 аминокислотам. Сравнение спектров кругового дихроизма нативного фермента Eco29kI и его мутантных вариантов позволяет делать вывод о том, что мутации не вносят изменений в пространственную укладку белковой молекулы Eco29kI.
Анализ эндонуклеазной активности мутантных вариантов Eco29kI
Тестирование каталитической активности мутантных форм Eco29kI эндонуклеазы Eco29kI проводили на ДНК бактериофага (p80vir (Рис. 26).
Как видно из электрофореграммы (Рис. 26А), ферментативная активность полностью отсутствует у мутантных форм с заменами Y49A, H108F и Е142А и частично сохраняется у мутантов по R104 и N154 аминокислотам, 2% и 10% от активности нативного фермента, соответственно. Вероятно, потеря энзиматической активности этих мутантных форм связана с введёнными заменами, что дает основание предполагать, что аминокислотные остатки Y49, R104, HI 08, El 42, N154 аминокислотные остатки принимают непосредственное участие в ферментативном катализе, осуществляемом Eco29kI.
Замена R86 аминокислоты на аланин не оказывает влияния на активность мутантного белка. Вероятно, в первичном прогнозировании структуры каталитического центра Eco29kI была допущена не точность в определении участия данной аминокислоты в катализе. В ходе дальнейшей работы мутантную форму Eco29kI по R86 аминокислоте использовали в качестве контроля.
Проверка пикирующей активности мутантных форм Eco29kl
Замена инвариантных аминокислот в структуре каталитического центра фермента может привести к появлению у него никазной активности, т.е. способности осуществлять однонитевые разрывы на ДНК в участке узнавания. Так было показано, что замена L43K. в молекуле эндонуклеазы Nael превращает этот фермент в топоизомеразу (Jo К., Topal M.D., 1995). Наличие у мутантных форм Eco29kI никазной активности проверяли гидролизом синтетических олигонуклеотидов с сайтом узнавания для Eco29kI. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза субстрата по каждой цепи ДНК представлено на рисунке 26Б и 26В. Из электрофореграмм становиться очевидным, что мутантные формы эндонуклеазы Eco29kI не обладают никазной активностью. Этот факт является ещё одним доказательством участия выявленных аминокислотных остатков в формировании каталитического центра исследуемой эндонуклеазы.
Выявление стерического взаиморасположения каталитически активных аминокислот в субъединичном комплексе эндонуклеазы Eco29kI
Известно, что большинство эндонуклеаз типа II функционируют как гомодимеры. Каталитические аминокислоты в таких гомодимерах могут быть расположены относительно друг друга в положении "/« trans". Это означает, что для первого разрыва ДНК, например, из четырёх важных для катализа аминокислот три поставляются одной молекулой белка, а последняя каталитическая аминокислота поставляется второй молекулой. В свою очередь, три оставшихся аминокислоты из второй молекулы и одна из первой принимают участие во втором разрыве ДНК.
Взаимное расположение в двух мономерах каталитически активных аминокислот эндонуклеазы Eco29kI определяли методами генетической, а затем белковой комплементации в системах in vivo и in vitro, соответственно. В случае генетической комплементации, в одной клетке совмещались плазмиды с разными мутациями в гене эндонуклеазы, в случае белковой, смешивали в реакционной смеси уже очищенные мутантные по разным аминокислотам белки. Важно было установить, произойдет ли восстановление эндонуклеазной активности при какой-либо комбинации мутаций. Результаты такого эксперимента (данные не приводятся) показали, что комбинирование мутаций эндонуклеазную активность не восстанавливает. Следовательно, изучаемые аминокислоты - Y49, R104, Н108, Е142, N154 расположены в активном центре "in cis" друг относительно друга.
