Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Организация генома растений 9
1.1.1. Размер генома. Парадокс размера генома (C-value paradox) 9
1.1.2. Уникальные и малокопийные последовательности 12
1.1.3. Повторяющиеся последовательности 14
1.1.3.1. Повторяющиеся последовательности, организованные в тандемы..16
1.1.3.1а. Макросателлиты, или сателлиты 17
1.1.3.16. Минисателлиты 20
1.1.3.1 в. Микросателлиты 21
1.1.4. Происхождение и эволюция тандемно организованных повторов 23
1.1.5. Функциональная роль повторяющихся последовательностей в геноме..27
1.1.6. Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности 31
1.1.6.1. Ретротранспозоны 32
1.1.6.1 а. LTR-содержащие ретротранспозоны. 32
1.1.6.1 б. LTR-несодержащие ретротранспозоны 34
1.1.6.2. ДНК-транспозоны 39
1.1.7. Роль мобильных элементов 40
1.2. Векторные системы, используемые для клонирования ДНК 42
1.2.1. Плазмидные векторы 43
1.2.2. Векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК 44
1.2.2.1. Векторы на основе хромосомы фага Л 44
1.2.2.2. Космидные векторы 45
1.2.3. Искусственные хромосомы - сверхъемкие векторы 46
1.2.3.1. Искусственные хромосомы дрожжей YAC 46
1.2.3.2. Искусственные хромосомы бактерий ВАС 48
1.2.3.3. Семейство векторов РАС 50
1.2.3.4. Искусственные хромосомы животных и человека-MAC и НАС 51
1.3. Пшеницы и Aegilops как модельные системы для изучения организации и эволюции генома растений 52
1.4. Заключение 59
ГЛАВА 2. Материалы и методы 61
2.1. Растительный материал 61
2.2. Клоны ДНК 64
2.3. Методы исследования 65
2.3.1. Приготовление хромосомных препаратов 65
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК 65
2.3.3. Выделение ДНК из ВАС-клонов 66
2.3.4. Мечение проб 67
2.3.5. Гибридизация in situ (FISH) 68
2.3.6. Детекция сигналов гибридизации 68
2.3.7. Анализ хромосомных препаратов 70
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Исследование эволюции геномов пшеницы с помощью Spelt-1 и Spelt-52
повторов 71
3.1.1. Особенности распределения Spelt-1 и Spelt-52 повторов на хромосомах Aegilops speltoides 71
3.1.2. Исследование распределения Spelt-1 и Spelt-52 повторов на хромосомах полиплоидных пшениц группы Timopheevi 72
3.1.2.1. Анализ Т. araraticum с помощью С-окрашивания 72
3.1.2.2. Локализация Spelt-1 повтора на хромосомах видов группы Timopheevi 74
3.1.2.3. Локализация Spelt-52 повтора на хромосомах Triticum araraticum Т. timopheevii и Т. kiharae 78
3.1.3. Локализация Spelt-1 повтора на хромосомах полиплоидных пшениц группы Emmer 79
3.1.3.1. Тетраплоидные виды 79
3.1.3.2. Локализация Spelt-1 повтора на хромосомах гексаплоидных пшениц 83
3.1.4. Изменение Spelt-1 в процессе эволюции полиплоидных пшениц 83
3.2. Локализация Fat повтора на хромосомах злаков 86
3.2.1. Характеристика Fat повтора 86
3.2.2. Локализация последовательности Fat на хромосомах пшеницы 87
3.2.3. Гибридизация Fat элемента на хромосомах злаков - доноров геномов мягкой пшеницы 91
3.2.4. Локализация последовательности Fat на хромосомах Aegilops 94
3.2.4.1. Диплоидные виды 94
3.2.4.2. Полиплоидные виды кластера D-геномов 95
3.2.4.3. Полиплоидные виды Aegilops кластера U-геномов 103
3.2.5. Локализация Fat последовательности на хромосомах других злаков... 105
3.2.6. Fat последовательность в эволюции злаков 107
Выводы 112
Список литературы
- Уникальные и малокопийные последовательности
- Пшеницы и Aegilops как модельные системы для изучения организации и эволюции генома растений
- Выделение плазмидной ДНК
- Исследование распределения Spelt-1 и Spelt-52 повторов на хромосомах полиплоидных пшениц группы Timopheevi
Введение к работе
Повторяющиеся последовательности ДНК являются основным компонентом генома растений. По разным данным, у злаков к ним может относиться до 90-95% ядерной ДНК (Flavell et al., 1974; Li et al., 2004; Paux et al., 2006). Повторяющиеся последовательности представляют собой высоко гетерогенную группу, представленную тысячами или даже десятками тысяч семейств, отличающихся по длине мотива, уровню копийности и организации в геноме (Flavell et al., 1974; Флейвел, 1986; Kubis et al., 1998; Heslop-Harrison, 2000). Секвенирование геномов модельных видов - риса и арабидопсиса (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Initiative, 2000; Sequencing Project International Rice, 2005), а также детальные исследования других важных сельскохозяйственных культур, включая пшеницу и ее сородичей, ячмень, сахарную свеклу и другие виды, показали, что наиболее обширным классом повторяющихся последовательностей растений являются LTR-ретротранспозоны, составляющие свыше 50% размера их геномов (Bennetzen, 2000b; Li et al., 2004; Sharma and Raina, 2005; Paux ef al., 2006). От 5 до 11% ДНК пшеницы представлено транспозонами, а на долю остальных классов повторяющихся последовательностей приходится порядка 30% ядерной ДНК.
Причины поддержания столь значительного количества повторяющихся последовательностей, а также высокого разнообразия их состава до конца не изучены. Предполагают, что они играют важную роль в стабилизации и поддержании структуры хромосом, участвуют в «узнавании» и правильном расхождении хромосом во время митоза и мейоза (Vershinin ef al., 1995; Kubis et al., 1998). Локусы некоторых семейств сателлитных ДНК выступают как точки рекомбинации хромосом в мейозе (Linares et al., 1998; Vershinin et al., 1995). Теломеро-ассоциированные повторы выполняют функцию защиты теломер и участвуют в регуляции генов, локализованных в субтеломерных районах (Sykorova et al., 2003). Показано, что видообразование у растений часто связано с быстрыми изменениями фракции повторяющихся последовательностей ДНК (Flavell etal., 1979; Cuadrado and Jouve, 2002; Dvorak, 1998).
He удивительно, что повторяющиеся ДНК привлекают все большее внимание исследователей. За последние годы было выделено и охарактеризовано множество новых семейств повторов растений, а для анализа сателлитных последовательностей была создана специализированная компьютерная база данных () (Macas ef al., 2002). Значительных успехов в выявлении новых вариантов повторов злаков удалось
достигнуть с появлением новых векторов для клонирования ДНК - искусственных бактериальных хромосом (Jiang et al., 1995; Li et al., 2004; Zhang et al., 2000; Stein, 2007; Charles et al., 2008). Тем не менее, число идентифицированных семейств повторов все еще крайне мало, а в практической цитогенетике, как маркеры для флуоресцентной гибридизации in situ, применяется еще меньшее их количество. Поэтому важной задачей является поиск новых генетических маркеров, которые могли бы использоваться в изучении процессов, сопровождающих дивергенцию и становление видов.
У трибы Triticeae наиболее полно исследована повторяющаяся ДНК ржи (Bedbrook et al., 1980; Jones and Flavell, 1982a, b; Vershinin et al., 1995; Contento et al., 2005) и Ae. tauschii - донора D-генома мягкой пшеницы (Rayburn and Gill, 1986; Nagaki et al., 1995, 1998, 1999; Badaeva et al., 1996, 2002; Taketa et al., 2000). Сравнительно недавно при секвенировании концевых последовательностей ВАС клонов библиотеки хромосомы ЗВ мягкой пшеницы была идентифицирована новая, ранее не известная, тандемно организованная последовательность длиной 500 п.н., представленная в хромосоме ЗВ свыше 1200 копий (Paux et al., 2006). Новый повтор содержал множество сайтов рестрикции эндонуклеазы Fat-1 и был назван Fat. В то же время, не существовало данных о наличии и уровне копийности Fat элемента в геномах других видов Triticeae. Оставалось неизвестным и то, как он распределен на хромосомах.
Семейства сателлитных ДНК - Spelt-1 и Spelt-52 были выделены в
Институте цитологии и генетики СО РАН из генома Ae. speltoides (Салина et al.,
1997; Pestsova et al., 1998; Salina et al., 1998, 2004a). Авторы показали, что они
относятся к высокоповторяющимся, тандемно организованным
последовательностям, локализованным в субтеломерных районах хромосом (Anamthawat-Jonsson and Heslop-Harrison, 1993; Salina et al., 1998, 2004a). Spelt-1 был обнаружен только у одного вида Aegilops - Ae. speltoides, а также полиплоидных видах пшеницы, тогда как Spelt-52 присутствовал в геномах трех видов Aegilops секции Sitopsis - Ae. speltoides, Ae. longissima и Ae. sharonensis. Уровень копийности обоих повторов внутри видов значительно варьировал (Salina et al., 2004а). Помимо этого, было показано, что образование полиплоидных пшениц сопровождалось снижением уровня копийности Spelt-1 повтора в сравнении с Ae. speltoides (Pestsova et al., 1998; Salina et al., 2004b). Тем не менее, хромосомные механизмы, лежащие в основе этого процесса, оставались до конца не выясненными.
Целью настоящей работы стало изучение структуры и эволюции геномов злаков на основе локализации трех семейств тандемно организованных, высокоповторяющихся, некодирующих последовательностей ДНК методом флуоресцентной гибридизации in situ. Для ее выполнения были поставлены следующие задачи:
Оценить популяционный полиморфизм сателлитных повторов Spelt-1 и Spelt-52. Изучить преобразования этих повторов в линиях пшеницы эммер и Timopheevi.
Исследовать распределение нового, ранее не известного семейства повторяющихся последовательностей Fat на хромосомах злаков методом FISH. Определить возможное время его возникновения в процессе эволюции.
Оценить эффективность использования Fat повтора как маркера для идентификации хромосом в гибридизации in situ и изучении эволюции растений.
Уникальные и малокопийные последовательности
В настоящее время наиболее детально изучены тандемно организованные ПП. Они выявлены в геномах всех изученных на сегодняшний день эукариот. Тандемная организация повторяющихся последовательностей проявляется при электрофоретическом разделении геномной ДНК, обработанной различными эндонуклеазами рестрикции. В результате такой обработки появляется характерная «лесенка» фрагментов длиной, кратной длине мономера (Kubis et al., 1998). Тандемная организация характерна как для некодирующих, так и для некоторых кодирующих последовательностей, например рибосомальных цистронов. Сейчас термин «сателлитная ДНК» используется для обозначения любых некодирующих тандемно повторяющихся последовательностей, даже если их невозможно отделить от остальной геномной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия (Zhao and Ganal, 1996).
В зависимости от длины мономера тандемные повторяющиеся последовательности делят на три группы (Jarman and Wells, 1989; Zhao and Ganal, 1996; Heslop-Harrison, 2000): макросателлиты, или сателлиты (эта группа включает в себя семейства сателлитных повторов с длиной свыше 100 п.н., образующих большие блоки); минисателлиты (длина мономера от 10 до 60 п.н.); микросателлиты длиной от 2 до 6 п.н. К группе тандемных повторов относят также некоторые семейства генов, такие как рибосомальные гены, а также теломерные повторы.
Данная группа повторяющихся последовательностей хорошо изучена у растений, в особенности злаков, и в настоящее время широко используется в качестве маркеров для изучения их геномов и идентификации хромосом.
Длина мономера макросателлитов (сателлитная ДНК) превышает 100 п.н. Эти последовательности характеризуются высоким уровнем копийности (105 -106) и образуют кластеры, содержащие до 100 миллионов п.н. (Доувер и др., 1986; Шумный и Вершинин, 1989). Сателлитные ДНК могут составлять до 10-20% генома, и нередко именно они обуславливают значительные различия в содержании ДНК у близкородственных видов.
В геноме растений чаще всего встречаются сателлиты с длиной мономера около 170 и 350 п.н., что соответствует однократной или двукратной длине укладки ДНК вокруг нуклеосомы (Trifonov, 1985; Vershinin and Heslop-Harrison, 1998). Методом гибридизации in situ показано, что локализация многих макросателлитов на хромосомах коррелирует с гетерохроматиновыми блоками (Hutchinson and Lonsdale, 1982; Jones and Flavell, 1982). Нередко сателлитные ДНК имеют сложную иерархическую структуру. Так, например, только одно из 4-х типов сателлитной ДНК ржи с длиной повторяющейся единицы 120 п.н. представляло собой простой тандемный повтор, тогда как у всех видоспецифических семейств выявлена комплексная структура. Например, повторяющаяся единица семейства 480 п.н. состоит из двух тандемных повторов длиной 140 п.н. и неродственной 230 п.н. последовательности, а элементарная единица 610 п.н. семейства включает простой тандемный повтор 110 п.н. и неродственную 280 п.н. последовательность (Шумный и Вершинин, 1989). Семейство 630 п.н. имеет еще более сложное строение. Оно состоит из 3-х форм: (1) простого тандемного повтора длиной 120 п.н., и (2 и 3) последовательности длиной 116 и -300 п.н., перемежающейся с вышеназванной последовательностью 120 п.н.
По распределению на хромосомах повторяющиеся последовательности делят на центромерные, субтеломерные и интеркалярные. Показано, что центромерный гетерохроматин насыщен сателлитными постедовательностями ДНК и ретротранспозоннами в различных количественных соотношениях (Heslop-Harrison et al., 2003; Jiang et al., 2003).
К настоящему моменту охарактеризовано около 17 различных семейств макросателлитов с повторяющейся единицей от 137 до 755 п.н. и локализованных в центромерных районах хромосом однодольных и двудольных растений (Sharma and Raina, 2005). Так у Arabidopsis thaliana описано центромерное семейство тандемных повторов с длиной мономера 180 п.н., составляющее от 2 до 5% его генома. Это семейство чередуется с /4№/7а-ретротранспозонами, которые, помимо центромерных районов, обнаруживаются и в прицентромерных областях (Heslop-Harrison et al., 1999; Nagaki et al., 2003a). Подобным образом организована центромерная ДНК и у других видов растений, таких как рис, кукуруза, пшеница, свекла (Gindullis et al., 2001; Kishii et al., 2001; Kumekawa et al., 2001; Sounders and Houben, 2001; Cheng et al., 2002; Nagaki et al., 2003b).
Среди макросателлитов, локализованных в интеркалярных и дистальных районах хромосом злаков, более детально изучены семейства повторов ржи (Bedbrook et al., 1980; Jones and Flavell, 1982; Vershinin et al., 1995), ячменя (Belostotsky and Ananiev, 1990; Vershinin et al., 1990; Kilian and Kleinhofs, 1992; Roeder et al., 1995b), D-генома мягкой пшеницы и ее донора Aegilops tauschii (Rayburn and Gill, 1986; Vershinin et al., 1994), овса (Fominaya et al., 1995; Ananiev et al., 2002) и риса (Zhao et al., 1989; Ohtsubo et al., 1991; Nakajima et al., 1996). У ржи большая часть семейств высоких повторов локализована в субтеломерных районах хромосом (Flavell et al., 1979; Bedbrook et al., 1980b; Bedbrook et al., 1980c), а для ячменя характерна преимущественно интеркалярная локализация основных семейств тандемных повторов, что, по-видимому, объясняется особенностями эволюции видов этих родов (Салина и др., 1989; Svitashev et al., 1994).
Пшеницы и Aegilops как модельные системы для изучения организации и эволюции генома растений
Пшеницы (Triticum L.) и эгилопсы (Aegilops L.) являются одними из наиболее молодых родов в семействе злаковых (Poaceae Barnhart) (Kellogg, 2001). Предполагают, что их дивергенция от общего предка произошла приблизительно 3 миллиона лет назад - значительно позже, чем представителей родственных родов Secale (7 млн. лет) и Hordeum (10-14 млн лет) (Huang et al., 2002; Gill et al., 2004) (рис. 11). Дальнейшая эволюция этих родов происходила за счет хромосомных перестроек, накопления или элиминации отдельных семейств повторяющихся последовательностей и полиплоидизации (Kihara, 1954, 1963; Zohary, 1966; Gill, 1981; Baum and Appels, 1992; Badaeva et al., 1996a, b; 2002, 2004; Dvorak, 1998; Liu B. et al., 1998; Liu X. et al., 1998; Belyayev et al., 2001; Ozkan et al., 2001, 2003; Bandopadhyay et al., 2004).
Современные пшеницы и эгилопсы представляют собой естественные полиплоидные ряды, включающие ди- (2п=2х=14), тетра- (2п=4х=28) и гексаплоидные виды (2п=6х=42). Скрещивания пшениц различных уровней плоидности показали, что они содержат общий геном - А, у тетраплоидных и гексаплоидных видов присутствует второй общий геном В, тогда как D геном уникален для гексаплоидных видов (Kihara, 1919; Sax and Sax, 1924). Ди-, тетра- и гексаплоидные виды Triticum, содержащие А/ АВ/ ABD геномы, представляют первую и основную эволюционную линию пшеницы (группа Emmer), к которой относятся, в частности, наиболее важные в хозяйственном отношении мягкая и твердая пшеницы.
В 1922 году известным российским ботаником П.М. Жуковским в Грузии был обнаружен новый вид тетраплоидной пшеницы, названный Т. timopheevii, отличающийся от уже известных форм по морфологическим признакам растений и практически полной устойчивостью к ржавчине и мучнистой росе (Жуковский, 19286). Анализ мейотической конъюгации хромосом в ее гибридах с другими видами пшеницы выявил большое количество нарушений, обусловленных структурной дифференциацией хромосом (Wagenaar, 1961; Chen and Gill, 1984; Maestra and Naranjo, 1999). Впоследствии эти данные были подкреплены результатами изучения рисунков дифференциального окрашивания хромосом (Badaeva et al., 1986), GISH (Jiang and Gill, 1994a), картирования локусов pPHK генов (Jiang and Gill, 1994b). В связи со значительной генетической обособленностью Т. timopheevii для нее был предложен новый геномный символ -AG или более точно AlG (Lilienfeld and Kihara, 1934). Т. timopheevii, его дикорастущий предок Т. araraticum и гексаплоидная пшеница Т. zhukovskyi представляют вторую эволюционную линию пшеницы - Timopheevi.
На основании результатов биохимических (Конарев и др., 1974 Nishikawa, 1984; Kerby, 1976; Kerby et al., 1988; Ciaffi et al., 1997), цитогенетических (Chapman et al., 1976, Dvorak, 1976; Kerby and Kuspira, 1987) и молекулярных (Dvorak et al., 1988, 1989, 1993; Tsunewaki et al., 1996; Takumi et al., 1993) исследований было показано, что все полиплоидные пшеницы унаследовали А- геном от дикой однозернянки Triticum urartu или близкой ей формы. Донором В и G геномов тетраплоидных пшениц послужил дикорастущий вид Aegilops speltoides (Kerby et al., 1990; Feldman, 2001; Бадаева, 2001; Kilian et al., 2007). Несмотря на то, что предками пшениц группы Emmer и Timopheevi послужили одни и те же родительские виды, их геномы значительно отличаются. Это обусловлено тем, что эммеры и пшеницы Timopheevi появились в результате двух независимых событий гибридизации (Feldman, 2001), причем по данным «молекулярных часов» предшественник современных эммеров образовался существенно раньше (300-500 тысяч лет назад), чем предок пшеницы Тимофеева (70-80 тысяч лет назад) (Huang et al., 2002). Гексаплоидная пшеница появилась примерно 7-10 тысяч лет назад в результате гибридизации тетраплоидной культурной пшеницы Т. dicoccum с дикорастущим видом Ае. tauschii (Feldman, 2001).
Современная систематика рода Triticum L во многом опирается на результаты этих работ. Следует отметить, что до сих пор еще не существует общепризнанной классификации пшениц, так как число видов, выделяемых в пределах этого рода, у разных авторов значительно различается. Большинство зарубежных ученых (Bowden, 1959; Kimber and Feldman, 1977; Mac Key, 1954, 1966) включили в состав рода Triticum все виды эгилопсов, а существующее многообразие пшениц свели к 3-5 видам: Т. топососсит, Т. turgidum, Т. timopheevii, Т. zhukovskyi и Т. aestivum.
Отечественная школа систематики пшениц основана на работах F. Kornicke (1885) и J. Persival (1921), переработанных и дополненных К.А. Фляксбергером (1935) и Н.И.Вавиловым (1935). Род Triticum L. разделен на 2 подрода (Triticum и Boeoticum, соответствуют описанным выше эволюционным линиям пшеницы Emmer и Timopheevi) и шесть секций (по три у каждого подрода) (таб. 7). Виды разделены на группы по числу хромосом. В пределах каждой группы выделяют от двух до семи видов (Дорофеев и др., 1979).
Выделение плазмидной ДНК
Процедура выделения ВАС, содержащих рекомбинантную ДНК, сходна с таковой при выделении плазмидной ДНК и основана на методе щелочного лизиса (Maniatis et а/., 1982). Однако, существует несколько особенностей, связанных с принципом устройства и характером размножения ВАС-клонов. Во-первых: для достижения растущими клетками нужной концентрации необходимо больше времени (не менее 20 часов), чем для наращивания клеток, содержащих плазмиды. Во-вторых: в отличие от плазмид, ВАС являются однокопийными и для получения достаточного количества ДНК выделение необходимо проводить из культуры объемом несколько сотен миллилитров. И, в-третьих: длина рекомбинантной ДНК в ВАС-клонах намного больше, чем у плазмидных. Поэтому при выделении необходимо все манипуляции проводить более нежно и аккуратно, чтобы предотвратить фрагментацию выделяемой ДНК.
В 10 мл жидкой стерильной LB среды добавляли хлорамфеникол до конечной концентрации 18,75 мг/мл, инокулировали единичную колонию и инкубировали при 37С на качалке (скорость приблизительно 200 об/мин) четыре или более часа.
Десять миллилитров активно растущей культуры переливали в колбу, содержащую 100 мл стерильной, предварительно подогретой до 37С LB среды, содержащей хлорамфеникол с такой же концентрацией, и оставляли на качалке при 37С на 20 и более часов. Ночную культуру переносили в 50-мл пробирки и центрифугировали 30 мин при 4500 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 5 мл раствора I (25 мМ трис- HCI, рН 8,0; 50 мМ глюкоза; 20 мМ ЭДТА) и оставили на льду на 5 минут.
В каждую пробирку добавляют по 10 мл свежеприготовленного раствора II (0,2Н NaOH; 1% SDS), смешивали, осторожно переворачивая пробирку несколько раз, и оставляли на льду на 10 и более минут.
К каждому образцу добавляли по 7,5 мл холодного раствора III (ЗМ ацетат Na, рН 4,8-5,0), быстро перемешивали и оставляли на льду на 10 или более минут.
Осадок отделяли 40-минутным центрифугированием при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в чистую 50-мл центрифужную пробирку, добавляли 20 мл холодного изопропанола, перемешивали и оставляли в холодильнике или морозильной камере на 30 и более минут (лучше на ночь). ДНК осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 40 минут при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ДНК промывали 70% этанолом и высушивали на воздухе.
ДНК растворяли в 400 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис- HCI, рН 8,0; 1мМ ЭДТА), добавили 5 мкл РНК-азы А (10 мг/мл) и оставляли в холодильнике на ночь. К образцу добавили 400 мкл смеси фенола с хлороформом (сначала 200 мкл хлороформа, потом 200 мкл фенола), перемешивали и центрифугировали при 6000 об/мин 15 минут. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, добавляли равный объем хлороформа, смешивали и центрифугировали 2 мин. Очистку хлороформом проводили до исчезновения промежуточной фазы.
ДНК осаждали добавлением 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и двух объемов 95 этанола при -20С, оставляли в морозилке на 1 час и центрифугировали 40 минут при 6000 об/мин. Осадок промывали 70 этанолом и подсушивали на воздухе. ДНК растворяли в 100 мкл ТЕ буфера и определяли концентрацию на 0,8% агарозном геле.
Мечение проб, проводили с помощью ник-трансляции с использованием наборов для мечения ДНК: DIG - Nick Translation Mix (Roche Biochemicals, Sussex, UK) для мечения дигоксигенином и Biotin-Nick Translation Mix (Roche Biochemicals, Sussex, UK) для мечения биотином. Процедуру проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
Для мечения готовили смесь, содержащую 1 мкг ДНК, 4 мкл смеси для мечения и воду до конечного объема 20 мкл. Реакцию мечения проводили в течение 90 минут при 15С. Затем добавляли 1 мкл 0,5М ЭДТА и прогревали в течение 10 минут при температуре 65С.
Fat элемент метили флуоресцеином с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров (Paux et а/., 2006). Зонд любезно предоставлен сотрудниками Национального центра генетических ресурсов (INRA) г. Клермон-Ферран, Франция. Послеждовательности Spelt-1 и Spelt-52 метили биотином или флуоресцеином с помощью ПЦР, меченые зонды были любезно предоставлены д.б.н. Е.А. Салиной (Институт цитологии и генетики СО РАН).
Двухцветную FISH проводили по стандартной методике (Badaeva et al., 1996) с небольшими модификациями.
Гибридизационная смесь содержала 50% формамида, 10% 20х SSC, 10% фрагментированной ДНК спермы лосося, 20% декстрансульфата и по 5% (по 1 мкг) проб, меченных биотином и дигоксигенином (или флуоресцеином). Смесь денатурировали при 85С в течение 5 минут с последующим быстрым помещением в лед.
Денатурацию хромосомных препаратов проводили на термоплате под покровным стеклом в течение 3 мин при 74С в денатурирующем растворе (ЮОмкл на 1 стекло), состоящем из 70% формамида в 2х SSC. Покровное стекло стряхивали, и препарат быстро переносили в холодный (-20С) 70% этанол. Препараты проводили через серию спиртов (70%, 95% и 100% этанол) при -20С по 3 минуты в каждом и сушили на воздухе.
На сухие стекла наносили по 10 мкл гибридизационной смеси и накрывали покровным стеклом. Для предотвращения высыхания препарата покровное стекло заклеивали по периметру резиновым клеем.
Гибридизацию проводили при 37С во влажной камере в течение ночи (16-18 часов). После с препаратов снимали покровные стёкла и отмывали при 42С дважды в 0.1х SSC и дважды в 2х SSC по 10 минут в каждом растворе, затем при комнатной температуре в 2х SSC и 1х PBS по 5 минут в каждом.
Исследование распределения Spelt-1 и Spelt-52 повторов на хромосомах полиплоидных пшениц группы Timopheevi
Предполагают, что Т. araraticum образовался в результате гибридизации Ае. speltoides с Т. urartu (Dvorak et а/., 1992, 1993; Dvorak, 1998; Бадаева, 2000; Feldman, 2001). Наличие специфического для Ае. speltoides повтора (он не обнаружен в геномах других видов Aegilops секции Sitopsis) на всех хромосомах G-генома и большинстве хромосом В-генома еще раз подтверждает родство пшениц группы Эммер и Тимофеева, а также то, что именно Ае. speltoides послужил донором этих геномов пшеницы. Как пшеницы, так и Ае. speltoides показали значительную внутривидовую изменчивость распределения Spelt-1 повтора. Поскольку размер сигналов гибридизации отражает уровень копийности последовательности в геноме, мы смогли приблизительно оценить изменение ее содержания в геномах видов, представляющих две эволюционные линии пшеницы, в сравнении с диплоидным предком.
В изученных нами растениях Ае. speltoides все хромосомы содержали не менее одного, а чаще два крупных сайта Spelt-1 повтора, в среднем 24 сигнала на диплоидный набор хромосом. У этого вида, однако, был обнаружен один образец, в котором эта последовательность практически отсутствовала: FISH выявила у него только один Spelt-1 локус (Salina et a/., 2006b). Тем не менее, в подавляющем большинстве образцов Ае. speltoides повтор Spelt-1 присутствует в избытке: FISH выявила от 23 до 28 крупных или средних сайтов на диплоидный набор хромосом. Это вполне согласуется с оценкой содержания этого повтора в геноме - 1,5-5,3 х 105 копий, определенной методом "squash -дот-гибридизации (Pestsova et а/., 1998; Salina etai, 1998, 2004а).
Эти же авторы показали, что в геномах полиплоидных пшениц число копий Spelt-1 последовательности значительно уменьшается - до 102-104. У видов группы Timopheevi уровень повтора был стабильно высоким - порядка 103, тогда как у тетраплоидных и гексаплоидных пшениц группы эммер он значительно варьировал - от менее чем 100 копий до 1,2 х 104 (Pestsova etai, 1998).
Проведенное нами исследование показало, что, у видов группы Timopheevi число Spelt-1 локусов достаточно постоянно - 2-3 крупных или очень крупных, два среднего размера и от одного до трех мелких или очень мелких (на уровне разрешения метода) на гаплоидный геном. Исходя из этого, можно ожидать лишь незначительную внутривидовую вариабельность по содержанию повтора у Т. araraticum и еще более низкий уровень полиморфизма у Т. timopheevii, что и было показано "squash -дот-гибридизацией (Pestsova et а/., 1998). В то же время, по числу и размеру Spelt-1 сайтов эти пшеницы существенно уступали Ае. speltoides. Таким образом, можно говорить, что уровень копийности Spelt-1 повтора в геномах тетраплоидных пшениц группы Timopheevi снижается как за счет сокращения общего числа локусов, так и уменьшения числа копий Spelt-1 повтора в каждом из них.
Эта тенденция еще более выражена у видов, представляющих вторую эволюционную линию пшеницы - группу Эммер. Если у видов группы Timopheevi выявлено в среднем по 5,3 Spelt-1 сайта на гаплоидный геном, то у тетраплоидных эммеров это число равнялось 1,19 локуса, а у гексаплоидных видов их еще меньше - 0,43. Низкое содержание повтора у этой группы пшениц в сравнении с Ае. speltoides и Т. timopheevii/ Т. araraticum, по-видимому, связано как с уменьшением числа потенциальных сайтов гибридизации, так и количества локусов в конкретном генотипе. С другой стороны, образцы, в которых обнаружено по 3 крупных сигнала на гаплоидный геном, могут приближаться по содержанию Spelt-1 последовательности к видам группы Timopheevi. Сравнение наших данных с результатами "squash -дот-гибридизации показало, что действительно, содержание повтора у видов группы эммера варьирует в более широких пределах, достигая в ряде случаев уровня копийности Spelt-1 повтора у видов A G-геномной группы (Pestsova et а/., 1998). В то же время, отсутствие сигнала у Т. carthlicum и в образцах некоторых других видов может быть связано с тем, что у них уровень копийности повтора настолько мал, что его невозможно выявить с помощью FISH-гибридизации.
Различия между изученными группами полиплоидных пшениц и их отличие от диплоидного Ае. speltoides может быть обусловлено следующим:
(1) Непосредственными предками Т. dicoccoides и Т. araraticum послужили разные растения Ае. speltoides, которые могли значительно отличаться по содержанию и распределению исследованных повторов - «эффект основателя»;
(2) Образование Т. dicoccoides и Т. araraticum и их последующая эволюция сопровождались постепенной элиминацией Spelt-1 последовательности из хромосом B/G генома. При этом уровень копийности Spelt-1 повтора в геноме предкового вида Ае. speltoides мог или сохраняться на прежнем уровне, или даже увеличиваться.
В пользу первого предположения свидетельствует то, что существующие в настоящее время образцы Ае. speltoides характеризуются значительным внутривидовым полиморфизмом по числу (от 2 до 28) Spelt-1 и Spelt-52 сайтов (Salina et at., 2006b), следовательно, родительские растения Ае. speltoides могли иметь промежуточные между этими величинами числа кластеров. Второе предположение учитывает результаты анализа новосинтезированных гибридов Triticum и Aegilops и их родительских форм (Salina et a/., 2004b). Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что при полиплоидизации Spelt-1 повтор имеет тенденцию к снижению, тогда как Spelt-52, наоборот, к увеличению числа копий.
