Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I . Плазмида пестщиногенности чумного микроба и признаки, детерминируеьие ею 10
1. Молекулярно-биологические характеристики плазмиды пестициногенности 10
2. Естициногенность чумного микроба 13
3. Фибринолитическая и плазмокоагулазная активности возбудителя чумы 17
ГЛАВА II. Метода изучения плазмид 19
1. Методы обнаружения и препаративного выделения экстрахромосомальной ДНК 19
2. Методы физического картирования плазмид 24
3. Методы изучения структурной организации плазмид 26
Собственные исследования
ГЛАВА III. Материалы и методй 32
1. Штаммы и препараты 32
2. Методы 3D
ГЛАВА ІV. Скршинг и препаративное выделение плазмид чумного микроба 46
ГЛАВА V. Физическое картирование ти -производных плазмиды пестициногенности 51
ГЛАВА VІ. Структурная организация плазмиды пестициноген ности чумного микроба 65
I. Локализация генов, детерминирующих синтез пестицина I и фибринолизина, на физической карте плазмиды пестициногенности. с. помощью рекомбинантной плазмиды рТР-4 66
2. Локализация участка инициации репликации плазмиды пестициногенности с помощью плазмиды pVP-1 70
3. Локализация гена, определяющего устойчивость клеток к пестицину I, на физической карте плазмиды пестициногенности 75
Заключение 78
Выводы 83
Список литературы 84
- Молекулярно-биологические характеристики плазмиды пестициногенности
- Методы обнаружения и препаративного выделения экстрахромосомальной ДНК
- Штаммы и препараты
- Локализация генов, детерминирующих синтез пестицина I и фибринолизина, на физической карте плазмиды пестициногенности. с. помощью рекомбинантной плазмиды рТР-4
Введение к работе
Актуальность проблемы. В клетках чумного микроба обнаружено три типа собственных плазмид (Попов с соавт., 1980; РегЪег, ВгиЪакег, 1981). Показано, что плазмида рРгаІ/Іох (мол.масса 65 Md) детерминирует синтез антигенов фракции I и"мышиного токсина" (Проценко с соавт.,1981,1983);
pCad (мол.масса 45 Md) определяет свойство зависимости роста клеток при 37С от ионов Са и синтез антигенов V, W (РегЪег, ВгиЪакег, 1981; Ben-Gurioa, Shafferman, 1981 ); а pPetl (мол.масса 6,3 Md) - продукцию пестицина, фибринолизина и плазмокоагулазы (Попов с соавт., 1980; Проценко с соавт.,1983).
Ранее было начато изучение структуры и функций плазмид возбудителя чумы. Построены физические карты по нескольким рестрикта-зам для плазмид pCad и pPstl (Portnoy et al., 1984; Можа-ров, 1982). Локализован ген, детерминирующий синтез белка I, на репликоне pOad Y.pseudotuberculosis (Bolln, Wolf-Watz, 1984). На основе полных репликонов плазмид pPetl и pBR-322 создана гибридная молекула pGH-б (Можаров, 1982), клонированы гены, ответственные за синтез пестицина I и иммунность клеток к этому бактериоцину (Гончаров, 1983). Получены производные плаз-миды пестициногенности, маркированные транспозонами ТпА (Гончаров, Мишанькин, 1982), Тп1 и Тп9 (Кутырев и др., 1984). Значительный интерес представляет локализация сайтов посадки транспозона Та1 на молекуле плазмиды пестициногенности, так как на основе Ти -меченых производных плазмид возможно конструирование делеционных плазмид ( Ohtsubo, 1982), что является одним из подходов картирования плазмидных репликонов.
- 7 -Изучение плазмид чумного микроба методами генетики и молекулярной биологии представляет интерес, поскольку признаки, детерминируемые генами этих плазмид, относят к факторам вирулентности возбудителя чумы ( Brobaker, 1972 ). Объектом настоящего исследования является плазмида пестициногенности чумного микроба. Выяснение структурной организации плаэмиды pPetl актуально, так как является необходимым этапом на пути определения роли отдельных генов в формировании фенотипа возбудителя чумы, в том числе свойств, ассоциированных с проявлением вирулентности. Под термином "структурная организация" подразумевается совмещенная физическая и генетическая карты плаэмиды. Решение этой проблемы открывает перспективу расшифровки механизмов регуляции синтеза пестицина I и фибринолизина, а также создания штаммов-продуцентов этих субстанций.
Цель работы. Целью данного исследования являлось изучение структурной организации плазмиды пестициногенности чумного микроба.
Задачи исследования:
Разработка оптимального метода скрининга и препаративного выделения плазмид из клеток чумного микроба различного происхождения.
Локализация сайтов интеграции и определение ориентации транспозонов на Тп-меченых производных плазмиды пестициногенности pPetl чумного микроба.
Конструирование гибридных молекул на основе вектора pBR-325 и Тп -меченых производных плазмиды пестициногенности. Получение делеционных плазмид на основе Тп -производных плаэмиды
pPstl. Изучение экспрессии полученных плазмид в клетках кишечной палочки и чумного микроба.
_ 8 -
4. Локализация генов, детерминирующих синтез пестицина I и фибринолизина, а также области инициации репликации плазмкды пестициногенности на ее физической карте.
Научная новизна. В результате выполнения работы получены следующие новые данные;
Разработана модификация метода, позволяющая сократить время, затрачиваемое на обнаружение плазмид в штаммах чумного микроба, до 4 часов, и время, необходимое для препаративного выделения ДНК плазмид, - до 48 часов.
Локализовано положение транспозонов Тп1 и Тп9 в Тп-меченых производных плазмиды пестициногенности чумного микроба. Определена ориентация транспозона Тп1 в плазмидах рТК-1 и pVK-2.
На основе вектора pbr -325 создана рекомбинантная молекула рУР-4, детерминирующая синтез фибринолизина и пестицина I. Показано, что экспрессия генов гибридной плаэмиды в клетках чумного микроба и кишечной палочки различна.
Получена делеционная производная плазмиды pVK-1 детерминирующая синтез пестицина I. Установлено, что выражение генов этой плазмиды одинаково в клетках S.eoll и Y.pestis.
Определена структурная организация плазмиды пестициногенности. На физической карте локализованы гены пестицина I, фибринолизина, иммунности к пестицину I, а также область инициации репликации orl.
Практическая ценность. На основе результатов проведенной работы составлены методические рекомендации "Простой и эффективный метод обнаружения и выделения плазмид из клеток чумного микроба", одобренные Ученым Советом (протокол
_ 9 -
№ 10 от 6 июня 1984 года) и утвержденные директором Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института "Микроб".
Оформлено рационализаторское предложение "Модификация метода тестирования штаммов чумного микроба на наличие фибринолитиче-ской активности", принятое Советом БРИЗ ВНИПЧЙ "Микроб" за № 549, протокол № 3 от 25 июня 1984 года.
Депонированы в музее живых культур института "Микроб" штаммы чумного микроба, содержащие рекомбинантную плазмиду pVP-4, и штаммы, содержащие плазмиду рТР-1, являющуюся делеционной производной плазмиды pVX-1.
Эти штаммы могут быть использованы в качестве продуцентов антигенов для иммунизации и адсорбента при получении моноспецифических сывороток к пестицину I и фибринолизину.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Молекулярно-биологические характеристики плазмиды пестициногенности
В литературе имеются сведения об определении молекулярной массы плазмиды pPetl рядом авторов. По данным Ю.А.Попова с соавт. (1980), 0.А.Проценко с соавт. CI98I, 1983), М.Н.Ляпина с соавт. (1983) ее молекулярная масса составляет 6,0-6,3 Md; E.Ben-Gurlon, A.Shaffermaii (1981) - 12,5 Md; D.M.Ferber, R.B.. - II Brubaker (1981) - 6 Ни; О.Т.Можарова (1982) - 6,3 Md; Е.К.Гончарова и Б.И.Ыишанькина (1982) - 5,5 Md. Эта плазмида является неконъюгативной, поскольку отсутствует ее перенос в условиях контакта пестициногенных и апестициноген-ных клеток. Показано, что для передачи плазмиды pPstl необходимо присутствие в клетках н-плазмид, способных к мобилизации плазмиды пестициногенности (Кольцова с соавт., 1971; Проценко, 1973; Кутырев, 1979; Проценко, 1981).
Изучены некоторые молекулярно-биологическне свойства плазмиды пестициногенности. Установлено, что плазмида pPstl имеет "ослабленный" контроль репликации, то есть в норме клетка содержит 13-16 копий этого репликона (Можаров, 1983). Обработка клеток хлорамфениколом приводит к увеличению числа копий плазмиды до 200 (Можаров, 1983).
Построена физическая карта плазмиды pPetl для 6 рестрик-таз: Ват НІ, НідйШ, Bgl И, PstI, Sma I, Есо НІ (Можаров,І982, 1983) и для 5 рестриктаз: Всо EI, Bam HI, Hind HI,BgiII, Kpnl (Гончаров, Мишанькин, 1982; Гончаров, 1983). Однако, данные этих авторов несколько различаются по определению количества сайтов рестрикции Есо EI на плазмиде pPstl. Как показано О.Т.Можа-ровым (1982) плазмида pPstl разрезается рестриктазой Есо EI на 4 фрагмента; Е.К.Гончаров, Б.И.Мишанькин (1982) сообщают о наличии 3 сайтов рестрикции этой реетриктазы на данном репликоне. По нашему мнению, это различие может быть объяснено с точки зрения микроэволюции плазмиды пестициногенности в различных штаммах чумного микроба. Аналогичные данные получены при изучении родственных друг другу плазмид Col Е2-Р9 и Сої Е2-ОЦ2, выделенных из различных штаммов кишечной палочки (Wateon, Visent in, 1980).
С помощью методов генетической инженерии получена гибридная плазмида pGM-б, состоящая из полных репликонов плазмид рВВ-322 и pPstl. Данная плазмида способна определять синтез клетками пестицина I, фибринолизина и коагулазы, а также устойчивость клеток к ампициллину и тетрациклину (Можаров, 1982, 1983).
В.М.Сорокин с еоавт. (1982) и Е.К.Гончаров (1983) сообщают о клонировании 3,15 Md -фрагмента плазмиды pPetl, ограниченного участками узнавания рестриктаз Eco RI и Ват НІ в составе вектора рВН-322, и о локализации на этом фрагменте генов, детерминирующих синтез пестицина I и иммунность клеток к действию этого бактериоцина.
Поскольку плазмида пестициногенности pPetl не имеет удобных селективных маркеров, проведена работа по "мечению" этой плазмиды транспозонами, несущими гены резистентности к антибиотикам. Получена серия плазмид pYP 01-07, являющихся ЯаА -производными плазмиды pPstl (Гончаров, Мишанькин, 1982). Особенностью этих плазмид является утрата ими способности детерминировать синтез фибринолизина и плазмокоагулазы в результате встраивания транспозона твА. Методом рестрикционного анализа установлены сайты встраивания транспозона ФпА в плазмиду pPstl (Гончаров, Мишанькин, 1982). Другая серия Тп-меченых производных плазмид получена В.В.Кутыревым (1984) с помощью встраивания транспозонов ТШ и їп9 в плазмиду пестициногенности. Изучение экспрессии плазмид этой серии in vivo показало, что плазмиды pVK-1, pVK-3» pVK-9 обеспечивают клеткам способность синтезировать пестицин I, фибринолизин, коагулазу и определять иммунность к пестицину I, а также устойчивость к действию ампициллина, в отличие от плазмиды pVK-2, которая утрати -ІЗ-да способность детерминировать синтез пестицина I (Кутырев с соавт., 1984).
Показано, что встраивание репликона pBR-322 в плазмиду pPetl по сайтам рестрикции эндонуклеаз Бсо КЕ, Вре I и Валіні приводит к инактивации гена petl в гибридной плазмиде (Можа-ров, 1983). Таким образом удалось приблизительно определить район плазмиды pPstl, ответственный за синтез пестицина I (Мо-жаров, 1982; 1983; Ляпин с соавт., 1983).
В.М.Сорокин с соавт. (1982) и Е.К.Гончаров (1983) локализовали 4 промотора на 3,15 Md -фрагменте плазмиды p?etlt ограниченном сайтами узнавания рестриктаз Ш и Bam HI.Таким образом, к настоящему времени с помощью методов молекулярной биологии получены некоторые характеристики плазмиды, а именно: молекулярная масса, копийность, коньюгативность, локализация сайтов рестрикции для 6 рестриктаз на молекуле pPstl, приближенно определена область локализации гена pstl.Имеющиеся литературные данные не позволяют считать, что изучение плазмиды пестициногенности чумного микроба завершено.
Методы обнаружения и препаративного выделения экстрахромосомальной ДНК
К настоящему времени разработано несколько основных подходов и большое число их модификаций, позволяющих выявлять и препаративно выделять плазмидную ДНК из клеток микроорганизмов.
Основными этапами методов скрининга и выделения плазмид являются следующие: получение клеточной биомассы и ее дезинтеграция; децротеинизация лизата; очистка плазмидной ДНК от ДНК хромосомы и РНК.Наращивание биомассы производят в питательных средах при условиях, оптимальных для определенного вида бактерий. Для разрушения клеток применяют ионные (додецил сульфат натрия, дезокси-холат натрия) и неионные (тритон Х-ЮО, тритон В, бридж - 58, нонидет Р - 40) детергенты (Clewell, Helinski, 1969; Gnerry etel., 1973? Vapnek et al.» 1976; Ohtsubo et al., 1978; Kozlov et al.,1978; Holmes,Quigley,1981).06pa6oTKy неионными детергентами производят после предварительной инкубации клеток в растворе ли-зоцима (Eckhardt, 1978). Для удаления клеточного дебриса используют высокоскоростное центрифугирование (Clewell, Helinski, 1972; Eisenberg, Holmes, 1982).
Депротеинизадию осветленного лизата осуществляют различными способами: обработкой смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1) Leblanc, bee, 1979), инкубацией в смеси хлороформа с фенолом (1:1) (Kudo, Ми, 1981), обработкой забуференным фенолом (Meyers et al., 1976), обработкой проназой (Womble et al., 1977), а также созданием высокой ионной силы раствора с помощью хлорида цезия (Можаров, 1982; Clewell, Helinski,1969; Kleeberger, Klingmuller, 1980),
Стадия депротеинизации является заключительной в методах скринирования плазмидной ДНК.Дальнейшая очистка ДНК плазмид для ее препаративного выделения включает в себя самый трудоемкий этап - удаление РНК и хро-мосомальной ДНК. Эта цель может быть достигнута с помощью различных методических подходов: дифференциального осаждения в градиентах плотности, избирательного гидролиза хромосомальной ДНК, разделения в двухфазных системах, разделения по плавучей плотности в присутствии интеркалирующих красителей, использования мини-клеток, хроматографического и электрофоретического разделения.Дифференциальное осаждение плазмидной и хромосомальной ДНК достигается центрифугированием в градиенте сахарозы при нейтральном и щелочном рН (Campbell, 1962; Yinograd et al., 1965; Ineelburg, 1971; Jewely, Jlelling, 1980).
Установлено, что в интервале рН от 12,2 до 12,5 линейная и открытая формы плазмидной ДНК, а также ДНК хромосомы денатури - 21 -ругот, в то время как суперскрученная форма плазмидной ДНК остается без изменений. Метод щелочной денатурации хромосомальной ДНК, основанный на этом явлении, широко используется при выявлении и препаративном выделении плазмид из клеток бактерий (Rush,Warner, 1970; Currier, Hester, 1976; Hansen, Olsen, 1978; Birn boim, Doly, 1979; behlanc, bee, 1979; Кайо, Liu, 1981; «ikesellet al., 1981).В 1978 году опубликован метод препаративного выделения плазмидной ДНК с использованием кислого фенола рН 4,0 для очистки плазмидной ДНК от примесей хромосомальной ДНК и РНК ( Zasloffet al., 1978). Сущность метода заключается в том, что суперскрученная форма плазмидной ДНК остается в водной фазе, а линейная, открытая и хромосомальная ДНК локализуются на границе раздела фаз кислого фенола и водной.Отрицательной стороной метода является необходимость работы с вредным веществом, каковым является фенол, а также потребность в дополнительной процедуре - диализе препарата для удаления следов фенола.
Оригинальный метод выделения ДНК плазмид был предложен j.in selburg, M.Puke (1970). Этот метод основан на использовании некоторых штаммов кишечной палочки, клетки которых способны продуцировать мини-клетки, не содержащие хромосомальной ДНК. Если клетки исходного штамма содержат плазмиду, то часть популяции мини-клеток содержит эту плазмиду. Мини-клетки получают с помощью центрифугирования исходной культуры в проточном роторе. При разрушении мини-клеток и последующей депротеинизации лизата можно получить плазмидную ДНК, лишенную примесей хромосомальной ДНК. Этим методом были выделены ДВК плазмид Col Е1, Col В, R6K (In selburg, Puke, 1970; Inselburg, 1971; Cohen et al.,1971; bevy,1971). Однако следует отметить, что количественный выход плазмидной ДНК в этом случае невелик из-за трудности получения большого количества мини-клеток.
Наиболее эффективным, на наш взгляд, методом препаративного выделения ДНК плазмид является разделение суперскрученной ДНК плазмид и хромосомальной ДНК по их плавучей плотности при центрифугировании в градиенте раствора хлористого цезия в присутствии интеркалирующего красителя бромистого этидия С Radloff et al.,1967). Бромистый этидий в большей степени интеркалирует в линейную, чем в суперскрученную ДНК плазмиды, увеличивая различие их плавучих плотностей. Различие величин плавучих плотнос-тей может составлять 0,217 г/см (Currier, Hester, 1976), что достаточно для разделения линейной и суперскрученной ДНК в градиенте хлористого цезия. Наряду с бромистым этидием в последние годы используется и другой интеркалирующий краситель-йодистый пропидий (Pettljohn, Pfexminger, 1980).
В первых работах по выделению плазмидной ДНК с помощью центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия использовали грубые лизаты клеток (Radloff et al., і967). Позже было предложено использовать для этих целей просветленные лизаты и предварительное концентрирование ДНК с помощью переосаждения этанолом ( Olewell, Helinski, 1969, 1972) или полиэтиленгли-колем ПЭГ-6000 (НшрИгеуа et al., 1975).
Штаммы и препараты
Антибиотики: ампициллин (40 мкг/мл), хлорамфени-кол (25 мкг/мл), тетрациклин (25 мкг/мл) - отечественного производства. Питательные среды: агар и бульон Хоттинге-ра, рН 7,2; среда ЬВ (10 г триптона Bacto , 5 г дрожжевого экстракта Bacto , 10 г хлористого натрия на I л (Миллер, 1976). Оборудование, использованное в работе, поименовано в описании методов. Реактивы: I. Бромфенол синий, хлороформ, этанол, соляная кислота, н-бутанол, изопропанол, уксусная кислота, хлористый кальций, лимоннокислый натрий, хлористый натрий, жидкий азот, фибриноген, ДНК-лигаза фага Т4, рестриктазы EcoBI,SalGl, ВашНТ, Xhol, PstI, HincH, Bpel, Smal - отечественного производства. 2. Сахароза, лизоцим, динатриевая соль ЭДТА, додецил-сульфат натрия (ДСН), трис-(окси)-метиламинометан, хлорид цезия, проназа Р - производства фирмы Serva (ФРГ). 3. Хлорид калия, сульфат аммония - производства фирмы Merck (ФЕТ). 4. Ацетат натрия, хлорид магния, гидроокись натрия - производства фирмы Pluka (Швейцария). 5. Тритон Х-100 - производства фирмы BDH (Англия). 6. Бромистый этидий, дитиотрейтол (ДТТ), АТФ - производства фирмы Caltdoehem (США). 7. Агароза I типа - производства фирмы Sigma (США). 8. Пептон, триптон Bacto дрожжевой экстракт Bacto - производства фирмы Difсо (США). 9. ДНК фага Я - производства фирмы Boehringer-Manngeim (ФРГ). Методы Процедура скрининга плазмид штаммов чумного микроба
Культуру выращивали в 5 мл бульона Хоттингера или среды ьв в течение ночи на качалке при 28С. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 g 10 мин, ресуспендировали в 0,5 мл трис-сахарозы (50 шМ трис- НС1, рН 8,0; 25% сахарозы), добавляли 200 мкл раствора лизоцима (10 мг/мл на 0,25 М растворе Яа2 ЭДТА), инкубировали 30 мин при комнатной температуре, добавляли I мл тритон-смеси (10 шМ трис-Н01, рН 8,0; 40 тМ ЭДТА; 18$ тритона Х-100), выдерживали 1-2часа при комнатной температуре. Осколки клеток осаждали центрифугированием при 35000g в течение 30 мин. К супернатанту добавляли два объема этилового спирта, оставляли на 30 мин при ч4С, центрифугировали при 3000g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в I мл раствора 0,01 х SSO (1,5 шМ NaCl, 0,15 шМ цитрата На), вносили ДСН до конечной концентрации 2%. После перемешивания добавляли I мл изопропанола, инкубировали при комнатной температуре 5 мин, центрифугировали при 15000 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 0,01 х SSC, содержащего 2% ДСН. Использовали по 20-40 мкл для электрофореза в агарозном геле. Препаративное выделение плазмид из клеток чумного микроба
Культуру выращивали в 0,5 л среды LB в течение ночи при 28 С с аэрацией. Клетки осаждали центрифугированием при 5000g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 25 мл трис-сахаро-зы (50 шМ трис- НС1, рН 8,0, 25% сахарозы), добавляли 10 мл раствора лизоцима (10 мг/мл на 0,25 М растворе И&2 ЭДТА).
Спустя 20 мин вносили 80 мл тритон-смеси (10 идо трис- неї, рН 8,0, 40 ml На2 ЭДТА, 18fo тритона Х-ЮО) и оставляли на ночь при 44С. Лизат осветляли центрифугированием в течение 30 мин при 35000 g добавляли двукратный объем этанола и ацетат На до конечной концентрации 0,3 М. Смесь выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем - в течение часа при -20С. Преципитат собирали центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин и ресуспендировали его в 50 мл буфера TES (50 тМ трис- НС1, рН 8,0, 5 ИМ т ЭДТА, 50 юн NaCl). Вносили в раствор навеску 54 г сухого CsCl и приливали 4 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Центрифугировали при 40000 об/мин в вертикальном роторе TV -865 центрифуги Sorvall 0ТД-50 (США) в течение 20 час при 16С. При КБ-освещении отбирали нижнюю полосу ДНК, соответствующую плазмид-ной ДНК. От бромистого этидия препарат освобождали добавлением н-бутанола, насыщенного TES. Обесцвеченный раствор разбавляли в два раза дистиллированной водой и заливали двукратным объемом этанола. Выдерживали 2 часа при -20С либо ночь при +4С. ДНК собирали центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин и ресуспендировали в I мл раствора 0,01 х SSC (1,5 шМ VaCl; 0,15 шМ цитрата На ).
Электрофорез ДНК в агарозном геле Электрофорез проводили в вертикальном 0,7% агарозном пластинчатом геле размером 3 х 140 х 140 мм в буфере TEA (40 им трис- НС1, рН 8,0, 2 шМ Яа2 ЭДТА, 20 шМ ацетата Na) при напряжении 4-6 В/см в течение 3-4 часов. Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл) в течение 15 мин. Гели просматривали в ультрафиолетовом свете на фильтре УФС-І и фотографировали фотоаппаратом "Зенит-Е" на пленку 65 ед. ГОСТа.
Локализация генов, детерминирующих синтез пестицина I и фибринолизина, на физической карте плазмиды пестициногенности. с. помощью рекомбинантной плазмиды рТР-4
Научение экспрессии шіаашідн рта-4 в системах В еоХ1 и Y.peetis показало, что эта шхазадда шєеі? различное выражение в клетках разных штаммов микроорганизмов В клетках вашшв кишечной п&зеткй G-60G И f , а также чртого микроба 1146 плазмида pYF 4 обеспечиваем фенотип устойчивости к антибиотикам ажшщ-шлкяу й ждоршфемиколу (Арг, Сшг} В клетках же зушого жкроба штамма J&T& экспрессия этой пяазшда обеспечивает феиожшческое выражение не только генов антмбко ТНКОреЗИСТеИТНОСТИ, НО й ГЄНОВ ДЄ 0рМШШрртїЦШЄ еИНТ-За ІІ00ТНЦИ" Рис, 13 Электрофореграмма реетриктов (& Взш их) штазмид р?К С1)? pW 4 (2) й PSBK325 (3) на 1 и фибринодиэина (Apr, 0mr? 0tx, 11) (рис» 14 табл,7). ме« 14 Результаты тес иров&нмя ш»шов шкрооргашашв- на прод кцшо клерками пеетщ$ш& I (а) и фкбрииоли ина (б) 8 4-1 -й 0-4 2- обозначение лдазшда р7$ 49 В? Y pestle Jara Экспрессия генов плазщцв рТ$-# и Y p«etts в клетках В soli ;ii ; Щештяпкчаская экспрессия признаков »» »4 «4«X№?№W.rt rti rt V ftnrtrt g eoli Є-600 В soli у Y p«?&tX Java - 70 Таким образом, 2,8 ш -фрагмент плазмиды pVK-2 состоит из I lid -участка транспозона Тп1 (ген ьіа ) (Ильина, 1981) и 1,8 Md -участка плазмиды pPst I. " На основании полученных данных сделан вывод о локализации генов, детерминирующих синтез пестицина I и фибринолизина, на фрагменте, расположенном между 1,7 и 3,5 Md физической карты плазмиды пестициногенности (рис, 19). Величина структурного гена pstl» -рассчитанная нами с учётом молекулярной массы пестицина I (65 ..ка)у " равна 1,14 Md. Величину структурного гена, определяющего синтез фибринолина, рассчитывали как разницу между величинами клонированного фрагмента плазмиды pPstl (1,8 Md ) и участка ДНК» приходящегося на долю гена petl (1,14 ма).0на составила 0,66 Md. Исходя из генетической емкости ДНК прокариот может быть вычислена молекулярная масса белка, кодируемого этим участком. По нашим расчетам она составляет приблизительно 38 Kd. Таким образом, молекулярная масса белка фибринолизина чумного микроба, рассчитанная нами, составляет не более 38 Kd. 2. Локализация участка инициации репликации плазмиды пестициногенности с помощью плазмиды pVP-1 С помощью ферментативного гидролиза рестриктазой БапШ с последующим лигированием полученных фрагментов по липким концам из плазмиды pVK-1 получена делеционная плазмида pVF-1 с молекулярной массой 3,65 Md (рис. 15).