Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Краткая история вопроса 14
1.2. Экстраклеточная ДНК плазмы крови человека 14
1.3. Поглощение ДНК эукариотической клеткой 16
1.4. Утилизация экстраклеточной ДНК, доставленной в ядро эукариотической клетки 21
1.5. Рекомбинация как возможный путь интеграции фрагментов экзогенной ДНК в реципиентный геном 25
1.5.1. Репарация по механизму гомологичной рекомбинации. Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации 26
1.5.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК. Захват фрагментов ДНК 31
1.6. ДЦР как индукторы репарационно-рекомбинационных процессов в
соматической клетке 33
1.6.1. Опознание повреждения и активация систем трансдуцирующих киназ 33
1.6.2. Функциональные ДЦР 35
1.6.2.1. Перетасовка генов иммуноглобулинов и генов TCR 35
1.6.2.2. Реорганизация генома стволовых клеток, вступающих на путь дифференцировки 36
1.6.3. ДЦР, индуцированные внешним воздействием. Действие химиотерапии и облучения на систему кроветворения 38
1.6.3.1. Основные характеристики системы кроветворения млекопитающих 39
1.6.3.2. Угнетение системы кроветворения облучением 41
1.6.3.3. Метаболизм ЦФ в организме. Действие на систему кроветворения 43
1.6.3.4. Репарация возникших повреждений после облучения 45
1.6.3.5. Репарация повреждений после воздействия ЦФ 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 55
2.1. Препарат ДНК человека 55
2.2. Приготовление меченой ДНК 55
2.3. Культура клеток. Обработка клеток меченой ДНК 55
2.4. Выделение ДНК 56
2.4.1. Выделение ДНК клеточных компартментов 56
2.4.2. Метод заливки ядер в блоки легкоплавкой агарозы 57
2.4.3. Выделение ДНК из органов мышей 57
2.5. Приготовление препаратов ядер клеток костного мозга 58
2.6. ПЦР на предметных стеклах 58
2.7. Полимеразная цепная реакция 60
2.8. Электрофорез в агарозном геле 61
2.9. Секвенирование ПЦР фрагментов ...61
2.10. Саузерн-блот гибридизации 62
2.11. Эксперименты с мышами 62
2.11.1. Схемы введения мышам препаратов в экспериментах по радиопротекции 62
2.11.2. Введение мышам ЦФ и ДНК человека 63
2.11.3. Введение мышам ДНК 64
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Радиопротекторное действие экзогенной фрагментированной ДНК 65
3.2. Воздействие кросслинкирующего цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК на организм мышей 70
3.2.1. Влияние фрагментированной ДНК на выживаемость мышей после введения ЦФ 70
3.2.2. Поглощение экзогенной ДНК стволовыми клетками 75
3.2.2.1. Проникновение экзогенной ДНК в ядерное пространство эмбриональных стволовых клеток человека 75
3.2.2.2. Поглощение экзогенной ДНК клетками костного мозга мыши 80
3.2.3. Выявление фрагментов ДНК человека во фракции геномной ДНК экспериментальных животных после воздействия ЦФ и ДНК 83
3.2.3.1. ПЦР анализ геномной ДНК экспериментальных животных 83
3.2.3.2. Сравнительный Саузерн-блот анализ геномной ДНК экспериментальных животных 88
3.2.4. Возможные события, определяющие появление последовательностей ДНК человека во фракции геномной ДНК экспериментальных животных 93
Заключение 98
Выводы 101
Список литературы 102
- Репарация по механизму гомологичной рекомбинации. Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации
- Реорганизация генома стволовых клеток, вступающих на путь дифференцировки
- Схемы введения мышам препаратов в экспериментах по радиопротекции
- Проникновение экзогенной ДНК в ядерное пространство эмбриональных стволовых клеток человека
Введение к работе
Актуальность. История вопроса воздействия экзогенной ДНК на соматическую клетку и организм в целом относится к середине прошлого века. До настоящего времени в научной литературе имеется разрозненная информации о том, какие процессы в клетке вызывает проникновение фрагментов экзогенной ДНК во внутриклеточное пространство.
Судьба экзогенной ДНК, оказавшейся во внехромосомиом пространстве ядра, принципиально имеет три исхода: (I) деградация фрагментов до мономеров, которые используются клеткой для синтетических процессов, (2) образование экстрахромосомных стабильно существующих и реплицирующихся вместе с геномом структур ДНК, (3) интеграция фрагментов в геном клетки.
В результате протекания первого пути - использование чужеродного генетического материала в качестве мономеров для синтетических процессов, протекающих в эукариотической клетке, - в структуре реципиентного генома не появляются молекулы чужеродного происхождения, несущие какую-либо генетическую информацию.
Второй путь - появление в клетке стабильно существующих, несущігх структурно и функционально значимый генетический материал экстрахромосомиьгх единиц, образованных объединением фрагментов экзогенной ДНК, доставленных в ядерное пространство. Процедура получения трансгенных как стабильно, так и транзитно трансформированных культур клеток широко используется в современной молекулярно-биологической практике. Экстрахромосомпые структуры транзитно трансформированных клеток несут специфические вирусные последовательности, селективные и маркерные гены, позволяющие им реплицироваться и определенное время сохраняться в рециниентиых клетках. Внехромосомная структура должна обладать последовательностью Оті репликации, воспринимаемой молекулярной синтетической машиной реципиентной клетки. При пролиферации определенной популяции клеток, содержащих такой стабильный автономно реплицирующийся генетический материал, он может выявляться в молекулярных экспериментах как структура, обладающая уникальными молекулярными характеристиками (размер, рестрикционпая карта, содержание определенных специфических последовательностей).
Интеграция чужеродного генетического материала в рецитшентный геном в форме индивидуальных, пришедших извне фрагментов ДНК является третьей из возможностей поведения чужеродной ДНК. Известно, что экзогенная ДНК экстрахромосомной локализации может интегрировать в геном клетки-реципиента двумя способами: гомологичной и негомологичной (незаконной) рекомбинацией (Wiirtcle et al., 2003). Интеграция с использованием механизма гомологичной рекомбинации зависит от ретшративных факторов и достаточной гомологии между экзогенной ДНК и ДНК хромосомы (Takata et al., 1998; Smith, 2001; WUrtcle et al., 2003). При интеграции по механизму незаконной рекомбинации экзогенная ДНК внедряется в негомологичные районы хромосом, используя объединение разорванных концов (Takata et al., 1998; Smith, 2001; Lee et al., 2005). Интеграции и появлению в геноме информации, исходно экзогенной локализации, путем гомологичной или незаконной рекомбинации, способствует
наличие н клетке двухцепочечных разрывов (ДЦР) хромосом (Paques, Haber, 1999; Johnson, Jasin, 2000; Rodrigue et al., 2006).
В неповрежденной клетке с нормально функционирующими системами контроля прогрессии клеточного цикла интеграция экзогенной ДНК, по-видимому, происходить не может (Bergsmedh et al., 2002). Тем не менее, эксперименты по горизонтальному переносу генетического признака свидетельствуют о принципиальной возможности интеграции экзогенной ДНК в геном реципиеитпых клеток (Anker et al., 1980; Pulciani et al., 1982; Garcia-Olrao et al, 1999; Holmgren et al., 1999; Garcia-Olmo et al, 2000; Bergsmedh et al., 2002). Предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК могут интегрировать в геном в двух случаях. Во-первых, при нарушениях в системе, контролирующей прогрессию клеточного цикла, как, например, в случае неотрансформированных клеток (Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002; Yakubov et al., 2007). А во-вторых, при активированном состоянии репарационно-рекомбинационной машины клетки, например, прн появлении ДЦР в молекуле ДНК хромосомы или при интеграции вирусной ДНК. Цели и задачи работы. Целью данной работы является:
Характеристика явлений, связанных с участием фрагментов экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных у-радиацией и кросслинкирующим цитостатиком циклофосфаном (ЦФ). В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать радиопротекторное действие экзогенной ДНК при ее введении в организм экспериментальных животных после летальных доз у-облучения.
-
Исследовать совместное действие на организм мышей цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК.
-
Определить возможность поглощения экзогенной ДНК стволовыми клетками, растущими в культуре.
-
Изучить проникновение экзогенной ДНК в клетки костного мозга при введении в организм экспериментальных животных.
-
Провести молекулярно-генетический анализ геномной ДНК экспериментальных животных после совместного воздействия ЦФ и экзогенной ДНК.
Научная новизна. Впервые обнаружено, что экзогенная ДНК проявляет радиопротекторное действие при ее введении в организм экспериментальных животных в строго определенный момент времени после летальных доз у-облучения. Этот промежуток времени составляет 5-30 мин после быстрого (5-Ю мин) набора организмом летальной дозы у-радиации. Впервые показано, что инъекции экзогенной ДНК человека мышам, подвергшимся сублетальной дозе у-облучения, приводят к формированию селезеночных колоний, которые являются потомками стволовых клеток крови.
Впервые обнаружен феномен гибели мышей при введении цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК в определенный момент времени. Максимальный летальный эффект наблюдается при введении ДНК каждый час в период 18-30 ч после ЦФ.
С-
Практическая значимость. Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейших исследовании воздействия экзогенной ДНК на организм высших эукариот, включая человека, а также для изучения участия экзогенной ДНК в репарационных процессах. Обнаруженный феномен истинного или транзитного трансгенеза чужеродным генетическим материалом при совместном воздействии экзогенной ДНК и агента, вызывающего появление ДЦР хромосомы, может стать новым направлением в генной терапии человека и животных.
Положении, выносимые на защиту.
-
Экзогенная ДНК в виде фрагментов доставляется в стволовые клетки костного мозга мышей и депонируется во внехромосомном пространстве ядра.
-
Инъекции экзогенной ДНК смертельно облученным мышам приводят к спасению экспериментальных животных. Радиопротекторное действие экзогенной ДНК проявляется при ее введении в организм экспериментальных животных в течение 5-30 мин после быстрого (5-10 мин) набора летальной дозы у-рздиации и связано с формированием селезеночных колоний.
-
Введение мышам цитостатика ЦФ и следующие за этим в определенный момент времени инъекции экзогенной ДНК приводят к гибели экспериментальных животных. Во фракции геномной ДНК некоторых соматических тканей погибших мышей обнаруживаются стабильно присутствующие фрагменты чужеродной ДНК.
Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах И Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-27 июня 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - и рецензируемых журналах из списка ВАК.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) проводилась совместно с к.б.н. М.А. Прохорович. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством К.М.Н. В.П. Николипа и к.б.н. Н.А. Поповой. Подсчет форменных элементов крови проводился совместно с Т.Д. Дубатоловой.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах, содержит 26 рисунков и 5 таблиц.
Репарация по механизму гомологичной рекомбинации. Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации
Кроме этого, авторы показали, что в используемой системе для фиксации и сохранения горизонтально перенесенного признака должна отсутствовать активность циклин-киназного ингибитора р21. Предполагается, что р53, через активацию р21, предохраняет нормальные клетки от репликации после поглощения клеткой апоптозных телец, что предотвращает возможность интеграции чужеродного генетического материала в геном этих клеток.
В экспериментах, выполненных другой группой ученых (Garcia-OImo et а!., 1999; Garcia-OImo et ai, 2000), был описан горизонтальный перенос генетического материала при развитии новообразования. Циркулирующая ДНК в плазме больных раком обнаруживается даже тогда, когда в клеточной фракции крови она не выявляется. Этот факт заставил авторов выдвинуть предположение, что раковая трансформация клеток в других частях организма может осуществляться за счет горизонтального переноса током крови ракового генотипа и «инфекции» здоровых клеток фрагментами ДНК, содержащими онкогены. Тем самым был предположен механизм «генометастазирования».
Авторы на культуре клеток крысы продемонстрировали трансфекцию реципиентных клеток маркерным онкогеном. При интраперитонеальном введении здоровым крысам плазмы от крыс больных раком, маркерный ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы выявлялся в экстрактах клеток легкого всех проверенных животных через несколько недель после инъекции. Аналогичные данные были получены в ранней работе (Pulciani et al, 1982), где было показано присутствие доминантного онкогена в раковых клетках как результат переноса злокачественного фенотипа от раковых клеток к здоровым через трансфекцию очищенной геномной ДНК. В работе Анкера с соавторами (Anker et al., 1980) было показано, что обработка В-лимфоцитов, не продуцирующих антитела против вируса герпеса, супернатантом Т-лимфоцитов, стимулированных вирусом, или ДНК, выделенной из этого супернатанта, приводит к синтезу специфических антител В-лимфоцитами. Более того, антитела, вырабатываемые В-лимфоцитами, несут аллотипические характеристики донорных Т-клеток. Интересны эксперименты по лечению крыс Браттлеборо, гомозиготных по мутантному аллелю в гене предшественников вазопрессина, фрагментированной ДНК, выделенной из здоровых крыс (Хегай и др., 2004). Как показали исследования, у крыс оказалось достоверно сниженным суточное потребление воды, что свидетельствует о появлении в организме функционального гормона. Вновь возникший признак устойчиво сохранялся на протяжении двух последующих недель эксперимента вплоть до забоя опытных животных.
Показана возможность обратной трансформации раковых клеток в нераковые длительным культивированием клеток с фрагментированной ДНК человека на примере культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 (Якубов и др., 2002; Yakubov et al, 2003).
Приведенные выше факты свидетельствуют о существовании механизма утилизации экстраклеточной ДНК, доставленной в ядро реципнентной эукариотическоп клетки, в качестве источника генетической информации.
В связи с этим, была выдвинута гипотеза о существовании непрерывного оборота ДНК в организме (Якубов и др., 2002). Такой оборот ДНК включает в себя поступление в биологические жидкости организма ДНК клеток, подвергшихся апоптозу, захват этой ДНК или специфическими рецепторами, или с помощью фагоцитоза и доставка ее в ядерные компартменты. В ядре экстраклеточная ДНК подвергается гомологичному обмену с хромосомным генетическим материалом по механизму гомологичной рекомбинации. Возможно также, что достигшая ядра апоптозная ДНК используется как экстрахромосомная матрица. Следствием этих событий является появление в геноме реципиентной клетки генетического материала, исходно экстраклеточной локализации. Таким образом, клеточный геном одновременно и постоянен, и непрерывно меняется за счет «проточной» статистической гомологичной рекомбинации, которая, как предполагается, существует между экстраклеточной ДНК, доставленной в ядро, и ДНК хромосом.
Несмотря на свою изящность, у этой гипотезы имеется одно противоречие, заключающееся в том, что любая здоровая клетка имеет мощный аппарат защиты от интеграции чужеродного генетического материала в свой геном. Это системы клетки, арестующие клеточный цикл при различных стрессовых ситуациях, в частности, при попадании внеклеточной ДНК внутрь реципиентной клетки до полного удаления такой ДНК из клеточных компартментов (Bergsmedh et al, 2001). Встал вопрос о том, как можно разрешить такое противоречие, при котором, с одной стороны, многочисленные факты свидетельствуют о возможности интеграции чужеродной ДНК в геном эукариотической клетки (Anker et al, 1980; Pulciani et al, 1982; Garcia-Olmo et al, 1999; Holmgren et al, 1999; Garcia-Olmo et al, 2000; Bergsmedh et al, 2002), тогда как с другой стороны, существуют многочисленные публикации, свидетельствующие о том, что такая интеграция блокируется механизмами контроля клеточного цикла (Bergsmedh et al, 2001; MacDougall et al, 2007). Даже если интеграция и осуществляется при определенных экспериментальных процедурах, то частота таких событий крайне низка - одно событие на 106—10 трансфецированных клеток (стабильные трансформанты образуются с частотой 1 на 104 клеток, получивших ДНК). Хотя при микроинъекции линеаризованной плазмидной ДНК с селективным признаком непосредственно в ядро реципиентной клетки в количестве нескольких копий частота повышается до 1 на 103 клеток, получивших ДНК (Smith, Berg, 1984; Lin et al, 1985; Thomas et al, 1986). Показано, что порядка 30 молекул, содержащих структуры оцДНК/дуплекс соединения, активируют систему контроля клеточного цикла (Lin, Waldman, 2001; MacDougall et al, 2007).
Таким образом, предполагается, что в неповрежденной клетке с не дефектными системами контроля прогрессии клеточного цикла без проведения процедуры трансфекции интеграция экзогенной ДНК происходить не может.
Мы полагаем, что в контексте имеющихся знаний о функционировании клетки, гипотеза Якубова не может быть принята, поскольку концепция постоянно протекающей гомологичной рекомбинации противоречит наличию защитных систем клетки. Тем не менее, эксперименты по горизонтальному переносу генетического признака (Anker et al, 1980; Pulciani et al, 1982; Garcia-Olmo et al, 1999; Holmgren et al, 1999; Garcia-Olmo et al, 2000; Bergsmedh et al, 2002; Хегай и др., 2004) свидетельствуют о принципиальной возможности интеграции экзогенной ДНК в геном реципиентных клеток.
Недавно было обнаружено, что крупные молекулы нуклеиновых кислот проникают не только в ядро, но и в содержащие нуклеиновые кислоты органелльт, а именно митохондрии (Koulintchenko et al, 2003). Установлено, что фрагменты линейной двухцепочечной ДНК размером до нескольких т.п.н. выявляются в митохондриях. При этом информация, содержащаяся в молекулах ДНК, импортированных в органеллу, открыта для ее синтетической машины. В проведенных в работе экспериментах с плазмидной ДНК не обнаружена интеграция экстраклеточного генетического материала в геном митохондрии.
Реорганизация генома стволовых клеток, вступающих на путь дифференцировки
Существует небольшое количество работ, свидетельствующих о том. что при дифференцировке некоторых типов стволовых клеток и незрелых предшественников форменных элементов крови происходит появление функциональных одноцепочечных разрывов, возникновение которых, по-видимому, связано с реорганизацией хроматина и включением группы генов, требующихся для дальнейшего созревания клетки.
В работах (Farzaneh et ai, 1982; Johnstone, Williams, 1982) была показана связь рибозилтрансферазной активности (ADPRT), обнаруживаемой в дифференцирующейся клетке-предшественнице, с появлением функциональных разрывов в хроматине.
Авторы первой работы (Farzaneh et ai, 1982) показали обязательное участие ADPRT в дифференцировке мышечных клеток. Одновременно они показали появление в ходе цитодифференцировки одноцепочечных разрывов в ядерном хроматине. Было оценено время и количество разрывов на ядро. Через 20, 30 часов инкубации после индукции дифференцировки можно было детектировать только единичные разрывы. В точке 42 часа выявлялось 50-100 разрывов, а в точке 56 часов - 100-300 разрывов на геном. Было также показано, что в репарации разрывов, индуцированных у-лучами, и функциональных, индуцированных дифференцировкой миобластов, задействованы различные репаративные механизмы.
В другой работе (Johnstone, Williams, 1982) был проведен аналогичный анализ на культуре периферических лимфоцитов крови. Было установлено, что ADPRT активность является наиболее ранней детектируемой активностью при митоген-индуцированной активации человеческих периферических лимфоцитов крови. Ее появление совпадает с быстрым (1-8 часов) восстановлением одноцепочечных разрывов, присутствующих в незрелых лимфоцитах. В экспериментах по седиментационному анализу показано, что при активации дифференцировки происходит быстрое дотирование одноцепочечных разрывов, что приводит к индукции экспрессии новых генов, ответственных за программированную активацию лимфоцитов. Изменения в профиле седиментации начинаются через 1 час после добавления индуктора в культуру и достигают пика к 8 часам дифференцировки. То есть, через 8 часов индукции периферических лимфоцитов все разрывы ДНК восстановлены, и клетка, по-видимому, претерпела коммитирование.
В цитируемых работах отмечается, что ADPRT участвует в активации ядерных лигаз, которые и ответственны за восстановление разорванных концов хроматина. Однако существуют работы, свидетельствующие о том, что в процессе возникновения и восстановления разрывов может принимать участие другой фермент клеточного метаболизма — ДНК топоизомераза П. Предполагается, что ассоциированная с ядерным матриксом ADPRT участвует в регуляции активности топоизомеразы II (Darby et al, 1985; Заалишвили и др., 2005; Уманская и др., 2005). Наличие разрывов также изучалось на ЭСК. Было показано, что индукция дифференцировки ЭСК ретиноевой кислотой приводит к драматическому увеличению разрывов ДНК в течение первых трех митозов с последующим восстановлением базового уровня (среднее время клеточного цикла для используемых в экспериментах культуры клеток OTF9-63 составляет 12-14 часов и для культуры НМ-1 составляет 24-26 часов) и сохранением его на протяжении 10 и более делений без видимых дефектов в клеточной культуре. Важно отметить, что со временем появления функциональных разрывов в геноме совпадает время I появления максимального количества сестринских хроматидных обменов, что является свидетельством активации рекомбинационной машины в клетке вследствие появления функциональных разрывов ДНК, связанных с программной реорганизацией генов при дифференцировке (Vatolin et al., 1997).
Индукция ДЦР является тем основным терапевтическим подходом, который широко применяется в медицинской и особенно в онкологической практике в качестве фактора, определяющего гибель раковой клетки. Принципы лучевой и химиотерапии основаны на том, что в активно пролиферирующих клетках индуцируется определенное терапевтическое количество ДЦР. Это количество определено таким образом, что максимально гибнут раковые клетки, при этом часть СКК, которые также неминуемо подвергаются такому воздействию, все еще сохраняется. Процесс восстановления форменных элементов крови длительный. При этом часто возникают осложнения, связанные с угнетением иммунной системы организма, в некоторых случаях приводящие к неблагоприятному исходу. Задача восстановления угнетенной кроветворной системы стоит на первом месте в процедурах по реабилитации после лучевой и химиотерапии. Фрагменты экзогенной геномной ДНК могут быть тем терапевтическим субстратом, который поможет клетке, подвергшейся у-облучению или цитостатической обработке, восстановить исходный геномный гомеостаз. В следующем разделе мы даем краткую характеристику системе кроветворения и ее изменениям, связанным с воздействием лучевой и химиотерапии. Также мы даем подробную характеристику репаративным процессам, активирующимся после двух описанных типов воздействия — у-облучения и цитостатической обработки.
К системе кроветворения и иммунной защиты относят красный костный мозг, тимус, селезенку и лимфатические узлы. Основой этой системы является костный мозг, где происходит образование всех форменных элементов крови - эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Система кроветворения находится в постоянном динамическом равновесии с кровью, осуществляя непрерывное обновление и пополнение недостающих клеток.
На начальных этапах развития красный костный мозг накапливает СКК, в постэмбриональный период здесь образуются диффероны гемопоэтических клеток эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоцитарного ряда, а также предшественники Т- и В-лимфоцитов. Краткая схема кроветворения изображена на Рис. 5.
Схемы введения мышам препаратов в экспериментах по радиопротекции
В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что введение мышам экзогенной ДНК в промежуток времени 18-30 часов (каждые 1-2 часа) после введения ЦФ приводит к быстрой гибели мышей в течение недели после инъекции ЦФ (группы 8, 9, 10 и 14). Если вводить ДНК в два разнесенных во времени промежутка, как для групп 4 и 13, также наблюдается гибель мышей, но растянутая во времени - гибель мышей начиналась только с 9 суток после инъекции ЦФ и продолжалась до 45 суток. При введении ДНК в период 0-11 часов после введения ЦФ (группа 5) наблюдалась гибель 25% животных.
Введение ЦФ (200 мг/кг) в виде монопрепарата мышам, а также введение ЦФ в сочетании с ДНК человека в другие временные промежутки (группы 6, 7, 11, 12) не оказывало никакого видимого эффекта на животных. Это предполагает, что наблюдаемый эффект не является случайным и не связан с токсичностью ЦФ, которую он проявляет при метаболизме в организме животного.
При помощи однофакторного дисперсионного анализа с использованием критерия Фишера было показано достоверное отличие с вероятностью 0,999 между следующими группами: 8 и 7, 14 и 12, 13 и 12, 9 и 5, 10 и 5, 1 Зі и 11. С вероятностью 0,99 между группами 4 и 5, 14 и 5. И с вероятностью 0,95 между группами 13 и 5. Между группами 8 и 9, 8 и 10, 13 и 14, 8 и 14. 5 и 7 достоверных отличий нет. Таким образом, можно сказать, что группы мышей, смертность которых лежит выше 60%, достоверно отличаются от тех групп, смертность которых лежит в пределах от 0 до 25%. Между группами мышей, смертность которых лежит внутри этих интервалов, достоверного отличия нет.
Из всех погибших животных по возможности были взяты печень, селезенка и тимус для выделения ДНК и последующего ее анализа. При вскрытии мышей, имевших признаки плохого физического состояния, отмечались дегенеративные изменения тимуса и селезенки. Мы предположили, что обнаруженное совместное действие препарата ДНК человека и цитостатика ЦФ вызывает нарушения, связанные с серьезными генетическими изменениями в клетках опытных животных вследствие стабильного присутствия в них чужеродной генетической информации.
В экспериментах по радиопротекции было показано, что воздействие экзогенной ДНК связано со спасением СКК. Появление селезеночных колоний косвенно свидетельствовало о том, что экзогенная ДНК проникает в СКК. При этом присутствие ДНК сохраняет структурно-функциональную целостность хромосом и, как следствие, жизнеспособность СКК и мышей. Мы предположили, что высокая летальность, выявляемая при совместном воздействии цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК, связана с нарушениями в функционировании СКК. приводящими к их гибели. В связи с этим в следующем разделе мы исследовали поглощение экзогенной ДНК стволовыми клетками.
Была проанализирована способность стволовых клеток человека захватывать экзогенную ДНК различного происхождении. Для анализа такой способности были выбраны ЭСК человека линии hESMOl, стабильно поддерживающаяся, официально охарактеризованная и доступная линия клеток.
Культуру ЭСК человека инкубировали в присутствии меченой ДНК человека с размером фрагментов 200 - 6 000 п.н. от 0 до 12 часов, а также с а Р dATP в течение 12 часов. Как и в случае культуры клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 (Rogachev et at., 2006), ЭСК человека линии hESMOl также захватывали экзогенную ДНК из культуральной среды, окружающей клетки, и фрагменты экзогенной ДНК проникали во внутриклеточное пространство. Были проанализированы 3 клеточных компартмента - цитоплазма, внехромосомная фракция ядра и хроматин (Рис. 15). В культуральной среде экзогенная геномная ДНК подвергается деградации до 200 п.н. и в клетки попадает уже в деградированном состоянии (Рис. 15, цитоплазма и внехромосомная фракция ядра, правые блоки, 1 час). Процесс проникновения экзогенных фрагментов более медленный, чем в случае с клетками адено карциномы молочной железы человека MCF-7, где меченый материал обнаруживается во внехромосомной фракции ядра уже в нулевой момент времени (Rogachev et al, 2006).
Согласно литературным данным (Perucho et al, 1980; Thomas et al, 1986) и нашим исследованиям (Rogachev et al, 2006), фрагменты ДНК, попавшие во внутриядерное пространство, лигируются один с другим, образуя конкатамеры. Вероятно, в данном случае увеличение линейных размеров меченой ДНК (Рис. 15, внехромосомная фракция ядра, правый блок, 2, 6, 12 часов) также объясняется конкатамеризацией. Время сшивки фрагментов экзогенной ДНК в ядерном пространстве и формирования конкатамеров также превосходит таковое, описанного для клеток MCF-7, у которых конкатамеризация наблюдается через 15 мин после добавления меченой ДНК в культуральную среду (Rogachev et al, 2006). Как следует из результатов экспериментов, после часовой экспозиции клеток с субстратом фрагменты ДНК ядерной локализации сохраняют свою нативную подвижность, не образуя конкатомеров. Начиная с точки 2 часа до точки 12 часов, часть фрагментов находится в сшитом состоянии в области 10 т.п.н. Другая часть фрагментов имеет размер порядка 200 п.н., что может свидетельствовать о постоянном притоке экзогенного меченого материала из культуральной среды в ядерное пространство.
Меченый материал, начиная с 1 часа, обнаруживается в цитоплазматической фракции и фракции хроматина (Рис. 15, правые блоки). При этом заметно накопление меченого материала.
Р dATP в качестве мономера не обнаруживается ни в одном из клеточных компартментов, а меченый материал фракционируется в агарозном геле аналогично меченой ДНК клеточных компартментов, что предполагает возможность включения трифосфата в экстраклеточный синтез.
В другом эксперименте мы использовали в качестве субстрата плазмидную ДНК клона Carnegie 20-А1,4(х8), гидролизованную рестриктазой SalGl. Carnegie 20-Х1,4(х8) состоит из вектора Carnegi 20 (10,8 т.п.н.) и восьми копий 1,4 т.п.н. M/SAR фрагмента Drosophila melanogaster (Baricheva et al, 1996; Rogachev et al.
Проникновение экзогенной ДНК в ядерное пространство эмбриональных стволовых клеток человека
Для анализа истиной интеграции (или стабильного транзитного присутствия) ДНК человека в геном экспериментальных животных в качестве поисковой мишени была использована умеренно повторяющаяся последовательность человеческого генома Alu, которая составляет до 10% от гаплоидного генома, что соответствует порядка 106 копий 300 п.н. (Jurka, 2004; Bogerd et al, 2006). Alu-повторы человека распределены в геноме неравномерно, образуя кластеры, и в среднем встречаются через каждые 3-4 т.п.н. В геноме мыши присутствуют умеренные повторы В1, аналогичные человеческим Alu и организованные в геноме сходным образом. Между повторами В1 и Alu существует высокая степень гомологии: консенсусные последовательности этих структур имеют до 65% гомологии, между реальными мономерами эта цифра может достигать 90%. Большинство Alu повторов человека имеют димерную структуру и составляют 290 и.н., тогда как В1 повторы, содержащиеся в мышином геноме, почти всегда мономеры (-130 п.н.) (Колчанов и др., 1988; Britten et al., 1988). При выравнивании последовательностей Alu повтора и димера В1 (Рис. 19) можно увидеть, что на фоне высокой общей гомологии имеются участки, не имеющие между собой сходства.
Для конструирования специфичных для Alu повторов праймеров были использованы именно эти районы таким образом, чтобы 3 конец праймера приходился на участок, не имеющий гомологии в структуре повтора В1. Кроме того, праймеры (Рис. 19) были подобраны так, чтобы в паре один праймер приходился на первую половину Alu, а другой - на вторую, т.е. чтобы ПЦР с указанными праймерами для отдельно взятого мономерного В1 повтора была невозможна.
С помощью программы UCSC In-Silico PCR был проведен анализ возможных продуктов ПЦР в обоих геномах. В результате проведенного поиска мы отобрали те праймеры, которые были не способны к образованию каких-либо возможных продуктов ПЦР с мышиным геномом, при этом с человеческим геномом они давали определенные продукты ПЦР. Оказалось, что реальная картина полученных ПЦР бондов не соответствует картине, предсказанной на основе компьютерного анализа. При всех комбинациях специфических для человека праймеров в ПЦР с мышиным геномом выявлялись четкие бэнды, характерные как для контрольных, так и для экспериментальных мышей. Таким образом, ПЦР анализ ДНК экспериментальных животных с праймерами на Alu, в его классическом виде, не позволил достоверно определить наличие какой-либо человеческой последовательности, интегрированной в мышиный геном.
По-видимому, последовательности выбранных нами праймеров могли взаимодействовать («отжигаться») с гомологичными (полностью или частично) последовательностями, существующими в мышином геноме, которые не были выявлены используемой программой. В условиях стандартной ПЦР они имели количественное конкурентное преимущество по отношению к последовательностям генома человека, имеющим полную гомологию с используемыми праймерами, но находящимся в крайне незначительном количестве. Для повышения специфичности ПЦР в данных экспериментах мы провели ПЦР амплификацию в жестких условиях с использованием единственного праймера (были проанализированы три синтезированных праймера, см. раздел 2.7). Предполагалось, что праймер,. обладающий полной гомологией с определенной человеческой последовательностью спарится именно с этой последовательностью и будет синтезирован продукт, ограниченный с одного края специфическим для человека праймером. Таким образом, материал ПЦР будет обогащен человеческими последовательностями, исходно присутствующими в крайне малых количествах. Во втором раунде ПЦР амплификации уже с двумя праймерами, эти фрагменты не будут подвержены конкурентному вытеснению. Был подобран режим, при котором в первом раунде ПЦР использовался Рг. 11, а во втором - Рг. 9 и Рг. 11. При таком экспериментальном подходе анализ продуктов ПЦР позволил четко выделить фрагменты, по подвижности соответствующие фрагментам, выявляемым в ПЦР при использовании в качестве матрицы ДНК человеческого генома (Рис. 20).
Специфичные фрагменты были выявлены в геномах двух экспериментальных мышей №1 и №8 из первого эксперимента (Рис. 20а, левый блок). Их электрофоретическая подвижность составляла около 300 п.н. (280 и 310 п.н.). Поскольку для синтеза были выбраны праймеры, локализованные в последовательности Alu повтора, то мы полагали, что два мажорных ПЦР фрагмента в образце, содержащем ДНК человека, являются двумя вариантами Alu повтора генома человека.
Обнаружив среди продуктов ПЦР, полученных с тотальної! ДНК экспериментальных мышей, фрагменты, по подвижности совпадающие с мажорными фрагментами, выявляемыми при ПЦР с тотальной ДНК человека, была проведена блот гибридизация с меченым в ПЦР фрагментом 280 п.н. (Рис. 20). Как показала гибридизация с электрофоретически фракционированными продуктами ПЦР всех экспериментальных мышей, только два продукта ПЦР размером 280 и 310 п.н. образцов геномной ДНК экспериментальных животных №1 и №8 гибридизуются с Alu фрагментом. Это означало, что, во-первых, фрагменты 280 и 310 п.н. в высокой степени гомологичны друг другу, и, во-вторых, в геноме двух экспериментальных мышей появилась ДНК человека.
