Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Феномен внеклеточной днк: происхождение, структура и биологическая роль 11
1.1.1. Причины появления вкДНК в кровотоке 11
1.1.2. Структурная организация и размеры молекул вкДНК плазмы крови в норме и при различных заболеваниях 21
1.1.3. Биологическая роль вкДНК в норме и при некоторых заболеваниях 26
1.1.4. Концентрация вкДНК в плазме крови в норме и при различных патологических состояниях 38
1.2. Практическое значение исследования внеклеточной ДНК 40
1.2.1. ВкДНК как диагностический и прогностический критерий 40
1.2.2. Необходимость изучения вкДНК плазмы крови у новорожденных детей 42
1.3. Заключение по обзору литературы 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Оборудование и реактивы 51
2.2. Объект исследования 53
2.3. Определение концентрации вкДНК плазмы крови 56
2.3.1. Получение плазмы крови 56
2.3.2. Выявление неспецифического взаимодействия Hoechst
33342 с белками плазмы крови 56
2.3.3. Депротеинизация и определение концентрации вкДНК в плазме крови 58
2.4. Определение фракционного состава вкДНК 59
2.5. Определение параметров ядер лимфоцитов периферической крови новорожденных детей 59
2.6. Определение содержания гиподиплоидных клеток в популяции лимфоцитов периферической крови 60
2.7. Определение мобильных генетических элементов в составе вкДНК плазмы крови новорожденных детей 61
2.7.1. Выделение вкДНК из плазмы крови на иммобилизованном сорбенте IsoCodeStix 61
2.7.2. Выделение ДНК из клеток крови 61
2.7.3. Постановка ПЦР 62
2.7.4. Детекция продуктов амплификации 63
2.8. Постановка иммуноферментного анализа для определения AT к нативной и денатурированной ДНК 63
2.9. Статистическая обработка результатов 64
ГЛАВА 3. Результаты исследования 65
3.1. Концентрация вкДНК в плазме крови новорожденных детей 65
3.2. Оценка состояния популяции лимфоцитов периферической крови новорожденных 70
3.3. Характеристика вкДНК 86
3.4. Взаимосвязь концентрации вкДНК и уровня содержания AT к ДНК
у новорожденных 93
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 104
Заключение 123
Выводы 126
Список литературы 127
- Структурная организация и размеры молекул вкДНК плазмы крови в норме и при различных заболеваниях
- Необходимость изучения вкДНК плазмы крови у новорожденных детей
- Определение параметров ядер лимфоцитов периферической крови новорожденных детей
- Оценка состояния популяции лимфоцитов периферической крови новорожденных
Введение к работе
Актуальность проблемы
В современной биологической науке важное место отводится изучению молекул, участвующих в межклеточных коммуникациях. Одними из таких молекул может являться внеклеточная ДНК (вкДНК). По некоторым данным, вкДНК может осуществлять передачу генетических функций «по горизонтали» (Adams, 1985; Владимиров, 1998), выполнять метаболическую функцию как предшественник коферментов и кофакторов (Беседнова, 1999), стимулировать иммунный ответ (Pisetsky, 2001; Krieg, 2002) и обеспечивать оптимальные условия гемодинамики (Ганнушкина, 1998). Существуют убедительные доказательства участия вкДНК в патогенезе аутоиммунных заболеваний у взрослых лиц (Wiktorowich, 1987; Lorenz, 2000). Однако данные, представленные в источниках литературы немногочисленны, нуждаются в дополнениях и систематизации.
Ведутся исследования по использованию вкДНК плазмы крови в качестве прогностического и диагностического критерия при онкологических (Anker, 2001; Gonzalez, 2000; Esteller, 2001; Bremnes, 2005), неврологических (Ганнушкина, 1998; Вознюк, 2000; Rainer, 2003; Holdenrieder, 2005), аутоиммунных (Tan, 1996; Herrmann, 1998; Nezlin, 1999) заболеваниях, при выявлении генетически детерминированных патологий плода (Papasavva, 2005) и мониторинге беременности у женщин группы риска по преэклампсии (Zhou, 2005; Farina, 2005). Возможность использования вкДНК в медицине обусловлена изменениями ее концентрации, изменениями в структуре и размерах молекул вкДНК плазмы крови, появлением различных мутаций.
Необходимо отметить, что количественная и качественная характеристики вкДНК остаются практически не изученными у детей. В доступных нам источниках литературы обнаружена одна работа (Wu,
2002), в которой затрагивается вопрос возрастной динамики концентрации вкДНК плазмы крови, и две работы, в которых рассматривается половой диморфизм данного параметра (Wu, 2002; Jung, 2004). Исследований, касающихся вкДНК в плазме крови новорожденных, обнаружить не удалось.
Пренатальный и неонатальный периоды характеризуются высокой скоростью преобразования различных органов и систем. Даже при благоприятных обстоятельствах рождения и периода адаптации организм ребенка испытывает метаболический стресс (Володин, 1999). Несмотря на высокие репаративные возможности организма в раннем постнатальном онтогенезе, многие патологические процессы новорожденных оставляют глубокий след и проявляются в последующие возрастные этапы. Осложнения, возникающие в перинатальном периоде, могут приводить к широкому спектру последствий - от легкой задержки психомоторного развития, до детского церебрального паралича или летального исхода. При этом отмечается, что иногда незначительные на первый взгляд отклонения, как, например, легкая асфиксия или недоношенность, могут сказаться в будущем более серьезными нарушениями, чем более грубые, например, родовая травма (Ратнер, 1995). Это определяет необходимость поиска новых, «скрытых» маркеров повреждения нервной и иммунной систем в раннем неонатальном периоде. Не исключено, что количественные и структурные особенности вкДНК отражают изменения, происходящие в организме новорожденного при патологии раннего неонатального периода.
Таким образом, разносторонняя характеристика вкДНК (ее количество, размер, происхождение) у новорожденных детей в норме и при патологии может иметь как фундаментальное, так и практическое значение для медико-биологической науки, обеспечивая теоретическую и методологическую основу для нового подхода к ранней диагностике нарушений иммунитета.
Цель исследования
Целью настоящей работы явилась характеристика внеклеточной ДНК плазмы крови как участника иммунного ответа у новорожденных детей в раннем неонатальном периоде. Задачи
В соответствии с основной целью исследования были поставлены следующие задачи:
о Провести сравнительный количественный анализ вкДНК плазмы крови у новорожденных детей в норме и при перинатальной патологии. о Исследовать содержание апоптотических и активированных клеток в популяции лимфоцитов периферической крови во взаимосвязи с концентрацией вкДНК, для подтверждения возможности лимфоцитарного происхождения вкДНК. о Охарактеризовать вкДНК плазмы крови новорожденных детей по размеру молекул и по содержанию некоторых мобильных генетических элементов (МГЭ), относящихся к семействам LINE1 и Alu, в норме и при перинатальной патологии. о Определить уровень содержания антител (AT) к нативной и денатурированной ДНК (нДНК и дДНК) у новорожденных детей в норме и при перинатальной патологии и провести корреляционный анализ между концентрацией вкДНК и содержанием AT к н- и дДНК для выявления возможного участия вкДНК в иммунном ответе. Научная новизна
Впервые изучены концентрация вкДНК плазмы крови и содержание AT, реагирующих с нативной и денатурированной ДНК у новорожденных детей.
Выяснено, что перинатальная патология сопровождается нарушением апоптоза лимфоцитов в сторону его усиления. На основании
анализа корреляционной связи между содержанием апоптотических / активированных лимфоцитов и концентрацией вкДНК установлено, что вкДНК плазмы крови новорожденных детей может происходить как из апоптотических, так и из активированных клеток, циркулирующих непосредственно в периферической крови.
Показано, что в случаях патологии вкДНК представлена, в основном, фрагментами низкой молекулярной массы, содержит LINE-элементы и инвертированные Alu-повторы.
Обнаружена взаимосвязь концентрации вкДНК и содержания AT к обоим типам ДНК при некоторых заболеваниях в неонатальном периоде. Выявленная взаимосвязь носит разнонаправленный характер в зависимости от типа патологии и гестационного возраста ребенка, что может иметь существенное значение для ранней, доклинической диагностики и прогноза нарушений иммунитета в раннем неонатальном периоде и последующих возрастных этапах. В случае положительной связи предполагается наличие аутоиммунного ответа на вкДНК уже в раннем неонатальном периоде.
Научно-практическая значимость работы
Разработана теоретическая и методологическая база для нового подхода в доклинической диагностике патологии иммунной системы на основе анализа нарушения апоптоза иммунокомпетентных клеток у новорожденных детей. Результаты работы в дальнейшем могут быть использованы в медицине (иммунологии и педиатрии) для оценки состояния новорожденных и прогнозирования развития иммунологических осложнений.
Связь работы с научными программами и собственный вклад
автора в исследование
Работа в течение 2001 - 2005 гг. выполнялась в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ гос. регистрации 01.200300073), с 2006 по 2010 гг. проводится в соответствии с
планом НИР № 01.200609657. Исследования поддержаны грантом НИОКР АН РТ (03-3.3-76/2006Г). Научные положения диссертации и выводы базируются на собственных результатах исследований автора. Изучение состояния популяции лимфоцитов выполнялось на базе каф. детских болезней КГМУ, совместно с иммунологической лабораторией РЦПБ СПИД.
Положения, выносимые на защиту
Концентрация вкДНК у недоношенных новорожденных детей и у новорожденных с перинатальной патологией повышена по сравнению с данным показателем в контрольной группе.
ВкДНК плазмы крови происходит в результате процессов активации и апоптоза лимфоцитов.
ВкДНК плазмы крови новорожденных детей в норме представлена высокомолекулярными фрагментами ДНК, а при патологии - фрагментами деградированной ДНК. В составе последовательностей вкДНК содержатся МГЭ, относящиеся к семействам LINE и Alu, соотношение которых различно в норме и при патологии.
Между концентрацией вкДНК и уровнем содержания AT к ДНК существует взаимозависимость, свидетельствующая о возможности влияния вкДНК на уровень содержания AT.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на ежегодных научно-практических конференциях Казанского государственного университета (2004 - 2006 гг.), на ежегодной региональной конференции «Педиатрия и детская хирургия в приволжском федеральном округе» (Казань, 22 - 23 ноября 2005 и 2006 г.г.); на Научно-практической конференции молодых ученых (КГМА, Казань, 2006); на международном конгрессе "Иммунитет и болезни: от теории к терапии" (Москва, 3-8 октября 2005); на международных конференциях: «Дни науки 2005»
(Днепропетровск, 2005), «Circulating Nucleic Acids in Plasma or Serum - IV» (London, UK, 2005) и «BioScience 2006 - bioscience for the 21st century», (23 - 27 July, Glasgow, UK, 2006).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 работы в центральных изданиях.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включает J_9 рисунков и ИЗ таблиц; состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы, включающего 235 ссылок, из которых 91 - на отечественные, J_44 - на зарубежные работы.
Благодарности за помощь в работе
Данная работа посвящается научному руководителю, доктору биологических наук, профессору В.Г. Винтеру. Автор выражает искреннюю благодарность за всестороннюю помощь в работе научному руководителю д.б.н. Абрамовой З.И., зав. кафедрой биохимии, проф. Ишмухаметовой Д.Г., инженеру каф. биохимии Гаврилову B.C., зав. кафедрой детских болезней КГМУ, проф. Софронову В.В., зав. каф. биохимии КГМУ, д.м.н. Мустафину И.Г., зав. отделением патологии новорожденных городской клинической больницы № 4 Емикеевой В.А., а так же всему коллективу кафедры биохимии Казанского государственного университета и коллективу лаборатории КЛД Федерального научно -клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии г. Москвы и лично д.м.н., проф. Белохвостову А.С. за помощь в освоении методов ПНР и в организации ПЦР-лаборатории.
Структурная организация и размеры молекул вкДНК плазмы крови в норме и при различных заболеваниях
Активная экскреция экстрахромосомной ДНК лимфоцитами. Происхождение вкДНК является одним из важнейших аспектов в изучении внеклеточных нуклеиновых кислот, так как непосредственно определяет их структуру, а следовательно, и биологические эффекты. Происхождение вкДНК в кровотоке человека на сегодняшний день до конца не выяснено. По данным литературы, в организме существует несколько процессов, способных приводить к появлению вкДНК в плазме крови. Один из них - активный процесс экскреции внехромосомных ДНК лимфоцитами. Гипотеза активной экскреции основана на ряде экспериментальных материалов, полученных при работе с лимфоцитами и фибробластами in vitro, и предполагает наличие механизмов синтеза внехромосомной ДНК в ядрах клеток и активной экскреции ее во внеклеточную среду. Одними из первых, кто описал выход ДНК из лимфоцитов, была группа под руководством Rogers (Rogers et al., 1972). Установлено, что подавляющее большинство (99,9%) лимфоцитов, циркулирующих в периферической крови у человека и животных, находятся в состоянии интерфазы и характеризуются очень низким уровнем «спонтанного» синтеза ДНК. Авторы культивировали лимфоциты на среде, содержащей [Н ]-тимидин, в присутствии таких митогенов, как фитогемагглютинин (ФГА) или конканавалин А (кон-А), а так же в присутствии антигенов эпидемического паротита. На третьи сутки инкубации 70 - 90 % клеток претерпевали бласт-трансформацию и синтезировали ДНК, включая в ее состав [Н ]-тимидин. Когда лимфоциты тщательно отмыли от несвязавшегося тимидина и вновь прокультивировали на свежей среде в течение 3-х дней, оказалось, что клетки потеряли от 35 до 90% вновь синтезированной [Н ]-ДНК. Одновременно в культуральной среде появлялась меченая [Н ]-ДНК, количество которой постепенно нарастало. Тогда как 80 - 95 % клеток оставалось жизнеспособными, количество внеклеточной [Н3]-ДНК в случае с кон-А и антигеном паротита превышало уровень, который мог бы образоваться при гибели всех клеток культуры. Экскретируемая ДНК при этом находилась в комплексе с белками и липидами. Аналогичный процесс происходил и без стимуляции, но количество ДНК как в культуральной среде, так и в самих лимфоцитах было в 4 - 6 раз меньшим.
Работавшая независимо группа Anker et al. (1975) почти одновременно доказала возможность выхода ДНК из лимфоцитов без стимулирующих агентов и показала, что концентрация экскретированной во внешнюю среду ДНК, по-видимому, является постоянной величиной. Эксперимент проходил по следующей схеме: после культивирования лимфоциты отделяли от среды инкубации и отмывали, а в среде определяли количество выделившейся ДНК. Если затем отмытые лимфоциты повторно помещали в ту же среду, больше ДНК не выделялось. Но если эти же лимфоциты помещали в свежую инкубационную среду, экскреция ДНК возобновлялась. Результаты двух восьмичасовых экспериментов показали, что при непрерывном культивировании в течение всего срока, количество экскретируемой ДНК достигало 22 мкг в 200 мл среды. Если то же самое количество клеток инкубировалось с заменой инкубационной среды через каждые 2 часа, то суммарное количество ДНК, выделенное за те же 8 часов, составляло 87 мкг (в суммарных 800 мл среды). То есть, в последнем случае имела место более интенсивная экскреция ДНК. Молекулярная масса экскретируемой ДНК находилась в пределах 3,5х105- 3,7х106 Да. Таким образом, данный эксперимент также свидетельствует в пользу гипотезы об активном процессе образования вкДНК.
В 1990 году Н.А. Федоров и И.С. Янева подтвердили возможность синтеза и экскреции ДНК лимфоцитами без фитомитогенов, отметив при этом незначительную интенсивность данных процессов (Янева, 1990).
Хаитов с соавторами, анализируя динамику накопления ДНК в лимфоцитах больных с некоторыми заболеваниями респираторного тракта, установили, что при повышении концентрации ДНК в ядрах лимфоцитов, содержание сывороточной вкДНК тоже значительно увеличивается. Это позволило сделать вывод, что динамика содержания ДНК в сыворотке крови тесно связана с интенсивностью синтеза нуклеиновых кислот в лимфоцитах (Хаитов, 1996).
Имеются данные, доказывающие, что не только активированные лимфоциты, но и фибробласты способны экскретировать ДНК (Adams, 1985).
Пытаясь ответить на вопрос, что является клеточным предшественником вкДНК, группа Rogers (Rogers et al., 1976) выделяли ДНК из лимфоцитов, активированных ФГА. Выделенная ДНК была представлена высокомолекулярной хромосомной и экстрахромосомной фракциями. С помощью [3Н]-тимидина продемонстрировано, что вновь синтезированная ДНК медленно перемещается из хромосомной фракции в экстрахромосомную, а затем выделяется в культуральную среду. Работы, выполненные Rogers et al. позволяют считать экстрахромосомную ДНК непосредственным предшественником внеклеточной ДНК.
Необходимо отметить, что экстрахромосомные ДНК представлены в клетках двумя классами - к первому относят митохондриальную ДНК, второй класс включает в себя кольцевые ДНК, гетерогенные по размеру, числу молекул на клетку и по составу входящих в них нуклеотидных последовательностей. ДНК этого класса подразделяются по размеру на большие кольцевые ДНК, называемые эписомами (100 - 900 т.п.н.), и малые гетерогенные кольцевые ДНК (мгкДНК) (Сальников, 1990, Белохвостов, 1997). Размеры мгкДНК варьируют от 150 п.н. до 20 т.п.н. и в клетке составляют от 0,030 до 0,001% от количества хромосомной ДНК. Так как основным методом препаративного получения мгкДНК является выделение по Хирту (Hirt, 1967), то эта фракция получила название «фракции Хирта». Эписомы, содержащие амплифицированные копии генов - феномен чрезвычайно редкий даже в трансформированных клетках с присущей им нестабильностью генома. Они практически никогда не выявляются в нормальных клетках и не появляются во внеклеточном пространстве (Сухова, 1996). Напротив, фракция Хирта по своему составу аналогична внеклеточной ДНК, и может являться предшественником ДНК, экскретируемой клетками (Владимиров, 1998). По этой причине, в последующем, говоря об экстрахромосомной ДНК как о предшественнике вкДНК, будет подразумеваться именно фракция Хирта.
Необходимость изучения вкДНК плазмы крови у новорожденных детей
Интерес к вкДНК в плазме крови новорожденных детей связан, прежде всего, с возможностью влияния вкДНК на иммунную систему. Не исключено, что различные проявления иммунной патологии более поздних возрастных этапов восходят истоками в пре- и неонатальный периоды. Внеклеточные НК могут явиться одним из этиологических факторов, обуславливающих развитие аутоиммунных состояний, вплоть до аутоиммунной патологии, или срыв иммунологической адаптации, выражающийся впоследствии высокой частотой инфекционных заболеваний.
Особенности развития иммунитета и аутоиммунитета в неонатальном периоде. До настоящего времени в литературе ведутся дискуссии по поводу возможности иммунных и аутоиммунных реакций у новорожденных детей. Считается, что большинство иммуноглобулинов класса G ребенок получает трансплацентарно от матери. Однако способность к продукции AT собственными клетками В-системы подтверждена у плода, начиная уже с 11 - 12 недели гестации. Наиболее рано организм плода приобретает способность образовывать IgM (с 3-го месяца), несколько позже IgG (с 5-го месяца) и IgA (с 7-го месяца гестации). Собственная продукция IgE выявляется у плода с 11-ой недели гестации - в селезенке. В пуповинной крови обнаруживается много лимфоцитов, несущих IgE, однако сам его уровень очень низок. До 37-ой недели гестационного возраста он составляет не более 0,5 МЕ/мл. В возрасте 38 недель IgE определяется у 20% новорожденных, а после 40-ой недели - у 34% (Мазурин, 2001). Сроки синтеза IgD во внутриутробном периоде недостаточно изучены.
В экспериментах с новорожденными мышами была показана способность иммунной системы отвечать на введение чужеродных АГ в неонатальном периоде (Pertmer, 1999). Иммунный ответ на введение плазмидной ДНК pjW4303/Hl, выражавшийся в выработке IgG, у новорожденных мышей практически не отличался от той же реакции у взрослых.
Выработка антител к липиду А у новорожденных детей с дисбактериозом кишечника документирована в работе Ю.С. Акоева и Т.Б. Сенцовой(2001). Что касается аутоиммунитета, то у человека за выработку ААТ отвечает особая субпопуляция В1-лимфоцитов, отличающаяся эксперссией специфического поверхностного маркера Т-лимфоцитов, получившего название CD5+ (Сидорова, 1993). Эти клетки обнаруживаются в селезенке плода уже на 19 - 22 неделе гестации, где их количество составляет 40 - 60 % от всех В-клеток. С05ч-В-лимфоциты несут поверхностные маркеры главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), а так же поверхностные IgM и IgG. С возрастом количество С05+-В-клеток снижается, и у взрослых людей они составляют 10 - 20% всех В-клеток (Сидорова, 1993).
Важная роль аутоиммунных процессов в формировании мозга ребенка обсуждается при перинатальной патологии ЦНС (ПП ЦНС). Выявлено участие аутоиммунных реакций в патогенезе развития мозга. Если ребенок имел пренатальную патологию, перенес хроническую внутриутробную гипоксию или острую асфиксию в родах, то при среднетяжелых и тяжелых формах ПП ЦНС в кровь поступают собственные, эндогенные АГ забарьерных органов головного мозга. Это приводит к развитию аутоиммунных реакций (Голубкова, 1999; Клюшник, 2000; Аутеншлюс, 2002). Показано, что ААТ вырабатываются в ответ на появление в крови мозгоспецифического белка (Аутеншлюс, 2002), основного белка миелина (Черешнев, 2003) и фактора роста нервов (ФРН) - белка мозговой ткани, осуществляющего нейротрофические функции (Клюшник, 1999; Клюшник, 2002; Щербакова, 2003). Наличие ААТ к таким АГ свидетельствует о вовлеченности иммунной системы в различные формы патологии, в том числе обусловленные нарушениями онтогенеза ЦНС. Судя по данным А.И. Аутеншлюс, высокий уровень ААТ к мозгоспецифическому белку, выявляемый у детей на первом месяце жизни, является благоприятным прогностическим признаком. Положительный исход в данном случае обусловлен, скорее всего, протективным действием AT. Похожие данные получены В.А.Черешневым при исследовании уровня ААТ к основному белку миелина. Это позволяет предположить, что ААТ при ПП ЦНС не только вырабатываются, но и являются регуляторами гомеостаза на молекулярном уровне.
Аутоиммунные реакции присутствуют в развитии перивентрикулярной лейкомаляции (Таболин, 1997). Предполагается, что эти же процессы играют определенную роль и в патогенезе детского церебрального паралича, т.к. в крови больных ДЦП выявлен волчаночный антикоагулянт (Nelson, 1998).
Возможная роль вкДНК в организме новорожденных. На возможность выработки ААТ к ДНК у новорожденных детей указывают как минимум два фактора. Это, во-первых, гораздо большая, нежели у взрослых лиц, численность популяции С05+-В-клеток, ответственных за выработку ААТ. Во-вторых, механизмы проявления биологической активности ААТ к ДНК демонстрируют возможность их участия в регуляции физиологических процессов (Ашмарин, 1989; Yanase, 1994; Reichlin, 1995; Ишмухаметова, 2003), интенсивность которых наиболее высока в период активного роста и развития всех жизненно важных систем. Экспериментальных данных, подтверждающих такое влияние, пока не получено, однако нельзя оставить без внимания тот факт, что содержание ААТ к ДНК в крови у детей в два раза выше, чем у лиц юношеского и молодого возраста (Kasianov, 1984). Итак, можно предположить, что одним из последствий повышения концентрации вкДНК в неонатальном периоде могут быть аутоиммунные расстройства. Однако возможен и другой процесс.
Определение параметров ядер лимфоцитов периферической крови новорожденных детей
Кровь в объеме 1 мл брали с помощью катетера, самотеком из локтевой вены в вакуумные пробирки с напыленной ЭДТА- Na2 в качестве антикоагулянта или в пробирку типа Eppendorf с 1% ЭДТА-Ыа2 (рН 7,4) в соотношении 9:1. В случае взятия крови из пуповины, отбирали 10 - 15 мл крови, соблюдая пропорции с антикоагулянтом. У матерей кровь брали из локтевой вены самотеком в объеме 5-10 мл.
Кровь центрифугировали при 4С (К24) последовательно при 1,5 тыс. об/мин для осаждения эритроцитов (10 минут), затем при 3 тыс. об/мин (15 минут) для осаждения мононуклеарных клеток и при 5 тыс. об/мин (15 минут) для полного осаждения единичных оставшихся клеток и дебриса. Плазму крови делили на аликвоты по 200 мкл для определения концентрации ДНК, по 20 мкл - для определения уровня AT к ДНК, по 50 -500 мкл - для ПЦР. Образцы плазмы крови замораживали при -20 С и хранили, не допуская вторичного размораживания.
Осадок после второго центрифугирования, содержащий мононуклеарные клетки, собирали отдельно и хранили при -20С для выделения из клеток крови ДНК.
По данным разных авторов, содержание вкДНК в плазме крови варьирует от десятых долей нанограмма до десятков микрограмм на миллилитр (Табл. 2), в связи с чем представляется важным выбор адекватного метода ее определения. Одним из наиболее простых и часто используемых методов является флуоресцентная спектрофотометрия с использованием интеркалирующих флуоресцентных зондов, например таких как бромистый этидий или Hoechst (De Barro, 1995). При этом подчеркивается специфичность взаимодействия флуорохромов с ДНК и возможность использовать для анализа образцов цельной сыворотки или плазмы крови (De Barro, 1995). Однако существуют работы, свидетельствующие о возможности завышения результатов, полученных данным методом (Steinmann, 1975).
Для проверки специфичности флуоресцентного красителя Hoechst 33342 был проведен эксперимент с белками сыворотки крови, такими как альбумин и иммуноглобулин (коммерческий препарат). Концентрация данных белков в сыворотке крови в норме составляет 33 - 55 г/л и 6 - 13 г/л, соответственно (Камышников, 2005). Для проведения анализа по определению ДНК в сыворотке крови образец разводят буфером в 100 -200 раз. Поэтому исследуемые белки брали в физиологических концентрациях и разводили аналогично образцу плазмы крови (в 200 раз).
Как показали результаты (табл. 6), присутствие двух указанных белков вносит существенный вклад в интенсивность флуоресценции образца плазмы крови, даже без учета флуоресценции фибриллярных белков, неспецифическое связывание с которыми может быть еще выше. Следовательно, для данного метода необходима предварительная очистка (депротеинизация) плазмы крови.
К плазме крови (200 мкл) добавляли 50 мкл TNE-буфера (ЮмМ трис, рН7,4 / 1мМ ЭДТА / 0,Ш NaCl) и 50 мкл протеиназы К (250 мкг/мл) в рабочем буфере (50 мМ трис, 2 рН 8,0 /5мМ ЭДТА/ 2,5% SDS). Инкубировали при 56С в течение 2 часов. Белок осаждали фенолом, поэтапно уравновешенным в трех буферных растворах (I: ЮмМ NaCl/ 10 мМ ЭДТА/ 500 мМ трис-НС1; II: ЮмМ NaCl/ 10 мМ ЭДТА/ 100 мМ трис-НС1; III: ЮмМ NaCl/ 10 мМ ЭДТА/ 50 мМ трис-HCl, рН 8,0), смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 1:1. При отработке метода образцы плазмы крови подвергали дополнительной предварительной обработке ДНКазой и РНКазой в рабочих концентрациях 100 и 50 мкг/мл, соответственно (Маниатис, 1984; Steinman, 1975). Водную фазу доводили до 400 мкл TNE и измеряли уровень собственной флуоресценции образца. Затем добавляли Hoechst 33342 до конечной концентрации 0,24 мкг/мл, оставляли на 3 - 5 минут при комнатной температуре и измеряли интенсивность флуоресценции образовавшегося комплекса ДНК-Hoechst на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi MPF-4 при длине волны испускания - 335 и эмиссии - 450 нм. Концентрацию ДНК определяли по калибровочной кривой изменения флуоресценции в серии двукратных разведений стандартного образца (ДНК эритроцитов цыплят) в TNE-буфере (диапазон разведений от 7,8 до 125 нг/мл).
При отработке методики каждый образец депротеинизировали и измеряли в 2 - 3 повторностях. Для исключения влияния следов органических растворителей на уровень флуоресценции, во время первого эксперимента была поставлена «холостая» проба (не содержащая плазмы крови), с которой провели те же манипуляции и затем измерили уровень флуоресценции в присутствии Hoechst 33342. При этом в «холостой» пробе флуоресценции не наблюдалось.
Суммарный пул плазмы крови новорожденных детей (10 мл) депротеинизировали (как в п. 2.2.3). Экстрагировали ДНК из водной фазы добавлением 2,5 объемов свежеперегнанного охлажденного (-20 С) этанола и оставляли на 18 часов при температуре -20 С. Осаждали ДНК центрифугированием в угловом роторе при 15 тыс. об/мин. (К24) или в бакет-роторе при 6 тыс. об/ мин.
Фракционный состав внеклеточной ДНК определяли методом электрофореза в 0,7% агарозном геле. Электрофорез проводили при силе тока 5 мА на 1 см геля в течение 1-1,5 часов в присутствии бромистого этидия (0,5 мкг/мл). В качестве молекулярного маркера длины фрагментов ДНК использовали ДНК фага X, фрагментированную рестриктазами Hind 111 и EcoRI.
Оценка состояния популяции лимфоцитов периферической крови новорожденных
По данным литературы, гестационный возраст и масса тела при рождении являются решающими факторами, определяющими формирование здоровья в неонатальном периоде. В работе Lown et al. (Lown, 2005) приводятся данные статистики, подтверждающие роль недоношенности в неонатальнои смертности. В свою очередь сама недоношенность зачастую определяется неблагоприятными воздействиями во внутриутробном периоде, такими, как гипоксия или внутриутробная инфекция. Патология беременности, оказывая неблагоприятное воздействие на тканевые структуры плода, обуславливает быструю истощаемость и неадекватность реакции адаптации в неонатальном периоде. Это ведет к отставанию в показателях физического развития, замедлению темпов психомоторного развития, соматическим и неврологическим расстройствам и, в конечном итоге, к заболеваемости у новорожденных и грудных детей с развитием высокого риска инвалидизации этих детей в последующие годы жизни (Вгаг, 1988; Taberg, 1988; McCornic, 1992). В связи с этим актуально определить наиболее раннее звено в цепи патологических событий, приводящих к серьезным осложнениям течения неонатального периода, которое могло бы явиться доманифестным критерием состояния здоровья новорожденного ребенка. По нашему мнению, таким фактором может служить внеклеточная ДНК.
Несмотря на то, что исследования вкДНК в организме человека продолжаются уже более 50-ти лет, информация о ее количестве и роли в неонатальном периоде отсутствует. Поэтому в настоящей работе мы оценивали концентрацию вкДНК у новорожденных различного гестационного возраста при перинатальной патологии.
Понятие «перинатальная патология» объединяет группу различных заболеваний, возникающих в пре-, интранатальном и раннем неонатальном периодах. В данной работе это были заболевания: ПП ЦНС гипоксического генеза, ВУИ, РДС (в форме пневмопатии) и ЗВУР, тяжесть которых соответствовала II - III степени.
Достоверный подъем концентрации вкДНК при всех указанных заболеваниях (по сравнению с контрольной группой) указывает на вклад патологического процесса в динамику нарастания концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот, циркулирующих в плазме крови. Однако выраженный пик показателей концентрации вкДНК в гестационный период 32 - 34 недели и относительно более низкие показатели при гестационном возрасте 29-31 неделя, свидетельствуют о важной роли возрастной патологии в формировании пула вкДНК плазмы крови.
Поэтому следует обратить особое внимание на соотношение показателей концентрации вкДНК в плазме доноров без тяжелых осложнений и при патологии. Это соотношение, определенное для каждой гестационной группы и выраженное через коэффициент (k = [вкДНК]б/тЯж.ослож. / [вкДНК]11ри Ііериііат. пат.) составило: 0,42 - для доношенных новорожденных; 0,80 - для недоношенных детей 35 - 37 недель гестации; 0,91 - для недоношенных детей 32 - 34 недель гестации; 1,07 - для недоношенных новорожденных 29-31 недели гестации. Увеличение к со снижением гестационного возраста указывает на снижение вклада перинатальной патологии в динамику концентрации вкДНК у недоношенных детей и на более существенное влияние гестационного возраста на уровень концентрации вкДНК в плазме. Этот факт может свидетельствовать о связи повышения концентрации вкДНК в плазме с физиологическими процессами, которые происходят при развитии плода определенного гестационного возраста.
По результатам исследования можно особо выделить группу новорожденных, появившихся на свет на 32 - 34 неделе гестации (II степень недоношенности), что соответствует восьмому месяцу внутриутробного развития. Даже при отсутствии клинически выраженной патологии концентрация вкДНК в этом возрасте была максимальной.
В работе Е.А. Зубаревой показано, что именно в этом возрасте частота возникновения перивентрикулярных кровоизлияний (одного из видов мозгового кровоизлияния) является максимальной и превышает даже аналогичный показатель у новорожденных 29-31 недель гестации (Зубарева, 2006). Однако автор этот факт не объясняет. Работа В.В. Софронова свидетельствует о напряженности морфофункциональных процессов, происходящих в клеточных структурах новорожденных указанного гестационного возраста, которая проявляется в виде повышенного содержания ДНК в лимфоцитах (Софронов, 1999). В этом возрасте обнаружена наибольшая концентрация в крови новорожденных такого микроэлемента, как хром (Софронов, 1999). Не исключено что на данном этапе развития, клеткам ЦНС, претерпевающим фундаментальные изменения (Боголепова, 1997), необходима особенная защита, так как показано, что хром эффективно защищает нуклеиновые кислоты от денатурации (Okada, 1983), повышая секрецию гормонов и изменяя инсулин-зависимый обмен белков, жиров и углеводов (Mills, 1972).
Относительно невысокие концентрации вкДНК у недоношенных детей 29-31 недели гестации могут быть обусловлены менее продолжительным воздействием неблагоприятных факторов во внутриутробном периоде (Софронов, 1999; Старцева, 2006).
Пока не выяснено, какую функцию выполняет вкДНК в организме относительно здорового новорожденного ребенка, содержащаяся в плазме крови в количестве 22,5 нг в 1 мл. Опираясь на данные литературы, можно предположить, что эта ДНК участвует в межклеточных коммуникациях, тогда одной из основных задач будущих исследований должен быть поиск потенциальных клеток-мишеней для внеклеточных нуклеиновых кислот. Вероятно, существует «обмен» молекулами вкДНК между плодом и матерью во время беременности, так как концентрации вкДНК у матери и ребенка в раннем неонатальном периоде оказались взаимосвязанными.
«Волнообразное» повышенные концентрации вкДНК на разных сроках гестационного развития может отражать наличие критических периодов в становлении основных систем (нервной и иммунной). Не исключена и роль процесса программируемой клеточной гибели, связанной с элиминацией аутореактивных клеток, что и определило необходимость оценить состояние одного из важнейших звеньев иммунной системы - лимфоцитов.
