Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Хроматин 10
1.1. Структура и модификации гистонов 10
1.2. Классификации хроматина 11
Глава 2. Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина 13
2.1. Комплексы ремоделирования хроматина 13
2.1.1. Семейство SWI/SNF 14
2.1.2. Семейство ISWI 17
2.1.3. Семейство CHD 20
2.1.4. Семейство INO80 22
2.2. Комплексы, осуществляющие ковалентные модификации гистонов 23
2.2.1. Основные пострансляционные модификации хроматина 23
2.2.2. Гистонацетилтрансферазы (ГАТ) 26
2.2.3. Гистондеацетилазы (ГДА) 30
Глава 3. Координация процессов репликации и транскрипции хроматина 32
Глава 4. Регуляторные элементы генома 35
4.1. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы 35
4.2. Инсуляторы
4.2.1. Доменная организация генома 37
4.2.2. Энхансер-блокирующие инсуляторы
4.2.2.1. Примеры энхансер-блокирующих инсуляторов 39
4.2.2.2. Модели функционирования энхансер-блокирующих инсуляторов 41
4.2.2.3. Роль инсуляторов в организации пространственной структуры ядра 43
4.2.2.4. Инсуляторы и эпигенетическое наследование признаков 43
4.2.2.5. Инсуляторы и импринтинг генетической информации 44
4.2.3 Барьерные инсуляторы 45
4.2.3.1. Примеры барьерных инсуляторов 45
4.2.3.2. Модели функционирования барьерных инсуляторов
Материалы и методы 47
1. Материалы 47
1.1. Штаммы и векторы Е. coli, использованные в работе 47
1.2. Среды для культивирования E.coli, среда для культивирования S2 клеток 47
1.3. Ферменты и реактивы 47
1.4. Буферные растворы 47
1.5. Клеточные линии 48
1.6. Линии мух D. melanogaster 48
1.7. Антитела з
1.8.Праймеры 48
1.9. Использованное программное обеспечение 50
2. Методы 51
2.1. Работа с E.coli. Клонирование плазмидных конструкций 51
2.2. Трансфекция эукариотических клеток 52
2.3. ПЦР; ПЦР в реальном времени (RT-PCR) 52
2.4. Выделение тотальной РНК из S2 клеток 52
2.5. Выделение геномной ДНК из S2 клеток 52
2.6. Получение кДНК 52
2.7. Получение двухцепочечной РНК 53
2.8. РНК-интерференция 53
2.9. Белковый гель-электрофорез 2.10. Western-блот анализ 53
2.11. Иммунопреципитация (осаждение белков антителами) 54
2.12. Иммунопреципитация хроматина (СЫР) 54
Результаты 57
1. Su(Hw) привлекает комплекс SAGA на сайты связывания Su(Hw) 57
2. Su(Hw) привлекает комплекс dSWI/SNF на сайты связывания Su(Hw) 62
3. Su(Hw) необходим для формирования областей с низкой плотностью нуклеосом 65
4. Комплекс узнавания ориджинов репликации (ORC) привлекается на сайты связывания Su(Hw) 66
5. Cdc45 привлекается на пре-репликативный комплекс на сайтах связывания Su(Hw) 70
6. $и{Нуі)-связьівающие сайты составляют значительную часть сайтов ORC в "синем" и "черном" типах хроматина 71
7. Рекрутирование комплексов SAGA, ВАР и ORC на сайты связывания Su(Hw) не зависит от типа окружающего хроматина 72
8. Искусственное привлечение Su(Hw) является достаточным для последующего рекрутирования комплексов SAGA, ВАР и ORC 75
9. Сайт связывания Su(Hw) определяет привлечение комплексов SAGA, ВАР и ORC 76
10. Su(Hw), CTCF, GAFuBEAF32 обладают сходными свойствами ремоделирования
хроматина и рекрутирования ORC 77
Обсуждение 79
Выводы 82
Список литературы
- Классификации хроматина
- Основные пострансляционные модификации хроматина
- Модели функционирования энхансер-блокирующих инсуляторов
- Рекрутирование комплексов SAGA, ВАР и ORC на сайты связывания Su(Hw) не зависит от типа окружающего хроматина
Классификации хроматина
В первой половине XX века было обнаружено, что при окраске ядер красителями, специфически связывающимися с ДНК, можно наблюдать области с более плотной упаковкой ДНК (гетерохроматин) и области, где локальная концентрация ДНК значительно ниже (эухроматин). Было выдвинуто предположение, что транскрипционно-активная ДНК упакована менее компактно. Первые подтверждения этому получены при обработке хроматина ДНКазой I: активные гены оказались более подвержены расщеплению по сравнению с менее активными (Kuo et al, 1982; Babiss et al, 1986). Показано, что в активном хроматине часто отсутствует Н2А-Н2В димер, уровень гистона HI понижен, содержание же различных типов HMG-белков (негистоновые белки, связывающие нуклеосомы и приводящие к их декомпактизации) повышено по сравнению неактивным хроматином. Было установлено, что в составе активного хроматина имеется ряд модифицированных по N-концевым доменам гистонов, таких как ацетилированый по позиции К9 гистон НЗ (НЗК9Ас), гистон Н4, ацетилированный по позиции К16 (НЗКІбАс), ди- и триметилированый по позициям К4, К36 и К79 гистон НЗ (НЗК4те2/3, НЗК36те2/3, НЗК79те2/3, соответственно). В структуре активного хроматина также присутствуют вариантные формы гистонов НЗ.З и H2A.Bbd. Ацетилирование остатков лизина N-концевого домена гистонов считается одной из важнейших модификаций, связанных с транскрипционно-активным хроматином. Предложено несколько механизмов, связывающих активацию транскрипции и ацетилирование хроматина (Eberharter et al, 2002). Ацетилирование гистонов может ослаблять взаимодействие нуклеосом с ДНК, а также ацетилированные хвосты гистонов могут привлекать дополнительные факторы активации транскрипции. Для неактивного хроматина наиболее характерными вторичными модификациями считаются НЗК9те и НЗК27те, в сочетании с отсутствием ацетилирования гистонов, присутствие белка НР1, узнающего метилированный остаток НЗК9те и участвующего в образовании компактных хроматиновых структур. Был предложен механизм инициации и поддержания структуры гетерохроматина. Первичными сигналом, запускающим формирование гетерохроматина, является НЗК9те, которое в дальнейшем приводит к привлечению НР1 и гистон 12 метилтрансфераз (НМТ). Результатом данного процесса является формирование плотной структуры хроматина. Метилирование НЗК9 может происходить при связывании малых РНК молекул с повторяющимися последовательностями (Volpe et al., 2002), либо за счет специфических ДНК-связывающих белков, привлекающих НМТ.
В недавних исследованиях весь хроматин генома дрозофилы был разделен на пять типов: "черный", "синий", "зеленый", "красный" и "желтый" (Filion et al, 2010). Основой такого типа классификации является разделение хроматина по различным комбинациям ассоциированных с хроматином белков и ковалентных модификаций гистонов. Было показано, что расположение большинства белков не ограничивается одним типом хроматина, однако каждый из пяти типов характеризуется уникальной комбинацией. "Черный" хроматин покрывает около 48% генома дрозофилы; длина доменов данного типа хроматина достигает 100 т. п. о.. "Черный" хроматин беден генами и демонстрирует низкую транскрипционную активность; характерными маркерами данного типа хроматина являются гистон HI, белки Dl, IAL и SUUR. "Синий" хроматин характеризует связывание белков группы Polycomb и наличие модификации гистона НЗК27теЗ. "Зеленый" хроматин представляет собой классический гетерохроматин, маркируемый метилтрансферазой SU(VAR)3-9, модификацией гистона H3K9me2, НР1 и НР1-взаимодействующими белками; преимущественно он обнаруживается в перицентромерных областях и неактивной 4 хромосоме дрозофилы. "Красный" и "желтый" хроматин в данной классификации представляют ранее описанный транскрипционно-активный эухроматин. Общими для двух этих типов хроматина являются маркеры: гистоны H3K4me2 and НЗК79теЗ, гистондеацетиллирующие комплексы RPD3 и SIR2, RPD3-B3aHMOfleftcTByiouimi белок SIN3A. Уникальными маркерами "красного" хроматина являются АТФазная субъединица ремоделирующих комплексов Brahma, субъединица комплекса Mediator MED31, субъединица многих гистон-модифицирующих комплексов CAF1, а также ряд ДНК-связывающих факторов, таких, как рецептор экдизона EcR и GAGA-фактор (GAF). Глава 2. Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина
Компактизация геномной ДНК в составе хроматина снижает доступность участков связывания регуляторных белков. Кроме того, стабильные нуклеосомы должны были бы значительно затруднять осуществление репликации и транскрипции. В клетке отрицательные особенности, создаваемые нуклеосомной организацией, преодолеваются путем привлечения ряда комплексов, которые, изменяя структуру хроматина, участвуют в регуляции транскрипции и репликации. Данные комплексы можно разделить на два основных типа:
Основной каталитической субъединицей комплексов ремоделирования хроматина является АТФазная субъединица. Каталитические субъединицы всех известных ремоделирующих комплексов относятся к классу 8пі2-хеликазоподобньіх белков (Flaus et al, 2006). По типу АТФазной субъединицы ремоделирующие комплексы разделяют на четыре основные семейства: SWI/SNF, ISWI, CHD и INO80/SWR1. Известно, что разнообразие комплексов, входящих в состав каждого из семейств увеличивается с возрастанием сложности организма. Для многих комплексов характерно наличие тканеспецифических субъединиц, обуславливающих формирование соответствующих комплексов в отдельных тканях организма. Например, к семейству SWI/SNF у дрожжей относят два комплекса, в то время как у человека насчитывается более 100 комплексов данного семейства. Семейство CHD у дрожжей представлено одним комплексом CHD1, а у человека встречается 9 разнообразных каталитических субъединиц CHD, которые могут функционировать самостоятельно, либо в составе крупных мультисубъединичных комплексов (Bartholomew, 2014). Между представителями разных семейств ремоделирующих комплексов существуют функциональные различия. Известно, что in vitro изолированные АТФазные субъединицы всех семейств ремоделирующих комплексов сохраняют способность изменять структуру хроматина (Becker et al, 2002). Представители семейств ISWI и CHD осуществляют скольжение нуклеосом по ДНК и определяют минимальное расстояние между нуклеосомами, на котором прекращают скольжение. Представители семейства SWI/SNF не ограничивают скольжение минимальной длиной линкерной ДНК и способны удалять октамер гистонов с ДНК, образуя области с низкой плотностью нуклеосом. Комплексы семейства INO80/SWR1 могут производить избирательное замещение канонического гистона Н2А на вариантные формы гистона; кроме того, INO80/SWR1 и CHD участвуют в сборке нуклеосом совместно с шаперонами гистонов (Bartholomew, 2014).
Основные пострансляционные модификации хроматина
Проксимальные элементы промотора расположены в нескольких сотнях нуклеотидов перед коровым промотором и содержат сайты связывания для активаторов и репрессоров транскрипции. Дистальные регуляторные элементы (энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, LCR-элементы) могут находиться на расстоянии до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов от промотора. Энхансеры впервые были обнаружены как участки генома вируса SV40, которые, находясь в составе вектора, несущего ген гемоглобина pi, значительно повышали уровень транскрипции последнего (Banerji et al., 1981). Было показано, что действие энхансера не зависит от положения и ориентации по отношению к сайту инициации транскрипции; расстояние до эффекторного гена может достигать 80 т.п.о. и более (Smale and Kadonaga, 2003). Функционирование энхансеров возможно благодаря их способности связывать белки, участвующие в активации транскрипции. Согласно идее «рекрутирования» активация промотора и сборка на нем преинициаторного комплекса происходит за счет действия факторов перестройки хроматина, привлекаемых к промотору связавшимся с энхансером активатором (Ptashne and Gann, 1997). Существует и альтернативная гипотеза, предполагающая, что сборка преинициаторного комплекса происходит на энхансере, результатом чего является инициация межгенной транскрипции РНК-полимеразой II (Orphanides et al, 1996).
Для объяснения механизма структурного взаимодействия энхансера с промотором на больших расстояниях на сегодняшний день предложено несколько моделей. - Модель выпетливания (looping model) (Рисунок 6а) Взаимодействие энхансера и промотора происходит за счет выпетливания промежуточного участка хроматина (Ptashne, 1986). Поиск промотора комплексом энхансер-активатор может происходить за счет непрерывного сканирующего (scanning), либо скачкообразного (hooping) механизма (Bondarenko et al, 2003). - Модель отслеживания (tracking model) (Рисунок 6в)
Было показано, что факторы активации транскрипции, специфически связывающие энхансер, могут быть обнаружены на спейсерной ДНК, отделяющей энхансер от промотора, причем только после связывания и активации этих факторов на энхансере (Hatzis and Talianidis, 2002). Модель отслеживания предполагает, что на энхансере происходит активация специфического белка, который после активации утрачивает контакт с энхансером и перемещается вдоль ДНК до встречи с транскрипционным комплексом на промоторе, запуская процесс транскрипции. Она также не исключает возможность сканирования комплексом энхансер-активатор спейсерного хроматина в поисках промотора (Bondarenko et al., 2003). Возможно и несколько иное объяснение функционирования данной модели. Исследования Р-глобинового локуса мыши и человека показали, что промоторы, энхансеры и UAS-элементы колокализуются в ядре в так называемые хроматиновые узлы (chromatin hub; от англ. hub - узел, центр) (Patrinos et al, 2004). Транскрипция генов, контролируемых данными элементами, происходит при контакте узлов с «транскрипционными фабриками», образованными РНК-полимеразой II и факторами активации (Osborne et al, 2004). В этом случае, полимераза протаскивает участок ДНК сквозь «фабрику» по мере транскрипции,
Модель распространяющегося выпетливания (spreading/looping model) (Рисунок 6с) Данная модель предполагает, что связывание активатора приводит к кооперативному связыванию (полимеризации) вспомогательных белков вдоль ДНК; при этом между промотором и энхансером формируется несколько небольших петель. (Dorsett et al, 1999) Сайленсеры разделяют большинство свойств, характерных для энхансеров: функционируют независимо от ориентации и расстояния до промотора; в составе этих элементов имеются сайты связывания репрессоров транскрипции, функционирование которых может быть в свою очередь связано с привлечением кофакторов. Существует ряд моделей, описывающих механизмы действия репрессоров: - конкуренция за сайты связывания с активатором транскрипции (Harris et al., 2005). - предотвращение связывания активатора, либо факторов транскрипции с промотором за счет привлечения хроматин-стабилизирующих факторов с последующей модификацией нуклеосом (Srinivasan and Atchison, 2004). - блокирование сборки преинициаторного комплекса РНК-полимеразы. (Chen and Widom, 2005)
LCR-элементы, или области контроля локуса представляют группу регуляторных элементов (энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, S/MAR-участки), обеспечивающих тканеспецифичную экспрессию генов. Первым описанным и одним из наиболее изученных является LCR-элемент Р-глобинового домена человека. Области контроля локуса, аналогичные LCR-элементу Р-глобиновых генов человека, были обнаружены и в доменах Р-глобиновых генов других позвоночных животных (Chung et al, 1997).
Инсуляторами называют ДНК-элементы, обнаруженые, на основании их свойства защищать ген от действия других дистальных регуляторных элементов. В зависимости от выполняемой функции различают два типа инсуляторов. Энхансер-блокирующие инсуляторы предотвращают активацию промотера гена энхансером, будучи расположенными между ними. Барьерные инсуляторы снимают так называемый эффект положения, останавливая распространение гетерохроматина, либо защищая трансген от действия внешних регуляторных факторов.
Геном эукариот организован в домены, которые можно разделить на два типа: структурные и функциональные. Функциональные домены выделяют на основании транскрипционного статуса как единицы транскрипции (transcriptional units, transcriptions) или как единицы репликации (replicons). Структурные домены часто выделяют как области предпочтительной чувствительности к обработке нуклеазами (Razin et al, 2003). Хроматиновые домены также могут содержать определенные модификации гистонов: так, в эритроидных клетках а-глобиновый домен характеризуется повышенным уровнем ацетилирования гистона НЗ по позиции К4 (Anguita et al, 2001). Принято считать, что регуляторные последовательности, направляющие экспрессию отдельных генов данного домена находятся внутри домена. Примерами таких последовательностей являются LCR-элементы, или области контроля локуса в доменах Р-глобиновых генов позвоночных. Функциональные исследования показали, что промоторы генов одного домена изолированы от действия негативных или позитивных регуляторных элементов в соседних локусах. Пограничными элементами, подавляющими влияние на геномный домен извне, являются инсуляторы.
Инсуляторами называют ДНК-элементы, обнаруженые на основании их свойства защищать ген от действия других дистальных регуляторных элементов. В зависимости от выполняемой функции различают два типа инсуляторов:
1. Энхансер-блокирующие инсуляторы предотвращают активацию промотера гена энхансером, будучи расположенными между ними. (Рисунок 7Ь)
2. Барьерные инсуляторы снимают так называемый эффект положения, останавливая распространение гетерохроматина, либо защищая трансген от действия внешних регуляторных факторов (Рисунок 7 а, с).
Модели функционирования энхансер-блокирующих инсуляторов
S2 клетки сажали на 30мм чашки для культивирования в количестве 1 млн. в объеме среды 3 мл. Для проведения эксперимента из чашки отбирали обычную среду для S2 клеток с 10% эмбриональной сыворотки и заменяли ее на 1 мл бессывороточной среды, в которую после по каплям добавляли 20-30 мкг двухцепочечной РНК. Клетки выдерживали при комнатной температуре 40-50 минут, затем добавляли 2 мл среды, содержащей 15% эмбриональной сыворотки, чтобы конечная концентрация составила 10% сыворотки в среде. Клетки наращивали в термостате при 25С в течение 4 суток, а затем анализировали необходимым образом.
Разделение белков проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по стандартной методике: концентрирующий гель - 5% АА; 0.13 мМ Tris-HCl, рН 6.8; 0.1% SDS; 0.1 % ПСА; 0.1% ТЕМЭД; разделяющий гель - 7.5%-10% АА; 0.375 мМ Tris-HCl, рН 8.8; 0.1% SDS; 0.1 % ПСА; 0.08% ТЕМЭД. Исходные растворы: 30% АА: 29% акриламид, 1% бис-акриламид. Использовался буфер lxTGB. Для нанесения белковых препаратов на гель использовали 2х буфер для нанесения. Разделение белков проводили в камере MiniProtean II (Bio-Rad) в соответствии с методиками производителя.
Белки после электрофореза с полиакриламидного геля с полиакриламидного геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham) в системе переноса камере MiniProtean II (Bio-Rad) по рекомендации производителя в буфере TG. Далее проводили блокирование неспецфической сорбции антител, инкубируя мембрану в lx PBS с добавлением 3% сухого обезжиренного молока (Fluka) 1 час. Инкубировали мембрану в течение ночи при 4С с первичными антителами в буфере lx PBS . Антитела использовались в необходимых для каждого разведениях. Отмывали мембрану от несвязавшихся антител в буфере lx PBS с добавлением 0.5% Tween-20 3 раза по 10 минут. Затем 1 час инкубировали мембрану с вторичными антителами к IgG кролика или мыши (в разведении 1:10000), коньюгированными с пероксидазой хрена (Amersham). Отмывали мембрану от несвязавшихся антител в буфере lx PBS с добавлением 0.5% Tween-20 также 3 раза по 10 минут. Детектирование перенесенных белков проводили с помощью системы детекции ECL или ECL+ (Amersham) по протоколу производителя.
Растворяли Протеин А-сефарозу в lx PBS, осаждали кратковременным центрифугированием, удаляли супернатант. Промывали сефарозу 3 раза lx PBS. Посадку антител на Протеин А-сефарозу проводили в буфере для посадки (на 20 мг Протеин А-сефарозы брали 4 мгк антител и 200 мкл буфера) при комнатной температуре в течение часа при покачивании. Далее, осаждали сефарозу в течение 5 минут на 1000g, добавляли 200 мкл буфера IP 100, инкубировали в течение 20 минут. Затем вновь осаждали сефарозу, отмывку повторяли.
Для приготовления белкового экстракта клетки (3x106) ресуспендировали в среде, переосаждали 5 минут при 2000g и промывали трижды 1 мл lx PBS. Осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера LBcell, добавляли 4 мкл 25х РІС и DTT до концентрации 0.3 мМ. Суспензию оставляли во льду на 20 минут, затем центрифугировали при 14000g 15 минут при +4С. К супернатанту прибавляли 3 объема буфера LBcell для разведения.
Для проведения иммунопреципитации к 50-100 мкл белкового экстракта (100-400 мкг белка) смешивали с 20 мкл Протеин А-сефарозы и инкубировали в течение ночи при перемешивании при +4С. Затем осаждали сефарозу, супернатант отбирали. Промывали сефарозу 2 раза по 5 минут 100 мкл IP500 и 1 раз 5 минут ГР100. К осадку добавляли 20 мкл буфера для нанесения белковых препаратов на гель и проводили белковый гель-электрофорез и Western-blot анализ.
Хроматин был получен из S2 клеток (ЗхЮ6), либо из куколок мух D.melanogaster. Для получения хроматина из S2 клеток, клетки ресуспендировали в среде и фиксировали 1.5% раствором ПФА в течение 15 минут, затем удаляли свободный ПФА добавлением глицина до концентрации 125 мМ. Клетки осажали, промывали раствором lx PBS 3 раза. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл раствора для озвучивания хроматина, добавляли ингибитор протеиназ 25х PIC (Roche) до концентрации 1х и 1 мкл 0.2М PMSF и обрабатывали ультразвуком. Фрагменты ДНК после обработки составляли примерно 300 п.о. Полученную фракцию хроматина центрифугировали при 14000g при +4С 2 раза по 15 минут, супернатант использовали для проведения иммунопреципитации.
Для получения хроматина из куколок мух D. melanogaster (200 мг), гомогенизировали материал при комнатной температуре в гомогенизаторе Доусона в 5 мл буфера А1 с добавлением формальдегида до концентрации 1,8%. Инкубировали в течение 15 минут. Затем добавляли 1/20 объема 2.5 М раствора глицина, инкубировали в течение 5 минут. Гомогенат фильтровали, центрифугировали 5 минут при 4000g при +4С. Супернатант отбрасывали, осадок ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса, центрифугировали 5 минут при 4000g при +4С. Процедуру отмывки повторяли три раза. Затем, добавляли 0.5 мл буфера для лизиса и обрабатывали материал ультразвуком. Фрагменты ДНК после обработки составляли примерно 300 п.о.. Полученную фракцию хроматина центрифугировали при 14000g при +4С 15 минут, супернатант отбирали, к осадку вновь добавляли 0.5 мл буфера для лизиса и повторяли процедуру экстракции хроматина. Супернатант из двух экстракций объединяли, центрифугировали при 14000g при +4С 15 минут и использовали для проведения иммунопреципитации. 10% от количества экстракта, использованного на одну иммунопреципитацию, замораживали и хранили при -20С до этапа расшивки хроматина. К хроматиновому экстракту добавляли соответствующие антитела в количестве 4 мкг, а также BSA и очищенную ДНК из семенников сельди до концентрации 1 мг/мл, чтобы заблокировать неспецифическое связывание антител, и инкубировали в течении 12 часов при +4С. Одновременно растворяли протеин А-сефарозу в растворе для озвучивания, добавляли BSA и очищенную ДНК из семенников сельди до концентрации 10 мг/мл, и также икубировали в течении 12 часов при +4С. После этого к хроматину добавляли 20 мкг протеин А-сефарозы, и инкубировали еще 3 часа при +4С. Затем проводили отмывку сефарозы от неспецифически связавшихся компонентов последовательно тремя растворами: раствор для озвучивания, буфер А, буфер Б и ТЕ. Отмывку проводили в течение 5 минут при +4С, осаждали сефарозу центрифугированием в течение 5 минут при 1000g при +4С. После добавляли 250 мкл буфера для элюции и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, сефарозу осаждали центрифугированием и отбирали супернатант. Элюцию хроматина с сефарозы повторяли еще раз в тех же условиях. Объем отобранной и замороженной ранее фракции хроматина также доводили до 500 мкл буфером для элюции. Супернатанты с первой и второй элюции объединяли, добавляли NaCl до концентрации 160 мМ и инкубировали элюат в течение 12 часов в термостате при 65С для расшивки хроматина. Затем к элюату добавляли 50 мкг протеиназы К и ЭДТА до концентрации 5 мМ, инкубировали в термостате при 55С в течение 4 часов. Для депротеинизации элюат после обработки протеиназой К суспендировали в равном объеме фенольной смеси (фенол : хлороформ : изоамиловый спирт - 25 : 24 : 1), затем центрифугировали 5 мин при 14000g, после чего верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, добавляли 3 объема 95% этанола и выдерживали 20 мин при -20 С. Затем раствор центрифугировали 10 мин при 14000g при +4С; промывали осадок ДНК 70% спиртом, центрифугировали в тех же условиях. Осадок ДНК сушили и пререрастворяли в 80 мкл раствора ТЕ.
Рекрутирование комплексов SAGA, ВАР и ORC на сайты связывания Su(Hw) не зависит от типа окружающего хроматина
На основании полученных данных можно сделать следующие выводы. Su(Hw) привлекает комплекс ацетилирования гистонов SAGA и комплекс ремоделирования хроматина ВАР на сайты связывания Su(Hw). Это приводит к формированию областей с низкой плотностью нуклеосом и создает условия для связывания комплекса белков, узнающих участки начала репликации (ORC). Отсутствие Su(Hw), способного связывать сайты на ДНК при нокауте данного белка в линии клеток S2, либо в мутантной линии su(Hw)v/su(Hw)E8, приводит к значительному снижению количества белковых комплексов SAGA, ВАР и ORC, и, в то же время, к увеличению плотности нуклеосом на сайтах связывания Su(Hw) (Рисунки 14, 17 - 23, 27, 28). Таким образом, Su(Hw) создает условия для связывания комплекса ORC и формирования пре-репликативных комплексов (Рисунок 32). Биоинформатические методы показали, что хеликазный комплекс МСМ2-7 ассоциирован с сайтами связывания Su(Hw) (Рисунок 216). Результаты СЫР экспериментов показали, что комплекс CDC45 рекрутируется на некоторые из исследованных сайтов Su(Hw) и Su(Hw) является необходимым для рекрутинга (Рисунок 25). Таким образом, можно предположить следующую последовательность привлечения белков на 8и(Н\у)-инсуляторы: комплекс ORC связывается с областями с низкой плотностью нуклеосом, сформированными на сайте Su(Hw), хеликазный комплекс МСМ2-7 связывается с платформой ORC, после чего белок CDC45 загружается на сформировавшийся пре-репликационный комплекс. Разные сайты связывания Su(Hw) привлекают различные количества CDC45, в то время, как уровень связывания ORC3 на всех сайтах более или менее сходный (Рисунок 22, 23). Вероятно, Su(Hw) создает платформу для формирования пре-репликационных комплексов на всех исследованных в работе сайтах связывания Su(Hw), после чего происходит активация репликации на некоторых из данных сайтов.
Свойства ДНК-связывающего белка Su(Hw) не зависят от типа хроматина, окружающего его сайт. На основании этого можно предположить, что состояние хроматина не является первичным сигналом для формирования сайта начала репликации. Скорее таким первичным сигналом служит некий ДНК-связывающий белок, примером которого в данном случае является Su(Hw). В пользу данной идеи говорит распределение белков ORC и Su(Hw) в геноме по типу хроматина. Не смотря на то, что в основном в геноме белки комплекса ORC обнаружены в районах активного хроматина, они были обнаружены на сайтах связывания Su(Hw). Su(Hw), который в основном образует сайты в «синем» и «черном» хроматине, оказался ведущим детерминантом в позиционировании ориджинов.
Su(Hw) является первым примером белка, участвующего в позиционировании 6% ORC-связывающих сайтов генома дрозофилы, большая часть из которых находится в "черном" и "синем" хроматине. Так как большинство сайтов ORC в геноме располагаются в "красном" и "желтом" хроматине, возможными кандидатами на роль позиционирования ориджинов репликации являются ДНК-связывающие транскрипционные активаторы. Данное предположение подтверждает тот факт, что для многих факторов транскрипции было показано взаимодействие с компонентами пре-репликационного комплекса (Beall et al, 2002; Hubner and Phi-van, 2012; Bosco and Orr-Weaver, 2001). Результаты биоинформатических исследований, описанных в данной работе, показали, что Su(Hw) и инсуляторные белки дрозофилы Класса I также обладают сходными свойствами по ремоделированию хроматина и колокализуются с компонентами пре-репликационного комплекса (Рисунок 31). Таким образом, dCTCF, GAF и BEAF32 являются белками-кандидатами на участие в позиционировании ORC и формировании пре-репликативных сайтов по механизму, сходному с описанным для белка Su(Hw).
Ранее было показано, что комплекс ORC связывается преимущественно с АТ-богатыми областями хроматина (MacAlpine et al, 2004). Более того, субъединица ORC6 дрозофилы необходима для связывания комплекса ORC с ДНК и предпочтительно связывает поли-А последовательности (Balasov et al, 2007). Согласно этим данным необходимость ORC6 для связывания комплекса ORC с хроматином объясняется неспецифической связывающей активностью данной субъединицы по отношению к АТ-богатым последовательностям ДНК в областях открытого хроматина, образованных с помощью различных ДНК-связывающих белков включая Su(Hw). В соответствии с этим выводом было показано заметное обогащение сайтов связывания Su(Hw) АТ-богатыми последовательностями (Рисунок 21ж - з). Белок-белковые взаимодействия могут дополнительно стабилизировать связывания ORC, что следует из сильного взаимодействия между Su(Hw) и компонентами комплексов SAGA, ВАР и ORC (Рисунок 17, 19, 24). Считается, что комплекс ORC не обладает заметной специфичностью по отношению к последовательностям ДНК (MacAlpine et al, 2010) и среди сайтов связывания ORC у высших эукариот отсутствует консенсус. В поддержку данного мнения, было показано, что сайт связывания Su(Hw) может направлять позиционирование сайта ORC in vivo (Рисунок 30).
Su(Hw) относится к классу II инсуляторных белков и в отличии от класса I не ассоциирован с промоторами генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II (Negre et al, 2010; Smith et al, 2009). Более того, Su(Hw) имеет тенденцию локализоваться в областях транскрипционно не активного хроматина, согласно классификации (Filion et al., 2010) относящихся к "черному" и "синему" хроматину. Тем не менее, описанный в работе механизм формирования открытого хроматина на сайтах связывания Su(Hw) имеет много общего с формированием открытого хроматина на промоторах активных генов. Известно, что активаторы транскрипции привлекают на промоторы этих генов комплексы ремоделирования и ацетилирования хроматина. Аналогично, комплекс ORC привлекается на промоторы активных генов и на сайты связывания Su(Hw). Также анализ структуры хроматина методом CATCH-IT обеспечивает подтверждение того, что на Su(Hw) связывающих сайтах происходит активный обмен гистонов (Рисунок 21г - е), что является характерной чертой ориджинов репликации (Deal et al, 2010). Сходные свойства таких различных геномных элементов как сайты связывания Su(Hw) и промоторы позволяют нам предположить, что в клетке реализуются универсальные механизмы позиционирования ориджинов репликации. Эти механизмы позволяют клетке создать множество ориджинов репликации, позиционируемых ДНК-связывающими белками, которые организуют необходимую для связывания комплекса ORC структуру хроматина. В ряде исследований показано, что основные известные классы регуляторных элементов ДНК, включая промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, области контроля локусов, являются областями открытого хроматина (Cockerill, 2011; Gross and Garrard, 1988). Таким образом, универсальный механизм позиционирования ориджинов репликации мог бы позволить связать процессы транскрипции и репликации на разнообразных регуляторных элементах генома.
