Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время метод молекулярной визуализации («molecular imaging») является одним из наиболее перспективных методов анализа на молекулярном уровне патологических процессов in vivo в злокачественных новообразованиях. По мере развития этого метода все большее значение приобретает его клиническое использование как для диагностики, так и лечения онкологических заболеваний. Более того, методы молекулярной визуализации являются одним из основных источников информации о механизмах и путях регуляции патофизиологических процессов, затрагивающих практически все значимые онкогены и онкобелки [Bonisch Н., Brass М., 2006; Barnett Е. et al., 2009; Tsien С. et al., 2009]. Здесь главные направления - изучение факторов лекарственной устойчивости [Bigott Н. et al., 2005], неоангиогенеза [Rossin R. et al., 2007], роли цитокинов [Massague J. et al., 2001], пролиферации [Solit D. et al., 2006] и метастазирования [Scholz M. et al., 2007] клеток.
Выделенный в отдельное направление около пятнадцати лет назад подход, использующий способы визуализации накопления, распределения и переноса радиоактивно меченых маркеров, основан на принципах молекулярной биологии, фармакологии и биохимии, лежащих в основе исследований различных химических соединений [Phelps Met al., 1979]. В настоящее время этот метод представляет собой сплав фармакологии и радиологии, находящийся под влиянием достижений клеточной и молекулярной биологии, химии и физики элементарных частиц [Hackman Т. et al., 2002]. Все большее значение приобретают методы математической оценки биологических процессов, что позволяет использовать различные методы, основанные на реконструировании данных и презентации их в легко читаемом формате [Zanzonico P. et al., 2006; Serganova etal.,2008].
Однако на пути применения всех этих подходов в клинике возникают значительные трудности, главной из которых является иммунологическая реактивность большинства репортерных белков, полученных от других животных.
В связи с этим особое значение приобретают поиски для визуализации белков человеческого происхождения, которые могли бы использоваться при изучении болезней человека. Одним из новых и перспективных белков, в этой связи, является транспортер норадреналина человека (чНАТ). Этот белок блокирует передачу нервного импульса через норадреналиновые рецепторы путем быстрой транспортировки норадреналина, выделяемого в межсинаптическое пространство, в пресинаптические терминалы. чНАТ осуществляет контроль опосредуемых норадреналином физиологических процессов и эффектов поведения.
В последние годы клонированы гены HAT крысы, быка и человека. У млекопитающих эти гены экспрессируют HAT практически только в центральной и периферической симпатической нервной системы. Поэтому ген может выступать в качестве репортерного при изучении злокачественных новообразований в других тканях у экспериментальных животных и у человека. Такой подход обладает рядом преимуществ, главным из которых является наличие тестированных и одобренных в ряде государств радиоизотопных маркеров.
Основная задача в настоящее время - использование метода на этапе доклинических испытаний для оценки его потенциала при визуализации клинически значимых патофизиологических параметров популяций опухолевых клеток. Ключевое значение здесь приобретает разработка новых радиоактивно меченых проб, которые могли бы улучшить безопасность и эффективность применения их как на лабораторных животных, так и, в дальнейшем, у больных в клинике.
Цель исследования
Изучить ген норадреналинового транспортера человека (чНАТ) и кодируемый им белок; изучить возможность его применения в качестве репортерного гена для инструментальной визуализации различных биологических процессов, характерных для патофизиологии опухолевых клеток и тканей у экспериментальных животных, а также для доклинического анализа и клинической диагностики злокачественных новообразований.
4 Конкретные задачи работы
-
Создать стабильно синтезирующие чНАТ клеточные линии с целью выяснить, накапливают ли трансдуцированные клетки радиоактивно меченые пробы в количествах, достаточных для визуализации in vivo, в сравнении с клетками неонкогенного происхождения.
-
Оценить распределение чНАТ в трансдуцированных опухолях, для чего провести сравнительное исследование накопления ш1- и 1241-меченого синтетического аналога норадреналина методом визуализации при помощи одно-фотонного и позитронно-эмиссионного томографов.
-
Исследовать возможность использования оптических репортерных систем как независимого контроля экспрессии конструкций, содержащих ген чНАТ, in vitro и in vivo.
-
Выяснить, является ли применение репортерной системы чНАТ информативным для оценки корреляции между усилением сигнала и уровнем пролиферации опухолевых клеток.
-
Определить, возможна ли визуализация чНАТ-позитивных опухолевых клеток в процессе метастазирования.
Научная новизна результатов работы
Впервые осуществлен анализ норадреналинового транспортера человека (чНАТ), как репортерного гена, в злокачественных и нормальных клетках мыши, крысы, обезьяны и человека. Так, показано, что клетки, трансдуцированные геном чНАТ, стабильно экспрессируют его в течение более двух лет. Сконструированы чНАТ-позитивные клеточные линии со склонностью к метастазиро-ванию. Создан аналог норадреналина, меченый испускающим позитроны изотопом йод-124, - [І24І]-мета-йодбензилгуанидин (МИБГ). Проведено комплексное сравнение in vitro и in vivo используемой в клинике пробы [ш1]-МИБГ и созданной впервые пробы [1241]-МИБГ. Получены изображения чНАТ-позитивных опухолей различной локализации, с применением позитронно-эмиссионной томографии. Разработан метод стимуляции метастатического рас-
5 пространения чНАТ-позитивных опухолей с последующей неинвазивной визуализацией радиоактивности in vivo.
Научно-практическая значимость
Разработанные и оптимизированные чНАТ-содержащие репортерные системы позволяют проводить доклиническую и клиническую оценку некоторых физиологических и патофизиологических процессов in vitro и in vivo с помощью новейших инструментов молекулярной визуализации, таких как ОФКТ и ПЭТ. Применение генов, кодирующих флуоресцентный белок, используемый для оптической визуализации, предоставляет возможность независимо оценивать экспрессию чНАТ и изучать корреляцию различных процессов в опухолях.
Содержащие ген чНАТ репортерные системы используют при диагностике различных форм онкологических заболеваний в отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и педиатрии Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического центра (МСКОЦ, Нью-Йорк, США). Радиоактивно меченая проба [Ш1]-МИБГ проходит в настоящее время процедуру официальной регистрации для внесения в список реагентов для клинического применения. Репортер-ную систему с геном чНАТ активно используют в доклинической практике для изучения возможности терапии лимфомы, вызываемой вирусом Эпштейн-Барра, с помощью Т-лимфоцитов.
Работа выполнена на базе научно-клинических отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Минздравсоцразвития РФ (Москва, РФ) и на базе МСКОЦ (Нью-Йорк, США), в Отделениях неврологии, радиологии, ядерной медицины и радиохимии.
Апробация материалов диссертации
Основные результаты работы представлены в виде докладов и стендовых презентаций на Конференции Общества молекулярной визуализации, Провиденс, 2007; на Межлабораторной конференции Мемориал Слоан-Кеттеринг Онкологического центра, Нью-Йорк, 2006-2008 гг.; Совместной лабораторно-клинической конференции сотрудников ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии, 2008-2010.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано шесть статей в зарубежных изданиях и две - в отечественных журналах. Также было сделано и опубликовано 8 докладов на международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (96 источников), методической части, пяти глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка публикаций. В тексте содержится 9 рисунков (диаграмм и фотографий), 1 таблица.
