Содержание к диссертации
Введение
1 Роль средовых и генетических факторов в развитии злокачественных опухолей ЦНС у детей, и в развитии осложнений лучевой терапии (обзор литературы) 10
1.1 Средовые факторы, влияющие на развитие злокачественных опухолей ЦНС у детей 10
1.2 Характеристика детских опухолей мозга 14
1.3 Генетические факторы, влияющие на развитие опухолей мозга у детей 16
1.4 Развитие осложнений в связи с применением лучевой терапии 18
1.5 Персонализированная медицина и фармакогенетика 21
1.6 Обоснование выбора исследуемых локусов 22
1.7 Современные методы оценки действия генов в мультифакторных заболеваниях 29
2 Материалы и методы 34
2.1 Изученные выборки 34
2.2 Цитогенетический тест на соматическую мутабильность 37
2.3 Генотипирование по генам кандидатам 39
2.3.1 Выделение ДНК 39
2.3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 39
2.4 Статистическая обработка полученных результатов 58
3 Изучение роли полиморфизма генов в заболеваемости ЗНО мозга (результаты и обсуждение) 60
3.1 Анализ гомогенности контрольной выборки по исследуемым локусам 60
3.2 Анализ ассоциаций заболеваемости с генотипами по исследуемым генам 70
3.2.1 Анализ ассоциаций заболеваемости с генотипами во всей выборке больных детей 70
3.2.1.1 Однолокусные эффекты 70
3.2.1.2 Мультилокусные эффекты 77
Анализ гаплотипов 77
Мультилокусный анализ 78
3.2.2 Мета-анализ 79
3.2.2.1 Мета-анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTM1 с заболеваемостью опухолями мозга 79
3.2.2.2 Мета-анализ ассоциации делеционного полиморфизма гена GSTT1 с заболеваемостью опухолями мозга 83
3.2.3 Анализ различий ассоциаций генотип-болезнь у лиц разного пола в выборке европейцев 88
3.2.3.1 Однолокусные эффекты 89
3.2.3.2 Мультилокусные эффекты 93
Анализ гаплотипов 93
Мультилокусный анализ 93
3.2.4 Анализ различий ассоциаций генотип-болезнь у европейцев разного пола с учетом возраста вступления в период полового созревания 95
3.2.4.1 Однолокусные эффекты 96
3.2.4.2 Мультилокусные эффекты 100
Анализ гаплотипов 100
Мультилокусный анализ 100
3.3 Влияние облучения на организм человека в зависимости от генотипа по исследуемым локусам 108
3.3.1 Изменчивость частоты индуцированных хромосомных аберраций в зависимости от генотипов по кандидатным локусам у молодых здоровых добровольцев 108
3.3.1.1 Однолокусные эффекты 109
3.3.1.2 Комбинации генов, ассоциированные с вариабельностью частоты индуцированных хромосомных аберраций 110
3.3.2 Анализ ассоциаций постлучевых осложнений с исследуемыми генотипами 112
Заключение 118
Выводы 120
Список сокращений 121
Список работ, опубликованных в журналах из списка ВАК 123
Работы по теме диссертации, опубликованные в других изданиях 123
Список тезисов 123
Список использованных источников 124
Приложения 138
- Обоснование выбора исследуемых локусов
- Однолокусные эффекты
- Однолокусные эффекты
- Анализ ассоциаций постлучевых осложнений с исследуемыми генотипами
Введение к работе
Актуальность темы исследования. За последнее время заболеваемость злокачественными новообразованиями (ЗНО) мозга выросла в большинстве развитых стран, особенно среди детей дошкольного возраста. При этом пик заболеваемости приходится на возраст от 2 до 7 лет. В настоящее время уровень заболеваемости онкологическими заболеваниями составляет 15-16 человек на 100 000 детского населения в год. Ежегодно в России диагноз рак ставится 5000 детей. Из них 1000 детей заболевает злокачественными опухолями мозга.
В 80% случаев диагноз детям удается поставить лишь на 3-4 стадии развития опухоли. По данным Всемирной организации здравоохранения, на 100 умерших в возрасте 1-4 лет - 9,8% и 5-14 лет - 14,3% приходится на злокачественные опухоли.
Опухоли головного мозга у детей встречаются в 5—8 раз реже, чем у взрослых, и составляют 16—20% от всех новообразований в детском возрасте. Около 25% опухолей нервной системы, наблюдающихся у детей, приходится на первые 3 года жизни. Мальчики болеют несколько чаще (58%), чем девочки (42%).
Более 70% всех опухолей головного мозга у детей раннего возраста составляют нейроэктодермальные внутримозговые опухоли-глиомы или глиальные опухоли (астроцитомы, эпендимомы, глиобластомы); данная цифра превышает заболеваемость этим типом опухоли у взрослых в 2 раза. Значительно реже обнаруживаются опухоли мезодермального происхождения (13%). Врожденные и эмбриональные опухоли (тератомы, холестеатомы) составляют 0,8—2% от всех опухолей нервной системы.
Среди опухолей нейроэктодермалного происхождения основную массу составляют астроцитомы (28—50%). По данным Института нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко АМН СССР, астроцитомы составляют 33% среди опухолей нервной системы у детей первых трех лет жизни, а медуллобластомы — 14%, что в 4— 6 раз превышает аналогичные показателей у взрослых. Нередкими опухолями у детей являются краниофарингиомы, эпендимомы.
При этом прогнозируется дальнейший рост количества опухолевых заболеваний в развитых странах.
Несмотря на это, показатели смертности в большинстве видов детских онкологических заболеваний резко сократились. Процент выживаемости при лечении онкологических заболеваний у детей увеличился. Ныне пять из шести заболевших детей, около 84%, остаются в живых более пяти лет с момента постановки диагноза, что в медицине приравнивается к полному выздоровлению.
Развитие осложнений при проведении химио- и лучевой терапии у детей практически неизбежно. У взрослых пациентов при проведении лучевой терапии риск ближайших и отдаленных осложнений минимален. У детей этот риск в несколько раз выше, а потому применение таких типов терапии имеет множество ограничений. Однако восстановительные способности некоторых органов и систем у детей выше, чем у взрослых.
На сегодняшний день при лечении онкологических заболеваний применяются методы персонализированной медицины. Суть этого метода состоит в том, что при подборе препаратов для лечения опухоли учитываются индивидуальные особенности организма, которые могут влиять на эффективность применяемой терапии. Данный метод применяется для достижения лучших результатов в процессе лечения и для снижения негативных последствий связанных лечением. Индивидуальные генетические особенности могут влиять как на риск развития онкологического заболевания, так и на риск развития осложнений при применении химио- и радиотерапии.
Степень научной разработанности проблемы. По частоте возникновения у
детей опухоли мозга стоят на втором месте после рака крови. Несмотря на высокую
частоту встречаемости опухолей мозга у детей среди всех солидных опухолей
(составляет 20% всей онкологической заболеваемости в детском возрасте) по
педиатрическим опухолям мозга есть всего несколько ассоциативных исследований
в разных этнических группах (Idowu, Idowu, 2008; Сальникова и др., 2010; Ezer et al.,
2002). В нескольких работах изучалось взаимодействие среды и генотипа в связи с
заболеваемостью злокачественными новообразованиями мозга в детском возрасте
(Nielsen et al., 2005; Nielsen et al., 2010). Ассоциации ряда аллелей полиморфных
генов с развитием опухолей мозга у взрослых рассматривается в литературе
несколько чаще (Song et al., 2012; Cengiz et al., 2008; Coutinho et al., 2010; Schwartzbaum et al., 2007). Однако и в этих статьях круг рассматриваемых полиморфных сайтов достаточно невелик. Ассоциация полиморфных аллелей определенных сайтов с развитием осложнений лучевой терапии у детей с опухолями мозга ранее не изучалось.
Цель и задачи исследования. Целями исследования являлось:
Исследовать роль полиморфизма генов 1 и 2 стадий детоксикации ксенобиотиков, репарации и ряда других генов у детей со злокачественными новообразованиями мозга.
Исследовать ассоциацию аллелей и генотипов генов 1 и 2 стадий детоксикации ксенобиотиков, репарации и ряда других генов с эффектами облучения in vivo и in vitro.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
Изучить ассоциации аллелей и генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, MTHFR, AHR, XPD, XRCC1, RAD 51, ACE, CCR5, nNOS с развитием опухолей мозга у детей.
Изучить мультилокусные эффекты аллелей и генотипов по исследуемым локусам с развитием опухолей мозга у детей.
Исследовать гендерные различия ассоциаций аллелей и генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, MTHFR, AHR, XPD,XRCC1, RAD 51, ACE, CCR5, nNOS с развитием опухолей мозга у детей
Изучить ассоциации аллелей и генотипов по исследуемым локусам c развитием осложнений после проведения лучевой терапии у детей с опухолями мозга и с частотами у-индуцированных in vitro нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови добровольцев. Научная новизна.
Впервые выявлена ассоциация увеличения риска развития опухолей мозга с полиморфизмом гена CYP1A1 у детей.
Впервые выявлена ассоциация увеличения риска развития опухолей мозга с
полиморфизмом гена GSTM1 у российских детей.
Впервые выявлена ассоциация у-индуцированных in vitro хромосомных аберраций с полиморфизмом гена RAD 51.
Впервые выявлены гендерные различия в ассоциации генетических маркеров с опухолями мозга у детей.
Положения выносимые на защиту.
Наличие минорных аллелей по 2-м локусам гена CYP1A1 сопряжено с увеличением риска развития опухолей мозга у детей.
Наличие двойной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 сопряжено с увеличением риска развития опухолей мозга у детей.
Существуют гендерные различия в ассоциации полиморфизма по локусам гена CYP1A1 с риска развития опухолей мозга у детей.
Степень обоснованности научных результатов.
результаты экспериментальной части работы, включающие выделение ДНК, аллель специфическую ПЦР реакцию, гельэлектрофорез и цитогенетический анализ материала, получены на сертифицированном оборудовании.
выбор исследуемых генов основан на анализе функций этих генов и степени разработанности данной темы в публикациях;
частоты аллелей по исследуемым генам, полученные в данной работе при рассмотрении выборки здорового контроля, соответствуют частотам аллелей европейцев, представленными в базе HapMap. Данный факт свидетельствует о корректности установленных частот.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа дополняет имеющиеся представления о причинах возникновения злокачественных новообразований мозга у детей, что в дальнейшем позволит разрабатывать пути лечения опухолей мозга, основываясь на особенностях развития данного заболевания у конкретного человека.
Апробация диссертации и публикации.
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, 3 - в тезисах научных конференций:
Основные результаты доложены на конференциях: VI Съезд Российского общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону. 14-18 мая 2010 г.; Конференция «Генофонды и генетическое разнообразие» Москва. 2010 г.; V Всероссийский с международным участием медико-биологический конгресс молодых ученых. Тверь. 3-8 декабря 2012 г.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть (методы исследований, результаты и обсуждение), заключение, выводы, список сокращений, список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 23 таблицы, и 26 рисунков. Список литературы включает 125 ссылок, из них 114 на английском языке.
Обоснование выбора исследуемых локусов
Роль полиморфизма гена CYP1A1 в детской нейроонкологии не изучалась. В ассоциативных исследованиях у взрослых показано отсутствие ассоциации полиморфизма CYP1A1 A4889G (Ile462Val) с риском глиомы и некоторых других злокачественных новообразований мозга (Trizna et al., 1998, Schwartzbaum et al., 2007, De Roos et al., 2003). В тоже время было показано, что изменение экспрессии и активности белка цитохрома приводит к изменению канцерогенного эффекта полициклических углеводородов, вследствие изменения пути их биотрансформации (Kommaddi et al., 2007). Такие углеводороды, в свою очередь, встречаются в воздухе, пище и воде и, как было показано экспериментально, являются трансплацентарными канцерогенами (Wang et al., 2008). Можно сделать вывод, что изменение скорости выведения канцерогенных полициклических углеводородов может изменить их губительное влияние на клетки человека. В тоже время уже показано, что изменение экспрессии CYP1A1 и CYP1B1 влияет на метаболизм противораковых препаратов в клетках медуллобластомы (Liu et al., 2004), что говорит о вовлеченности продуктов этих генов в процесс развития опухоли.
В опубликованных ранее работах была показана связь повышения уровня TCR-мутантных лимфоцитов (одного из маркеров радиочувствительности) с полиморфизмом гена CYP1A1 (Замулаева и др., 2009). Данный факт говорит о возможности рассмотрения полиморфизма данного гена в отношении индуцированных аберраций в клетках добровольцев и развития осложнений у детей, прошедших лучевую терапию.
Три сайта в локусе CYP1A1, изученные в настоящей работе, тесно сцеплены. Для сайтов CYP1A1 1384 и -27+606: D =0,919, г=0,242, р=0, а минорные аллели (1384G, -27+606G) относятся к одной группе сцепления. Для сайтов CYP1A1 1384 и 947+242: D =0,899, г=0,536, р=0; минорные аллели (1384G, 947+242С) относятся к одной группе сцепления. Для сайтов CYP1A1 947+242 и -27+606: D =0,880,r=0,389, р=0; минорные аллели (947+242С, -27+606G) относятся к одной группе сцепления. Показатели неравновесия по сцеплению не отличаются в группе больных и в контроле. В представленной работе мы подтвердили полученные нами ранее на других выборках результаты по сцеплению полиморфных сайтов A4889G (A1384G) и T606G (T-27+606G) (Сальникова, Замулаева и др., 2010; Сальникова, Зелинская и др., 2010).
AHR - это лиганд-активируемый транскрипционный фактор и регулятор белка цитохрома Р450 1А1. Он изменяет токсический эффект множества химических агентов содержащих полициклические ароматические углеводороды. Замена Arg554Lys ведет к усилению транскрипции CYP1A1 (Gu et al., 2012). Отсюда следует вывод, что AHR опосредованно может влиять на процесс развития опухоли.
GSTM1/GSTT1 - гены глутатион S-трансферазы 2 фазы детоксикации ксенобиотиков. Отвечают за присоединение восстановленного глутатиона к широкому спектру экзогенных и эндогенных гидрофобных электрофильных соединений (Huang et al., 2008). У индивидов унаследовавших делеционный полиморфизм по этим генам снижается способность фермента связывать и выводить ксенобиотики из клеток. Следовательно, у таких индивидов снижается способность к борьбе с канцерогенными веществами, попавшими в клетки. В США среди 173 больных детей изучали распределение аллелей генов детоксикации ксенобиотиков GSTM1 (инсерция/делеция), GSTT1 (инсерция/делеция) и GSTP1 (Alall4Val) и зарегистрировали ассоциацию функционального аллеля GSTM1 и редкого генотипа GSTP1 (Valll4/Valll4) с педиатрическими астроцитомами (Ezer et al., 2002). Так же было показано, что делеционный полиморфизм гена GSTT1 ассоциирован с менингиомой у взрослых (De Roos et al., 2003). В исследовании других авторов было показано, что делеционный полиморфизм гена GSTM1 ассоциирован с развитием опухолей мозга у взрослых (Pinarbasi et al., 2005). Несмотря на противоречивые литературные данные в отношении этих сайтов можно ожидать, что они будут оказывать влияние на развитие опухолей мозга.
Сообщалось так же о существенном понижении частоты хромосомных аберраций при облучении крови добровольцев in vitro у носителей делеции GSTM1 (Marcon et al., 2003) однако в другой работе сообщалось о повышении частоты хромосомных аберраций (Karahali et al., 2002). После радиотерапии радиоактивным йодом рост числа микроядер не зависел от генотипов по локусам генов GSTM1, GSTT1, GSTP1 (Hemondez et al., 2006). Эти данные позволяют предположить наличие влияния полиморфизма этих генов на развитие аберраций и появление осложнений при проведении лучевой терапии. XPD (ERCC2) - ген эксцизионной репарации комплементарных повреждений ДНК. Ключевой белок эксцизионной репарации нуклеотидов, который узнает и исправляет сшивки оснований (тиминовые димеры и др.), образующиеся, например, после УФ-облучения или оксидативного стресса. Является компонентом фактора TFIIH - комплекса с хеликазной и транскрипционной активностью. Привлеченный фактор ТИГН катализирует раскрытие поврежденного участка ДНК и способствует сборке репарационного комплекса (Monaco et al., 2009). В опубликованных исследованиях показано, что у носителей XPD 751Gln/Gln значительно снижается риск смертности от глиомы. При этом XPD Asp312Asn не показал статистически значимой корреляции с заболеваемостью глиомой (Song et al., 2012). Однако другие авторы не обнаружили повышенного риска заболеваемости в связи с полиморфизмом XPD Lys751Gln (Cengiz et al., 2008). Liang с соавторами было показано, что потеря аллелей генов ERCC1 и XPD ассоциирована с ростом заболеваемости глиомой (Liang et al., 1995). Из вышеизложенного следует, что полиморфизм гена XPD может играть роль в развитии опухолей мозга у детей.
Некоторыми авторами была показана сопряженность минорных вариантов 751Gln-312Asn гена XPD с повышенной частотой хромосомных аберраций (Au et al., 2003), с повышенной частотой хроматидных разрывов, индуцированных in vitro УФ-лучами, но не хромосомных делеций, вызываемых Х-лучами. Однако есть данные и о протективным эффектам минорных аллелей. Спонтанная частота хромосомных аберраций была ниже у носителей редких вариантов XPD (751Gln-312Asn) в норвежской популяции независимо от возраста и табакокурения (Skjelbred et al., 2006). В экспонированной популяции у лиц с аллельными вариантами 751Gln-312Asn также была меньше частота микроядер после воздействия низких доз ионизирующего облучения (Angelini et al., 2005). Что говорит о возможном участии некоторых аллелей гена XPD в изменении количества аберраций.
Сайты T2251G (Lys751Gln) и G862A (Asp312Asn) гена XPD разделены 12340 п.н. и сцеплены друг с другом. В данной работе для них получены следующие показатели неравновесия по сцеплению: D =0,700, г=0,676, р=0 (не отличаются у больных и здоровых), что коррелирует с литературными данными для европейцев (Butkiewicz et al., 2001).
XRCC1- ген репарации комплементарных повреждений ДНК, возникших в результате рентгеновского излучения. Участвует в эксцизионной репарации оснований ДНК и исправляет повреждения, вызываемые ионизирующим излучением и алкилирующими соединениями. Не имеет собственной каталитической активности, но является центром взаимодействия других ферментов эксцизионной репарации оснований (BER) (Hung et al., 2005). Было показано, что рецессивный аллель Т локуса С580Т является протективным по отношению к заболеванию глиомой. В тоже время индивиды, имеющие аллель 399А, имеют более высокий риск заболевания глиомой (Pan et al., 2013). Не смотря на то, что некоторыми авторами показано отсутствие ассоциации между полиморфизмом данного сайта с развитием глиомы у взрослых (Zhou et al., 2011; Sun et al., 2012), интересно рассмотреть возможность ассоциации данного локуса с другими типами опухолей мозга.
Ранее показано, что минорные варианты генов репарации XRCC1 (399Gln) и XRCC3 (241 Met) были ассоциированы с увеличением числа индуцированных X-лучами аберраций хромосом в работе (Au et al., 2003). Остается открытым вопрос об участии аллеля С580Т (Argl94Trp) в изменении частоты аберраций в у-индуцированных лимфоцитах человека.
RAD 51 - Вовлечен в репарацию ДНК путем гомологичной рекомбинации (Nogueira et al., 2011). Этот ген является важным геном системы репарации двунитевых разрывов ДНК и ассоциирован с рядом онкологических заболеваний. Его роль в развитии опухолей мозга еще не изучалась. Однако интересно оценить его вклад в развитие опухолей мозга у детей.
Однолокусные эффекты
Контрольная выборка и выборка детей с опухолями мозга были прогенотипированы по 15 локусам 11 генов. В когорте больных детей по типам опухолей были выделены две наиболее многочисленные группы: с глиальными и с эмбриональными опухолями мозга. Средний возраст больных детей составил 8,66±0,24 лет, здорового контроля - 27,40±0,43 лет. В таблице 11 сопоставлены частоты встречаемости генотипов 15 полиморфных сайтов для детей с различными типами опухолей центральной нервной системы и в контрольной популяции.
В таблице 12 приведены величины OR, р и доверительного интервала для локусов показавших статистически значимую ассоциацию с заболеваемостью опухолями мозга различной этиологии.
Повышенную предрасположенность к злокачественным новообразованиям мозга была обнаружена у носителей минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 OR=l,67, р=0,009 (рецессивная модель), но данный результат теряет значимость при проведении проверки на множественность сравнений. В частности была обнаружена предрасположенность к заболеванию глиальными опухолями мозга OR=l,54, р=0,041 (рецессивная модель) у носителей минорного аллеля -27+606G. При рассмотрении лог-адитивной модели значимость полученного результата была выше OR=l,41, р=0,0077. Другой сайт гена CYP1A1 - A1384G, также показал свою роль в увеличении риска развития опухолей мозга. Носители мнорного аллеля 1384G имели повышенный риск возникновения эмбриональных опухолей мозга OR=2,66, р=0,0026.
Следующий локус, по которому зарегистрированы значимые результаты, это GSTM1. По данному локусу у гомозигот по делеции повышен риск развития опухолей мозга и, в частности, глиальных и эмбриональных опухолей (OR=l,88, р=0,00003; OR=2,05, р=0,0001; и OR=l,88, р=0,002 соответственно). Все результаты остаются значимыми при проверке на множественность сравнений.
Еще одним локусом, показавшим сопряженность с заболеваемостью, стал GSTT1. Здесь также повышенный риск возникновения опухолей был сопряжен с делеционным вариантом гена. Гомозиготы по делеции этого гена имели повышенный риск развития эмбриональных опухолей мозга OR=l,64, р=0,039, но данный результат становится не значимым при проведении проверки на множественность сравнений.
Результаты, полученные при рассмотрении разных типов опухолей, представлены в таблице 13. В таблице представлены только те локусы, по которым были получены статистически значимые результаты сопряженности полимрфизма по исследуемым локусам с заболеваемостью опухолями мозга. В данном случае в рассмотрение брались только те опухоли, количество случаев которых в рассматриваемой выборке превышает 30, т.к. рассмотрение менее чем 30 случаев, с точки зрение статистической обработки материала, бессмысленно. В данной таблице не представлены данные в отношении астроцитомы, т.к. не было обнаружено значимой корреляции между исследуемыми локусами и заболеваемости астроцитомой в данной выборке.
По отношению к разным типам опухолей были получены следующие результаты. Носители минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 имеют повышенный риск возникновения анапластической эпендимомы OR=l,98, р=0,038 (доминантная модель). Гомозиготы по минорному аллелю того же локуса имеют повышенный риск развития опухолей ствола мозга OR=2,18, р=0,034 (рецессивная модель). Носители минорного аллеля 1384G гена CYP1A1 обладают повышенным риском возникновения медуллобластомы OR=2,62, р=0,0055 (доминантная модель). На ряду с этим обладатели минорного аллеля 947+242С CYP1A1 имеют предрасположенность к заболеванию анапластической эпендимомой OR=2,26, р=0,021 (доминантная модель).
Гомозиготы по делеции гена GSTM1 имеют повышенный риск развития медуллобластомы, глиобластомы, анапластической эпендимомы и опухолей ствола мозга (OR=2,0, р=0,002; OR=2,83, р=0,009; OR=l,93, р=0,042 и OR=l,99, р=0,026 соответственно). При этом гомозиготы по делеции гена GSTT1 имеют повышенный риск возникновения медуллобластомы OR=l,67, р=0,039.
Гомозиготы по минорному аллелю 862А гена XPD имеют предрасположенность к заболеванию опухолями ствола мозга OR=2,21, р=0,023 (рецессивная модель). В тоже время у носителей минорного аллеля 2251G того же гена выше риск развития глиобластомы OR=3,17, р=0,009 (доминантрная модель).
Однако из всех вышеприведенных результатов при проверке на множественность сравнений статистически значимыми оказались лишь ассоциации заболеваемости медуллобластомой с полиморфизмом локусов CYP1A1 1384G и GSTM1.
Однолокусные эффекты
При рассмотрении однолокусных эффектов отдельно в группах мальчиков и девочек с возрастом манифестации заболевания до вступления в пубертатный период были обнаружены отличия в ассоциации заболеваемости с исследуемыми локусами среди лиц мужского и женского пола.
В таблицах 19-20 приведена сопряженность риска заболеваемости опухолями мозга с различными генотипами в выборках мальчиков до 12 лет и девочек до 10 лет.
Среди мальчиков до 12 лет после стратификации выборки сохранился эффект по гену CYP1A1 в отношении эмбриональных опухолей. Носители минорного аллеля 1384G гена CYP1A1 имеют повышенный риск возникновения эмбриональных опухолей мозга OR=3,04, р=0,013 (доминантная модель). Однако при проведении проверки на множественность сравнений результат теряет значимость.
У гомозиготы по делеций гена GSTM1 обнаружена предрасположенность к заболеванию опухолями мозга в целом, и в частности к глиальным и к эмбриональным опухолям мозга (OR=2,09, р=0,0009; OR=2,31, р=0,003 и OR=l,93, р=0,036 соответственно). Однако при проведении проверки на множественность сравнений последний результат теряет значимость. В отношении эмбриональных опухолей мозга наблюдается усиление эффекта, однако значимость его становится ниже, что может быть связано с уменьшением объема выборки.
Гомозиготы по минорному аллелю 862А гена XPD имеют предрасположенность к глиальным опухолям мозга OR=2,29, р=0,01 (рецессивная модель). Данный результат также теряет значимость при проведении проверки на множественность сравнений. Мощность теста при данных объемах выборок и величине эффекта составила 83,37%.
Носители аллеля 665С гена MTHFR имеют повышенный риск развития опухолей мозга в целом OR=3,14, р=0,037 (при рассмотрении лог-аддитивной модели OR=l,52, р=0,018). Мощность теста при данных объемах выборок и величине эффекта составила 36,41%. Для обнаружения эффекта при достаточной мощности теста исследуемые выборки должны быть не менее 335 человек среди больных детей и 714 человек среди здорового контроля. В тоже время носители аллеля 665С гена MTHFR имеют повышенный риск возникновения глиальных опухолей мозга OR=l,86, р=0,03 (при рассмотрении лог-аддитивной модели OR=l,89, р=0,0051). Мощность теста при данных объемах выборок и величине эффекта составила 44,81%. Для обнаружения эффекта при достаточной мощности теста исследуемые выборки должны быть не менее 140 человек среди больных детей и 547 человек среди здорового контроля. Однако данные результаты теряют значимость при проведении проверки на множественность сравнений.
Среди девочек до 10 лет носители минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 имеют предрасположенность к заболеванию опухолями мозга OR=2,00, р=0,0081 (доминантная модель). Однако результат теряет значимость при проверке на множественность сравнений. Также носители минорного аллеля -27+606G гена CYP1A1 имеют повышенный риск возникновения глиальных опухолей мозга OR=3,ll, р=0,0008 (доминантная модель). При проведении проверки на множественность сравнений данный эффект остается значимым. В отношении опухолей мозга в целом и глиальных опухолей наблюдается усиление эффекта по сравнению с данными, полученными на группе девочек до стратификации.
Гомозиготы по делеций гена GSTM1 имеют повышенный риск возникновения опухолей мозга в целом и глиальных опухолей мозга (OR=l,71, р=0,044 и OR=l,93, р=0,045 соответственно). Данные результаты теряют значимость при проведении проверки на множественность сравнений.
В то же время, гомозиготы по аллелю 225 IT гена XPD имеют предрасположенность к эмбриональным опухолям мозга OR=2,29, р=0,034 (рецессивная модель). Данный результат также теряет значимость при проведении проверки на множественность сравнений. Мощность теста при данных объемах выборок и величине эффекта составила 58,83%. Для обнаружения эффекта при достаточной мощности теста исследуемые выборки должны быть не менее 44 человек среди больных детей и 249 человек среди здорового контроля.
Анализ ассоциаций постлучевых осложнений с исследуемыми генотипами
Выборка больных детей была проанализирована на предмет осложнений лучевой терапии в сопряженности с исследуемыми генотипами. Для этого в исследуемой выборке сравнивались частоты встречаемости генотипов у детей, имевших постлучевые осложнения, и у детей, не имевших таких осложнений. Рассматривались следующие типы осложнений: эпидермит, винкристиновая полинейропатия, эзофагит, заболевания дыхательных путей, синдром Кушинга, миелодепрессия.
В таблице 22 приведены значимые ассоциации постлучевых осложнений с исследуемыми генотипами. В качестве контроля брались облученные дети из этой же выборки, не имевшие осложнений после облучения.
Ассоциацию с исследуемыми генотипами показали только 3 вида осложнений: это винкристиновая полинейропатия, заболевания дыхательных путей, синдром Кушинга. Однако все приведенные в таблице результаты становится не значимыми при проведении проверки на множественность сравнений. В силу этого и в силу того, что выборки детей, имевших постлучевые осложнения, очень малы, невозможно делать выводы об участии исследуемых локусов в развитии постлучевых осложнений.
В данной работе рассматривались аберрации, возникающие в соматических клетках под действием ионизирующего излучения. Возникновение аберраций является цитогенетическим тестом для оценки воздействия излучения на клетки. Осложнения, возникающие при проведении лучевой терапии, также связаны с воздействием излучения на клетки. Следовательно, в основе возникновения осложнений после лучевой терапии и изменения частот аберраций при действии ионизирующего излучения могут лежать общие генетические механизмы.
Аллельные варианты генов первой стадии детоксикации ксенобиотиков, связанные с ростом активности соответствующих ферментов, рассматриваются как неблагоприятный фактор, ассоциированный с мутагенными и канцерогенными эффектами (Баранов и др., 2000). Известно, что замена изолейцина на валин в 462-й позиции у носителей варианта 1384G гена CYP1A1 сопровождается значительным повышением активности фермента (Masson et al., 2005). Однако низкая частота встречаемости аллеля G сайта A1384G (не более 5% для большинства популяций) затрудняет использование этого полиморфизма в ассоциативных исследованиях. В этой связи нами были изучены два сцепленных с ним сайта - Т947+242С и T-27+606G, для которых частота минорных аллелей значительно выше. Отметим, что в глобальном проекте НарМар (http://www.hapmap.org/) данные по сайтам Т947+242С и T-27+606G отсутствуют, однако в работе Киселева с соавторами сообщалось о сцеплении сайтов A1384G и T947+242C (Kisselev et al., 2005). Полиморфизм T947+242C не связан с изменением последовательности аминокислот, однако характеризуется увеличенной индуцибельностью фермента у обладателей генотипа Т/С и С/С (Meletiadis et al., 2006). Сайт T-27+606G находится в первом интроне локуса CYP1A1 и характеризуется значительно более высоким уровнем полиморфизма по сравнению с традиционным для ассоциативных исследований сайтом A1384G.
Для полиморфизма T-27+606G были получены значимые эффекты в работах по гормонально-зависимым опухолям (Figueroa et al., 2008), при изучении уровня метаболитов половых гормонов, которые являются субстратом для CYP1A1 (Sowers et al., 2006), в отношении заболеваемости опухолями мозга (Сальникова и др., 2010), а так же в ассоциативных исследованиях по злокачественным новообразованиям легких (Rotunno et al., 2009). В литературе обсуждается вопрос о разнонаправленном влиянии аллельных вариантов -27+606G и -27+606Т на регистрируемые эффекты в экологически неблагоприятных условиях (промышленное загрязнение воздуха, курение) и при отсутствии таковых. В первом случае протективным вариантом является -27+606Т, во втором - -27+606G (Rotunno et al., 2009; Wang et al., 2008). В отношении экспрессии гена наблюдается аналогичная закономерность: у курильщиков экспрессия CYP1A1 повышена при -27+606G, а у некурящих - при носительстве мажорного аллеля 27+606Т (Rotunno et al., 2009). В настоящей работе увеличение частоты индуцированных хромосомных аберраций ассоциировано с мажорным вариантом -27+606Т. Исходя из литературных данных, это можно объяснить отсутствием специфической индукции CYP1A1 при облучении in vitro крови здоровых добровольцев. В этом случае большей индуцибельностью, сопряженной с повышенным образованием промежуточных электрофильных метаболитов, обладает вариант -27+606Т.
Однако при изучении последствий постлучевой терапии у детей не было выявлено ни отрицательного, ни положительного влияния этого аллеля. В тоже время данные других авторов показывают, что у подростков, проживающих в экологически неблагоприятных условиях в Кемеровской области и подвергающихся комплексному воздействию высоких доз радона, уровень хромосомных аберраций был выше у обладателей минорных аллелей гена 1 фазы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1 (Минина и др., 2009).
Наряду с этим в работе Васильева с соавторами не было обнаружено взаимосвязи полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 с частотой хромосомных аберраций у рабочих уранового производства, хотя у носителей делеционных вариантов обоих генов частота цитогенетических нарушений была повышена (Васильева и др., 2010).
В отношении гена RAD51 известно, что замена гуанина на цитозин приводит к увеличению активности Rad51 и учащению гомологичной рекомбинации (Nogueira et al., 2011). Известно, что пониженная экспрессия этого гена приводит к гиперчувствительности клетки к ионизирующему излучению. Нами была рассмотрена однонуклеотидная замена, в результате которой происходит увеличение активности данного гена. При повышении экспрессии данного гена возрастает его репарационная активность. Клетки с повышенной экспрессией RAD51 менее подвержены радиационно-индуцированным транслокациям, чем клетки с нормальной или низкой экспрессией RAD51 (Grandy et al., 2002). Также в клетках с повышенной экспрессией RAD51 частота повреждений ДНК и хромосомных аберраций ниже, чем в клетках с нормальной или низкой экспрессией RAD51 (Raderschall et al., 2002; Sak et al., 2005). Клетки с повышенной экспрессией RAD51 более устойчивы е ионизирующему излучению (Vispe et al., 1998). Данные факты могут объяснить понижение количества дицентриков среди индивидов имеющих функционально более активный аллель гена RAD51.
К сожалению, нам не удалось выявить сходных тенденций в развитии осложнений связанных с проведением лучевой терапии и цитогенетическими изменениями, связанными с облучением клеток здоровых добровольцев in vitro.
Это может быть связано как с разницей в условиях проведения эксперимента в двух выборках (клетки крови добровольцев облучались in vitro, а кровь, собранная у детей прошедших лучевую терапию была облучена in vivo). Второй причиной наблюдаемых различий может быть наличие у детей находящихся на лечении сопровождающей медикаментозной терапии, хотя врачи считают воздействие, сопровождающей терапии при облучении, незначительным. Третьей причиной этих отличий может быть возраст испытуемых и различные механизмы начинающие действовать в клетках человека при достижении определенного возраста. Еще одной причиной, способной повлиять на результаты, полученные в выборке облученных детей, является немногочисленность этой выборки.
