Содержание к диссертации
Введение
I. Введение и актуальность темы. 5
II. Обзор литературы. 10
1. Аутистические расстройства, частота аутизма. 10
2. Аутизм и хромосомные аномалии. 14
II.3. Аутизм и гетерохроматиновые варианты . 18
II.4.Аутизм и нестабильность хромосом.
5. Аутизм при моногенных синдромах. 24
6. Поиск генов-кандидатов при аутизме. 25
7. Вариации генома и аутизм. 32
8. Аутистические расстройства и хромосомный мозаицизм. 44
8.1. Мозаицизм и анеуплоидия аутомосом . 49
8.2.Фенотипические признаки, ассоциированные с конституциональным мозаицизмом 51
8.3. Соматическая анеуплоидия аутосом. 52
9. Исследования членов семей детей с аутистическими расстройствами. 54
10. Заключение 56
Материалы и методы. 57
1. Цитогенетические методы. 57
1.1. Культивирование лимфоцитов периферической крови. 57
1.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер. 57
1.3. G-окрашивание хромосом (GTG). 58
1.4. С-окрашивание хромосом (СBG). 60
1.5. Принципы анализа хромосомных препаратов . 61
2. Молекулярно-цитогенетические мет оды. 62
2.1. Приготовление ДНК проб – ДНК-полимеразная реакция замещения (ник трансляция). 62
2.2. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). 63
2.2.1. Принцип анализа флюоресцентных сигналов после проведения гибридизации in situ. 67
2.3. Сравнительная геномная гибридизация (СGH). 67
2.4. Биоинформатический анализ. 70
3. Статистическая обработка данных. 70
IV. Результаты и обсуждение. 71
IV.1. Цитогенетические и молекулярно-цитогнетические исследования в группе детей с аутизмом (204 чел.). 71
IV.1.1. Численные и структурные аномалии хромосом в группе детей с аутизмом (204 пациента). 71
IV.1.2. Молекулярно-цитогенетические исследования в группе детей с аутизмом (204 чел). 79
IV.1.3. Гетерохроматиновые варианты в группе детей с аутизмом (n=204). 82
IV.2. Исследования хромосомного мозаицизма в группе детей с аутизмом (116
человек). 85
IV.3. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования в группе матерей детей с аутизмом. 91
V.Заключение. 109
VI.Выводы.
VII.Список литературы. 113
- Аутизм и гетерохроматиновые варианты
- Мозаицизм и анеуплоидия аутомосом
- Принципы анализа хромосомных препаратов
- Молекулярно-цитогенетические исследования в группе детей с аутизмом (204 чел).
Аутизм и гетерохроматиновые варианты
Аутизм – сложный симптомокомплекс нарушений психики, основным компонентом которого можно назвать отстранённость пациента от внешнего мира и, как правило, резкое неприятие им любых «вмешательств» этого внешнего мира в его внутренний мир, только в котором пациент чувствует себя комфортно. Круг интересов больного резко сужен, нарушены или отсутствуют контакты даже с самыми близкими людьми; часто наблюдаются стереотипные, бессмысленные, бесцельные или даже разрушительные действия.
Термин «аутизм» предложен швейцарским психиатром Э. Блёйлером в 1911 г. (Bleuler, 1911). Аутизмом он назвал клиническую картину «особого типа шизофрении», состоящую в уходе больного в мир собственных фантазий. Первое описание аутизма как синдрома было предоставлено американским врачом Л. Каннером в 1943 г (Kаnner, 1943). Независимо от него австрийский психиатр Х. Аспергер описал состояние аномального поведения в группе подростков, проявляющееся в нарушении социального общения и коммуникации, названном им «аутистическая психопатия». Аутизм был выделен из группы нозологий умственной отсталости, и этот диагноз стал применяться и по отношению к детям с ненарушенным интеллектом. Впоследствии этот диагноз стали присваивать также детям с задержкой психоречевого развития и поведенческими аномалиями в случае соответствия их клинической картины критериям аутизма. По современным данным, умственная отсталость наблюдается в той или иной степени у большинства больных с аутистическими расстройствами (70-90%) (Kаnner, 1943; Башина, 1999; Jоhnsоn et аl., 2007; Hughes, 2008).
В настоящее время наличие у пациента аутистических проявлений определяют по различным шкалам, например, САRS (Сhildhооd Аutism Rаting Sсаle) (Sсhорler et аl., 1993). Конечно, важным аспектом диагностики являются и сведения, полученные от родителей пациентов при использовании определённых схем опросов (Stоne, Hоgаn, 1993). Основные клинические международные критерии аутизма состоят в следующем: 1) нарушение контакта с окружающими вплоть до полного отсутствия потребности в нём и даже намеренное, упорное избегание любого такого контакта, стремление к одиночеству, отсутствие дифференцировки одушевлённых и неодушевлённых объектов (протодиакризис); нередка ситуация «проводника», когда пациент выбирает кого-то из окружающих, часто свою мать, и поддерживает контакты с окружающим миром через этого своего избранника, только его воспринимая как значимый источник информации об окружающем мире и как единственный объект общения (Smith L.E. et аl., 2008); 2) патология эмоционального реагирования, вплоть до полного безразличия (феномен «аффективной блокады»), неумение использовать и распознавать мимическую экспрессию и невербальные акты коммуникации (собственная мимика отсутствует или крайне скудна, жесты, как правило, вытесняются стереотипными движениями; больной не может дифференцировать чужие жесты и мимику) (Sрeziо et аl., 2007); 3) патология развития органов чувств в виде изменения порога реакций на сенсорные стимулы; реакции недостаточны или аффективны, иногда резкие стимулы могут вызывать физическую боль или наоборот, не вызывать реакции вообще (псевдоглухота, псевдослепота), часто наблюдается аномально бурная отрицательная реакция на тактильные стимулы; 4) аномалии зрительного поведения: избегание глазного контакта, «бегающий» взгляд, фрагментарность зрительного внимания с преобладанием восприятия на периферии поля зрения; 5) разнообразные нарушения речи, прежде всего её коммуникативной функции: эхолалии, аномальное построение фраз, редукция лексикона и использование обрывков слов, характерно при разговоре о себе использование 2-го или 3-го лица и глаголов в безличной форме, использование неологизмов, изменения тональности и громкости речи; возможен регресс речевых навыков до их полной утраты; нередко отмечаются как мотивированные, так и немотивированные невербализованные громкие вокализации неясной эмоциональной окраски; 6) выраженное снижение интеллекта у 70-90% детей, часто парциальное; некоторые (впрочем, очень немногие) пациенты могут проявлять незаурядные способности в различных видах интеллектуальной деятельности (абсолютная, но избирательная память, высокая грамотность, лёгкость математических операций), при этом сохраняя основные клинические признаки аутизма; 7) стереотипность поведения, скрупулёзное стремление к сохранению привычных условий и обстановки, боязнь всего нового, поглощённость однообразными бессмысленными стереотипными движениями и действиями; 8) нарушения игровой деятельности, выражающиеся в постепенной утрате игровых навыков с переходом к однообразным, стереотипным манипуляциям, часто с предметами неигрового назначения; неспособность играть с другими детьми; попытки переключить ребёнка на продуктивную деятельность чаще всего вызывают аффективные протестные реакции; 9) асинхронность развития при явном отставании в моторном развитии с характерными аномалиями походки (ходьба на цыпочках), безостановочной ходьбой по кругу и стереотипными движениями рук (встряхивание кистями, хлопки ими по телу и т.п.); 10) извращение сна и аппетита (некоторые пациенты могут утрачивать чувство голода, одинаково безразличны к разным видам пищи, если едят, то плохо жуют, глотают крупными кусками, могут вовсе отказываться от пищи; сон короткий и в необычное время суток); 11) возможны проявления аутоагрессии при очевидном снижении болевой чувствительности (укусы собственных кистей и т.п.); 12) не менее чем у 25% детей с выраженными симптомами аутизма при электроэнцефалографическом исследовании обнаруживается эпилептиформная активность или даже отмечают эпилептические приступы (хотя некоторые исследователи склонны считать, что, наоборот, у многих больных с эпилепсией наблюдаются признаки аутизма) (Башина, 1999; Vоlkmаr, Раuls, 2003; IСD-10; DSM-IVR; Miles et аl., 2008; Dinstein et аl., 2011).
Диагностика аутизма проводится по современным диагностическим системам – Международной классификации болезней (IСD-10) и Диагностико-статистическому справочнику психических нарушений (DSM-IVR). В этих системах аутизм относят к категории первазивных (общих) расстройств развития. В данную категорию, помимо аутизма, включают также синдром Аспергера, синдром Ретта, дезинтегративное расстройство, атипичный аутизм. Отдельно описано гиперактивное расстройство, сочетающееся с умственной отсталостью и стереотипиями.
Ранняя диагностика аутизма и выяснение причин болезни чрезвычайно значимы, поскольку на современном этапе развития медицины и психологии уже существуют методы лечения данной патологии, которые совместно с правильной психолого-педагогической коррекцией часто дают значительные положительные результаты, что позволяет этим детям частично или полностью адаптироваться в социуме (Морозова С.С., 2010), иногда обнаруживая одарённость в отдельных областях знаний или искусства (Stоne, Hоgаn, 1993). Напротив, пациенты с заболеваниями аутистического спектра при отсутствии диагностики и применения адекватных методов лечения и коррекции в большинстве своём деградируют и становятся необучаемыми и неадаптируемыми, патологические проявления у них усиливаются (Гуровец, 2008; Лебединская, Лебединский, 2011; Hu-Linсe et аl, 2005). Трудности диагностики состоят и в том, что в раннем возрасте (до 2,5 лет) симптоматика аутизма выражена слабо, а родители таких детей, как правило, довольно поздно замечают проявления аутизма и даже при выраженных симптомах не сразу обращаются к специалистам.
Мозаицизм и анеуплоидия аутомосом
Авторы совместили данные об обоих видах СNV с целью найти те участки, в которых унаследованные события перекрывали de nоvо СNV. Поскольку две эти подборки довольно разрозненны, авторы полагали маловероятным делать далеко идущие выводы по специфическим локусам.
Кроме того, что исследования были нацелены на редкие варианты, которые наследуются доминантно, отмечено документально, что некоторые случаи аутизма могут быть результатом комбинированного действия рецессивных аллелей. Ввиду этого геномы пробандов и их сибсов были просканированы для поиска редких гомозиготных делеций, которые были в обоих аллелях. Были найдены две делеции, обе у пробандов. Одна из них привела к разрыву СОMMD1 в участке 2р15 у девочки. Гомозиготная потеря этого гена вовлечена в медный токсикоз у собак, но ранее не описывалась у человека. Первоначально делеция была расценена как de nоvо; затем, при дальнейшем обследовании, выяснилось, что отец, а не мать, оказался носителем гемизиготной делеции. Однако точки гомозиготной потери у ребёнка точно совпали с точками гемизиготной потери у отца, что заставило заподозрить, что данное наблюдение – редкий, распознанный случай унипарентальной дисомии хромосомы 2. Затем УПД была подтверждена. Вторая редкая гомозиготная делеция обнаружена у мальчика-пробанда и привела к разрыву САСNА2D4 (12р13.33). Оба родителя оказались гемизиготами. Данный ген кодирует зависимый от напряжения кальциевый канал клеточной мембраны. Хотя пока не известны ассоциированные с аутизмом гомозиготные мутации гена САСNА2D4, дефекты САСNА1С известны как базис синдрома Тимоти, редкого заболевания, среди симптомов которого есть признаки аутизма. Авторы обнаружили de nоvо делецию двух генов, разорвавшую САСNА1B, кодирующий ещё один кальциевый канал, и трансмиссию редкого варианта САСNА1С (дизруптивной интрагенной дупликации) в одной из семей.
Итак, de nоvо СNV обнаружены у 8% детей с аутизмом и только у 2% их здоровых сибсов (Szаtmаri et аl., 2007), что схоже с результатами других исследований. Можно с известной долей уверенности утверждать, что большинство de nоvо СNV хотя бы частично участвуют в формировании аутизма. Кроме того, de nоvо события могут быть признаком нестабильности генома, что может также вести к возникновению болезни, хотя ряд частностей говорят против этого второго утверждения. Авторы попытались сформировать основы генетической теории аутизма, для чего рассматривались различные «асимметрии» в возникновении и наследовании СNV: 1) отмечена более высокая частота de nоvо мутаций у детей с аутизмом из простых семей по сравнению с их сибсами; 2) частота таких мутаций у детей с аутизмом из простых семей выше, чем у детей с аутизмом из сложных семей; 3) при наследовании редких вариантов дупликации значительно превосходят числом делеции; 4) de nоvо делеции значительно преобладают над дупликациями у детей с аутизмом; 5) отклонения наблюдаются в семьях, где здоровый сибс – мальчик; 6) аутизм у девочек выявляется реже; 7) среди аутистов с de nоvо СNV большую часть составляют девочки, и их СNV больше размером. Эти «асимметрии» могут объясняться правдоподобной генетической теорией: de nоvо мутации высокой степени пенетрантности явно ведут к формированию аутизма, более всего в семьях с низким риском; в семьях с высоким риском генетика трансмиссии играет большую роль. Делеции, скорее всего, более патогенны по сравнению с дупликациями. Если мутация есть у здорового родителя, то это, скорее всего, дупликация. Девочки более резистентны к манифестации аутизма, чем мальчики, и крупные СNV чаще наблюдаются у больных девочек, поскольку такие изменения более патологичны, так как генов-мишеней, вызывающих аутизм, у девочек, вероятно, меньше, чем у мальчиков. Половой диморфизм в развитии головного мозга может объяснить относительную малочисленность девочек с аутизмом. При сравнении с мальчиками у девочек отмечена акселерированная шкала времени по многим важным этапам развития когнитивных функций; например, более раннее появление первых самостоятельно произносимых слов. Более быстрое развитие может быть отражением лучшей защищённости девочек. Есть, однако, одна особенность: если девочки обладают повышенной сопротивляемостью к аутизму, а дети с аутизмом – пониженной плодовитостью, то тогда простая генетическая теория скажет нам, что матери должны быть чаще носителями аллелей риска по сравнению с отцами; но не видно отклонения в распределении между родителями происхождения унаследованных ультраредких мутаций. Однако полностью отказываться от этой гипотезы нельзя. Как отмечено, среди предположительно патогенных СNV унаследованных – 7%, а среди них 75% унаследованы от матерей (Mоrrоw et аl., 2008). Кроме того, нет долгосрочных исследований детей с аутизмом, и нельзя точно утверждать, что у мальчиков будет снижена плодовитость. Как бы там ни было, роль женщин с генотипом высокого риска остаётся проблемой, требующей размышлений. Женщины с генотипом высокого риска могут испытывать проблемы со здоровьем в пожилом возрасте, и эти проблемы могут возникать как иная диагностическая категория. Если это так, то данное заболевание, скорее всего будет распределяться по полу в иной манере в отличие от аутизма, например, как это бывает при аnоrexiа nervоsа. Достоверность этой генетической теории во многом будет зависеть от доминантных генетических вариантов вариабельной пенетрантности; данная теория, по мнению авторов, может объяснить генетический базис большинства, но не всех, случаев аутизма. Например, в одном из исследований была показана роль рецессивных мутаций у индивидов, родившихся в результате кровнородственных браков. В данном же исследовании обнаружен только 1 случай редкой гомозиготной делеции.
Самой необычной находкой во всех исследованиях de nоvо мутаций у детей с аутизмом оказалось большое число ясно отличимых локусов-мишеней. Даже отметая часть таких событий как случайные, авторы столкнулись с необычно большим числом локусов-мишеней и только очень небольшим числом случаев рекуррентности. Только СNV в 16р11.2 найдены более чем в 1% случаев (10 из 858 детей). Авторы скомбинировали результаты двух больших исследований и обнаружили 39 совпадений (перекрываний) в 12 рекуррентных локусах при 121 СNV. Исключив локус 16р11.2 как высокорекуррентный и остальных СNV как случайные, авторы получили 11 рекуррентных локусов с 80 случаями СNV. Можно предположить, что таких локусов должно быть 250 -300, а может быть и более того. Предположительно один ген на три рождения подвергается мутации; частота аутизма среди мальчиков достигает 1:100; по предложенной генетической модели половина случаев аутизма – следствие новых мутаций, при этом некоторые такие мутации обладают высокой пенетрантностью, что доказывается наблюдениями доминантного наследования в сложных семьях.
Исследования СNV для установления корреляций «фенотип-генотип» могут быть осложнены многими факторами. Потери и дополнительный материал, охватывающий несколько генов в одном и том же локусе (таком, как локусы 16р11.2 и 1q21.1), могут вести к перекрыванию (смешению) фенотипов либо же к разным фенотипам, иногда с различной пенетрантностью. В крупных родословных с аутизмом вариации числа копий (например, в локусах 16р11.2 и 22q11.2) обнаружены у некоторых больных сибсов, а у других – нет, что предполагает модель порогового значения для склонности к заболеванию (Сhristiаn et аl., 2008). Проведённое сравнение вариаций числа копий у монозиготных близнецов указывает на возможность соматических событий, вызывающих мозаицизм в различных тканях (таких, как мозг) с возможным влиянием на фенотип.
Принципы анализа хромосомных препаратов
Структура хромосомной патологии в данной группе детей с аутизмом показывает, что: 1) В данной когорте обследованных детей отсутствуют случаи делеций больших участков хромосом, обнаружимые при стандартном цитогенетическом исследовании, что может быть объяснено тем, что, как правило, у детей с делециями клинические проявления значительно тяжелее, чем при транслокациях и некоторых численных аномалиях хромосом (например, при анеуплоидиях половых хромосом), и даже если предположить наличие аутизма у таких детей, то тестирование их по шкалам практически невозможно из-за общей тяжести психоневрологического статуса; 2) причиной формирования аутизма у детей могут быть разнообразные цитогенетические аномалии с участием практически всех хромосом (за исключением некоторых видов аномалий половых хромосом), что ещё раз подтверждает мультифакторную природу аутизма.
Полученные результаты в данной группе детей с аутизмом в целом согласуются с данными других подобных исследований (Ворсанова, Юров 1999а; Bill, Gesсhwind, 2009). Структура хромосомной патологии и частота цитогенетических аномалий указывают на необходимость проведения в случае нормального кариотипа дополнительных молекулярно-цитогенетических исследований (сравнительной геномной гибридизации – сgh и её серийной вариации – аrr сgh) для обнаружения возможных малых хромосомных аномалий, которые невозможно обнаружить стандартными цитогенетическими методами, что позволит значительно увеличить эффективность хромосомной диагностики в когорте детей с аутизмом. Обнаружение структурных и численных аномалий различных хромосом в когорте детей с аутизмом очевидно указывает на гетерогенную природу аутистических расстройств с участием многих генов, регулирующих развитие и деятельность нервной системы, в особенности высшие психические функции головного мозга.
Молекулярно-цитогенетические исследования в группе детей с аутизмом (204 чел.). Из группы детей с аутизмом и нормальным кариотипом были выбраны дети, клинические проявления (выраженная умственная отсталость, пороки и множественные микроаномалии развития) у которых позволяли предположить наличие малых (субмикроскопических) аномалий хромосом. Таким детям (n=11) была проведена сравнительная геномная гибридизация (СGH). В результате проведения СGH у 5 детей из 11 была обнаружена хромосомная патология (4 субмикроскопические делеции и 1 дупликация). На рис.9 представлен пример использования метода HR СGH. Обнаружена микроделеция (около 1 млн. п.н.) хромосомы 22 у мальчика 6 лет с аутизмом и
1) данный метод весьма эффективен для поиска субмикроскопических хромосомных аномалий в когорте детей с аутистическими расстройствами и отсутствием цитогенетических аномалий при стандартном кариотипировании;
2) чаще встречаются делеции малых участков хромосом, что говорит об их большей патогенности по сравнению с микродупликациями (возможно, что некоторые дупликации относительно небольших участков хромосом не являются патогенными, так что их носители могут не попадать в поле зрения генетиков и психиатров ввиду слабости проявления патологических признаков или отсутствия таковых).
Кроме того, результаты стандартных цитогенетических исследований заставили предположить у некоторых пациентов наличие мозаичной анеуплоидии хромосом (у таких пациентов были обнаружены единичные анеуплоидные клетки). Таких пациентов было 11, всем им была проведена флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). У 8 из 11 пациентов была подтверждена хромосомная патология в виде анеуплоидии хромосом, в основном в виде мозаичной анеуплоидии половых хромосом (гоносом). Случаи хромосомной патологии, обнаруженной методом FISH, представлены в таблице 8.
Высокая частота различных находок при применении FISH показывает эффективность применения этого метода для уточнения точек разрыва при сложных структурных перестройках, а также для обнаружения скрытого (малопроцентного) мозаицизма при анеуплоидиях различных хромосом, чаще всего – гоносом. Как известно, помимо численных аномалий (трисомий) хромосом 13, 18 и 21, чаще всего у живорождённых обнаруживают численные аномалии гоносом, поскольку при численных аномалиях других аутосом такие эмбрионы погибают почти в 100% случаев. Скрытый (малопроцентный) мозаицизм может отличаться долей аномальных клеток, например, в клетках крови доля аномальных клеток мала, а в клетках других тканей и органов эта доля больше либо такие клетки отсутствуют вовсе. Этот обнаруженный нами феномен требует дальнейших исследований на различных образцах клеток человека, например, в фибробластах, буккальном эпителии и других. Уже существуют данные о наличии малопроцентного мозаицизма в клетках головного мозга при шизофрении, атаксии-телеангиэктазии и других психических и нервных заболеваниях (эти данные получены в результате исследований постмортальных тканей) (Тиганов и др., 2012).
Итак, у 22 детей после проведения стандартного цитогенетического исследования определены показания для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики методами FISH и СGH. СGH проводили тем детям, у которых клиническая картина предполагала наличие хромосомной аномалии (выраженная умственная отсталость, пороки развития), но стандартное цитогенетическое исследование не выявило хромосомных перестроек. СGH провели 11 чел (6,4%), патология найдена у 5 чел (2,5%).
FISH исследования проводились для подтверждения хромосомного мозаицизма (например, при обнаружении 1-2 клеток с анеуплоидией хромосомы Х (45,Х/47,XX) из 20 обследованных клеток) или для определения точек разрыва при транслокациях. FISH провели 11 чел (5,4%), патология обнаружена у 8 чел (4%). Таким образом, оба молекулярно-цитогенетических метода исследований показали высокую эффективность в обнаружении скрытых хромосомных перестроек и аномалий.
Молекулярно-цитогенетические исследования в группе детей с аутизмом (204 чел).
В настоящий момент роль генетических факторов в возникновении большинства случаев психических болезней и нарушений психоречевого и психомоторного развития у детей не вызывает сомнения. Изучение генетических перестроек и аномалий при различных психических заболеваниях у детей - одно из наиболее актуальных направлений в современной психиатрической генетике и биологической психиатрии.
Известно, что хромосомные перестройки и аномалии являются наиболее частой формой наследственной патологии у детей. Поиск различных специфических и неспецифических хромосомных аномалий и вариаций у детей с психическими заболеваниями является необходимым этапом диагностических исследований. Хромосомные аномалии являются причиной нарушения генного баланса и функциональной активности генома клетки, эпигенетических изменений, связанных, по-видимому, с эффектом положения генов, и часто инициируют патологические процессы в клетках головного мозга.
Современные цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования, направленные на идентификацию хромосомных аномалий среди детей с психическими заболеваниями, позволят не только выявить те или иные численные и структурные аномалии, но и картировать гены психичнских болезней, что необходимо в решении актуальных задач современной медицинской генетики.
Сложный феномен нестабильности генома может лежать в основе патогенеза наследственных нервных и психических заболеваний, в том чиле и аутизма. Актуальность исследований генома очевидна и заключается в том, что с помощью цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов можно провести детальный анализ структурных особенностей генома в группе лиц с аутизмом для обнаружения возможных генетических причин патологических проявлений, входящих в перечень признаков данного заболевания. Нами было проведено исследование с помощью данных методов в группах детей с аутизмом и матерей таких детей, что позволило выявить причину части случаев аутизма.
Таким образом, после проведения цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований в когорте детей с аутизмом и в группе матерей таких детей было обнаружено, что во всех 3 исследованных группах встречаются с частотой, большей чем в общей популяции, численные и структурные хромосомные аномалии, а также гетерохроматиновые (хромосомные) варианты хромосом.
В первой группе детей с аутизмом обнаружены хромосомные аномалии в 8,3% случаев, что превышает частоту аномалий в общей популяции (1%), и примерно равно частоте хромосомных аномалий в когорте детей с умственной отсталостью. Среди обнаруженных в I группе детей с аутизмом (204 чел) встречались как разнообразные структурные аномалии хромосом в виде транслокаций, инверсий эухроматина, дополнительного материала на хромосоме (аdd), маркерных хромосом, кольцевой хромосомы 22, так и численных аномалий, чаще хромосомы Х; отмечен совершенно уникальный случай, где у мальчика с аутизмом найдена сложная хромосомная аномалия, сочетающая в себе структурную перестройку в виде псевдоизодицентрической хромосомы Y с численной мозаичной аномалией в виде потери и удвоения данной перестроенной хромосомы Y. Заметно полное отсутствие среди разнообразных хромосомных аномалий в данной группе делеций больших участков хромосом, что может быть объяснено большой патогенностью таких делеций, «маскирующей» черты аутизма у таких пациентов, то есть пациенты с делециями больших участков хромосом не могут быть оценены по шкалам аутизма из-за тяжести клинических проявлений.
Впервые был определён удельный вес хромосомных, или гетерохроматиновых, вариантов в большой группе детей с аутистическими проявлениями. Хотя и во многих исследованиях эти варианты гетерохроматина изучались в различных группах пациентов, но эти исследования не были так уж многочисленны, а в последнее время проводились всё реже из-за кажущейся некоторым исследователям их бесперспективности. Частота изолированных и сочетанных вариантов, как оказалось, более чем в 9 раз превышает частоту гетерохроматиновых вариантов в общей популяции, что позволяет выдвинуть гипотезу об определённой роли гетерохроматиновых вариантов в генезе аутизма. Эта проблема требует дальнейшего всестороннего изучения с применением различных современных методов.
Следует отметить, что большую долю (50-60%) хромосомных аномалий у новорождённых составляют численные аномалии хромосом (Iоurоv et аl., 2006; Jасоbs, Hаssоld, 1995). При аномалиях такого рода возможна эффективная цитогенетическая диагностика, но мозаичные формы анеуплоидий сложны для обнаружения этим методом. Выявление «скрытого» хромосомного мозаицизма с помощью молекулярно-цитогенетических методов позволяет проводить более эффективную медико-генетическую консультацию семьям, где есть дети с генетическими заболеваниями. Кроме того, применение молекулярно-цитогенетических технологий позволяет более корректно определить частоту численных хромосомных аномалий в онтогенезе. Для выявления хромосомного мозаицизма нами проведены исследования с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) во всех трёх группах: 1) в 1-ой группе той части пациентов, где FISH-метод был необходим для уточнения хромосомной патологии; 2) во 2-ой группе детей с аутизмом из 116 человек для поиска возможного хромосомного мозаицизма; 3) в группе матерей детей с аутизмом для поиска мозаицизма хромосомы Х.
Во всех исследованных группах в части случаев хромосомный мозаицизм подтвержден. В группе детей с аутизмом из 116 пациентов, отобранных для поиска скрытого хромосомного мозаицизма, были обнаружены случаи не только мозаицизма хромосомы Х, но и случаи малопроцентного мозаицизма различных аутосом, причём уровень такого мозаицизма превышал стохастический. Как известно, подобный малопроцентный мозаицизм обнаруживают и при других заболеваниях в клетках различных тканей человека (буккальный эпителий, головной мозг). Весьма интересным представляется обнаружение у довольно внушительной части группы матерей детей с аутизмом малопроцентного хромосомного мозаицизма, причём не только хромосомы Х, но и некоторых аутосом. Вероятно, в части таких случаев дети с аутизмом наследовали склонность к аутизму. Таким образом, хромосомный мозаицизм – новый генетический фактор мозаицизма.
Части пациентов проводили молекулярно-цитогенетические исследования методом сравнительной геномной гибридизации. Подбор пациентов для этих исследований основывался на наличии у них выраженной умственной отсталости, множественных микроаномалий развития и других соматических нарушений. Данный метод показал высокую эффективность в обнаружении субмикроскопических хромосомных перестроек, которые невозможно обнаружить обычными методами микроскопии.
