Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Норовирусная инфекция 9
1.1.1. История открытия норовирусов 9
1.1.2. Патогенез норовирусной инфекции 11
1.1.3. Клиническая картина норовирусной инфекции 12
1.1.4. Осложнения норовирусной инфекции 14
1.1.5. Лечение норовирусной инфекции 14
1.2. Структурная организация норовирусов 16
1.2.1. Морфология вирионов норовирусов 16
1.2.2. Организация генома норовирусов 17
1.2.3. Свойства и функции неструктурных белков норовирусов 19
1.2.4. Структура и вариабельность главного белка капсида 22
1.3. Классификация калицивирусов 25
1.4. Эпидемиология норовирусной инфекции 30
1.4.1. Методы и подходы для детекции норовирусов 30
1.4.2. Генотипирование норовирусов 33
1.4.3. Преобладающие генетические варианты норовирусов 35
1.4.4. Пути и механизмы передачи норовирусов 37
1.4.5. Распространенность норовирусной инфекции 40
1.4.6. Вспышечная и спорадическая заболеваемость 42
1.4.7. Норовирусы как антропозоонозная инфекция 43
1.4.8. Сезонность норовирусной инфекции 45
1.4.9. Возрастные особенности норовирусной инфекции 46
1.4.10. Исследование норовирусов в РФ 47
2. Материалы и методы 50
2.1. Общая характеристика исследования 50
2.2. Материалы 50
2.3. Методы 52
2.3.1 Формирование базы данных 52
2.3.2. Забор материала 52
2.3.3. Получение осветленного экстракта фекалий 53
2.3.5. Синтез комплементарной ДНК 54
2.3.7. Электрофоретический анализ образцов 55
2.3.8. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 56
2.3.9. Определение нуклеотидных последовательностей 56
2.3.10 Филогенетический анализ 57
3. Результаты 58
3.1. Оценка встречаемости норовирусной инфекции у детей в Новосибирске 58
3.2. Норовирусная инфекция у детей раннего возраста Новосибирска с 2005 по 2008 гг 60
3.2.1. Организация исследования 60
3.2.2. Значимость норовирусов в этиологической структуре ОКИ 62
3.2.3 Встречаемость норовирусов в сочетании с другими патогенами 64
3.2.4. Исследование сезонности норовирусной инфекции 66
3.2.5. Анализ возрастных особенностей норовирусной инфекции 71
3.2.6. Клинические особенности норовирусной инфекции 74
3.2.7 Генотипирование и филогенетический анализ изолятов норовирусов 78
Заключение 96
Выводы 98
- Структурная организация норовирусов
- Классификация калицивирусов
- Норовирусная инфекция у детей раннего возраста Новосибирска с 2005 по 2008 гг
- Клинические особенности норовирусной инфекции
Введение к работе
Острые кишечные инфекции (ОКИ) являются одной из важных проблем современного здравоохранения во всем мире. В течение длительного времени возникновение кишечных инфекций связывали с употреблением загрязненной воды и продуктов питания, и ОКИ считались проблемой развивающихся стран, в которых источники водоснабжения и пищевые продукты могут стать причиной масштабных вспышек кишечных инфекций (Parashar U. D. et al., 2003; Steele A. D. et al., 2003; Bresee J. et al., 2004). Однако, несмотря на постоянное улучшение качества питьевой воды и продуктов питания, а также строгий санитарно-эпидемиологический контроль за объектами окружающей среды, и в экономически развитых странах проблема кишечных инфекций стоит достаточно остро (de Wit М.А. et al., 2007; Marvin H. et al., 2009). Как в России, так и в США случаи заболевания кишечными инфекциями занимают одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, уступая по распространенности лишь инфекциям респираторного тракта.
ОКИ проявляются в виде острых гастроэнтеритов, основными симптомами которых, как правило, являются тошнота, рвота, диарея, сопровождающиеся обезвоживанием. Эти симптомы наиболее тяжело переносятся детьми раннего возраста, у которых вследствие незрелости системы гомеостаза наиболее часто возникают угрожающие жизни состояния. По данным ВОЗ, около 700 миллионов случаев ОКИ регистрируется в мире ежегодно у детей младше 5 лет. Смертность, ассоциированная с гастроэнтеритами, составляет 5-7 миллионов человек ежегодно.
В связи с развитием и усовершенствованием средств диагностики спектр известных патогенов - возбудителей ОКИ постоянно расширяется, и в настоящее время значительную часть из них составляют вирусные патогены: ротавирусы групп А, В, С, астровирусы серотипов 1-8, аденовирусы типов 40, 41, норовирусы и саповирусы, входящие в семейство калицивирусов, энтеровирусы и другие (Atmar R. L. et al., 2001; Maltezou H. С. et al., 2001; Koopmans M. et al., 2002; Koopmans M. et al., 2004; Carter M. J. et al., 2005). Наименее изученными из них являются калицивирусы. Это связано со значительными трудностями культивирования этих вирусов (Duizer Е. et al., 2004), а также с отсутствием адекватной модели заболевания на животных. Тем не менее, благодаря развитию и усовершенствованию молекулярно-биологических методов диагностики достигнуты значительные успехи в изучении патогенеза и эпидемиологии калицивирусной инфекции.
Семейство Caliciviridae состоит их четырех родов, патогенными для человека являются представители родов Norovirus и Sapovirus, при этом наиболее часто в клинических образцах от больных выявляются норовирусы. Их распространенность при спорадической заболеваемости составляет 10-15 % от всех случаев ОКИ (Buesa J. et al., 2002; Bon F. et al., 2005), однако норовирусы играют важную роль в возникновении вспышек этого заболевания. Так, 60-85 % вспышек гастроэнтеритов в США, Европе и Японии ассоциированы с норовирусами (Fankhauser R. L. et al., 2002; Lopman В. et al., 2003; de Wit M. A. et al., 2007). С 1997 no 2000 гг. из 233 вспышек кишечных инфекций, зарегистрированных в CDC (США, Атланта), в 86 % (201 вспышка) выявлялись норовирусы (Fankhauser R. L. et al., 2002). Описаны также вспышки ОКИ, вызванные и другими представителями семейства калицивирусов -саповирусами (Phan Т. G. et al., 2006).
В России показатели заболеваемости от ОКИ ниже, чем в развитых странах. Вероятно, это объясняется недостаточной диагностикой и регистрацией этой инфекции. По данным Федерального Центра Госсанэпиднадзора, в 2007-2008 гг. в РФ официально регистрировалось более 650 тыс. случаев ОКИ в год. При этом этиология кишечных заболеваний была установлена только у 28 % пациентов, из них более половины являлись детьми до 14 лет (. Санитарно-эпидемиологический контроль над норовирусной инфекцией вследствие ограниченности средств диагностики в России не проводится.
Среди существующих прямых методов выявления вирусных возбудителей ОКИ наиболее перспективным является подход с использованием полимеразной цепной реакции. Учитывая, что систематические исследования этиологической значимости норовирусов, вызывающих ОКИ, а также их генотипическая характеристика на территории Западной Сибири не проводились, целью данной работы являлась оценка этиологической значимости норовирусов первой и второй геногруппы у детей раннего возраста и исследование молекулярно-генетического разнообразия циркулирующих изолятов норовирусов в г. Новосибирске.
Цель работы - изучить особенности норовирусной инфекции у детей до 3-х лет, госпитализированных с диагнозом ОКИ, и исследовать молекулярно-генетическое разнообразие выявленных изолятов норовирусов.
Основные задачи исследования: - оценить этиологическую значимость норовирусов I и II геногрупп в структуре ОКИ у детей до 3-х лет; исследовать сезонные особенности норовирусной инфекции и возрастное распределение больных этой инфекцией; провести анализ клинических особенностей норовирусной инфекции у детей раннего возраста; определить нуклеотидные последовательности кДНК региона D геномов выявленных норовирусов, соответствующих поверхностному субдомену Р2 белка капсида; - провести филогенетический анализ полученных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей норовирусов второй геногруппы.
Научная новизна исследования. Впервые проведено многолетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование норовирусной инфекции у детей раннего возраста Новосибирска. Показан вклад норовирусов в этиологическую структуру ОКИ, представлены данные о распространенности сочетанной инфекции норовирусно-вирусной и норовирусно-бактериальной этиологии.
Впервые проведено исследование генетического разнообразия изолятов норовирусов, выявленных в Новосибирске; продемонстрирована циркуляция норовирусов первой и второй геногрупп, установлено, что норовирусы первой геногруппы являются редкой этиологической причиной ОКИ у детей раннего возраста в Новосибирске. Оценена значимость различных генетических вариантов норовирусов второй геногруппы в структуре ОКИ у детей раннего возраста. Впервые определены и зарегистрированы в базе данных GenBank (NCBI, США) нуклеотидные последовательности региона D геномов норовирусов, выявленных в Новосибирске.
Практическая значимость работы.
Проведенное исследование распространенности норовирусной инфекции показало значимость норовирусов в заболеваемости ОКИ и позволило определить этиологическую причину в случаях, раннее относившихся к кишечным инфекциям неустановленной этиологии (КИНЭ).
Мониторинг норовирусной инфекции в течение трех лет позволил выявить подъем заболеваемости ОКИ норовирусной этиологии с декабря 2006 г. по март 2007 г. и расшифровать этиологию заболевания более чем в 50% случаев госпитализаций с диагнозом ОКИ в этот период.
Результаты проведенных исследований могут быть использованы при разработке методических рекомендаций для практикующих врачей и эпидемиологов по контролю и профилактике норовирусной инфекции, а также внедрению современных методов диагностики ОКИ норовирусной этиологии.
Результаты изучения генетического спектра норовирусов второй геногруппы могут быть использованы при создании диагностических тест-систем для экспресс-диагностики этих патогенов, а также для разработки вакцинных препаратов. v Положения, выносимые на защиту.
Частота встречаемости норовирусной инфекции у детей раннего возраста Новосибирска, госпитализированных с диагнозом ОКИ, составила 17,3 %.
В 38,4 % образцов, содержащих норовирусы, одновременно регистрировалось присутствие других энтеропатогенов вирусной или бактериальной природы.
Зарегистрирован значительный подъем заболеваемости норовирусной инфекцией в январе-марте 2007 г., однако выраженной сезонности норовирусной инфекции в Новосибирске в 2005-2008 гг. выявлено не было.
Норовирусная инфекция в целом характеризовалась менее острым началом и более легким течением по сравнению с ротавирусной инфекцией.
Норовирусы первой геногруппы являлись редкой этиологической причиной острых кишечных инфекций у детей раннего возраста г. Новосибирска-1,8 %.
На территории Новосибирской области доминировали норовирусы второй геногруппы; преобладали изоляты 3-го и 4-го генотипов норовирусов этой геногруппы.
Апробация работы и публикации.
Результаты работы представлены на 2-х российских и 4-х международных конференциях: V Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирск, 2005; III Российская научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2006; 7th Internaitonal Rotavirus Symposium, Lisbon, Portugal, 2006; 3rd International Conference «Basic Science for Medicine», Novosibirsk, Russia, 2007; 4th
Inernational Conference on Vaccines for Enteric Diseses - VED 2007, Lisbon, Portugal, 2007; 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008. По материалам диссертации опубликованы пять статей.
Вклад автора
Диссертационная работа была выполнена в лаборатории разработки средств экстренной профилактики ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проекта МНТЦ №2935.
Выделение препаратов РНК/ДНК и комплексная ПЦР-диагностика вирусных (ротавирусы, астровирусы) и бактериальных {Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter) патогенов проводилось автором совместно с Е.В. Жираковской, А.Ю. Тикуновым и Т.Э. Юн. ПЦР-диагностика норовирусной инфекции проводилась лично автором.
Бактериологический посев на Salmonella spp., Shigella spp. и условно-патогенную флору проводился сотрудниками микробиологической лаборатории МУЗ ДГКБ №3.
Эпидемиологический анализ норовирусной инфекции у детей раннего возраста, а также генотипирование выявленных изолятов норовирусов выполнено автором лично. Секвенирование фрагментов генов норовирусов проводилось автором совместно с к.б.н. Е.В. Жираковской. Филогенетический анализ генетической вариабельности изолятов норовирусов проводился автором лично.
Структура и объём диссертации.
Диссертация выполнена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы "Результаты и обсуждение", заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками, включает 8 таблиц и 2 приложения. Библиография включает 260 работ: 11 - отечественных авторов и 249 -зарубежных.
Структурная организация норовирусов
Норовирусы представляют собой небольшие (27-40 нм) безоболочечные вирусы экосаэдрической формы с линейным одноцепочечным полиаденилированным РНК-геномом положительной полярности. Длина генома у различных представителей данного семейства колеблется от 7,3 до 8,3 тыс. нуклеотидов без учета полиаденилированного участка (Lambden P. R. et al., 1993; Jiang X. et al., 1995). Норовирусы (род Norovirus) входят в семейство Caliciviridae. Свое название это семейство получило от латинского слова calyx, означающего чашу или бокал, с которыми сходны чашеобразные вдавлення на поверхности вириона, видимые при электронной микроскопии (Рис. 1) (Clarke I. N. et al., 1997). Вирионы имеют ТЗ-экосаэдрическую симметрию состоят из 180 молекул крупного белка капсида VP1, объединенных в 90 димеров и формирующих оболочку с 90 дугообразными выступами (Prasad В. V. et al., 1994). Продукция этого белка в бакуловирусной системе показала, что он обладает свойством самосборки в вирусоподобные частицы, сходные по своим морфологическим свойствам с нативным вирусом (Jiang X. et al., 1995).
Норовирусы обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды и сохраняют инфекционность при рН 2,7 в течение 3-х часов при комнатной температуре, при обработке 20 % эфиром при 4 С в течение 18 часов, при нагревании до 60 С в течение 30 минут (Dolin R. etal., 1972). 1.2.2. Организация генома норовирусов
Геном норовирусов организован в три открытые рамки считывания, кодирующие с 5 конца генома неструктурный полипротеин, главный белок капсида VP1 и малый белок капсида VP2 (Рис. 2). Это является их важным отличием от других одноцепочечных РНК-содержащих вирусов с геномом положительной полярности, например, полиовирусов, у которых на 5 -конце генома находятся последовательности, кодирующие белки капсида.
Между рамками считывания у всех калицивирусов существуют сдвиги в несколько нуклеотидов. Так, существует перекрывание между ОРТІ и ОРТ2 протяженностью 17 и 20 нуклеотидов для норовирусов 1-й и 2-й геногрупп соответственно. Область перекрывания включает стоп-кодон ОРТІ и первый старт-кодон ОРТ2. Это создает сдвиг рамки трансляции в 2 нуклеотида. Во-вторых, существует перекрывание в 1 нуклеотид между стоп-кодоном ОРТ2 и первым кодоном ОРТЗ, что восстанавливает исходную рамку трансляции (Рис. 2). Таким образом, у норовирусов ОРТІ и ОРТЗ находятся в одной и той же рамке трансляции.
Молекулярные основы репликации калицивирусов до сих пор неясны. Тем не менее, было установлено (Ehresmann D. W. et al., 1977; Neill J. D. et al., 1988), что все представители семейства калицивирусов в процессе репликации синтезируют два основных специфических РНК-транскрипта. Первый субгеномный транскрипт имеет длину полного генома (36S), второй - одной трети генома с 3 -конца (22S). Субгеномная РНК 22S соответствует 3 -концу генома и служит шаблоном для трансляции главного белка капсида (Neill J. D. etal, 1988).
ОРТІ. Первая, наиболее протяженная открытая рамка считывания кодирует полипротеин, являющийся предшественником неструктурных белков норовирусов, имеющих сходные структуру и свойства с таковыми у пикорнавирусов - геном-связывающий белок, протеаза, РНК-зависимая РНК-полимераза (Ehresmann D. W. et al.,, 1977, Hardy M. et al., 2005). ОРТ2. Вторая открытая рамка считывания кодирует главный белок капсида массой 58-60 кДа, формирующий внешнюю оболочку вириона. Белок капсида и растворимый антиген норовирусов впервые были обнаружены в образцах фекалий, полученных от инфицированных добровольцев (Greenberg
Н. В. et al., 1981). Вирусоподобные частицы, образующиеся при экспрессии полной последовательности ОРТ2 в бакуловирусной системе, в экспериментах по инфицированию ими добровольцев показали способность индуцировать специфический иммунный ответ к поверхностным антигенным детерминантам нативных норовирусов (Green К. Y. et al., 1993; Parker S. et al., 1993).
ОРТЗ. Третья открытая рамка считывания расположена на З -конце генома и содержит последовательность, кодирующую небольшой белок с основными свойствами, который был охарактеризован как малый структурный протеин VP2 с молекулярной массой 22-29 кДа, имеющий у различных штаммов высокую генетическую вариабельность (Seah Е. L. et al., 1999). Функция VP2 заключается в регуляции экспрессии главного белка капсида VP1 в соположении и его стабилизации в структуре вирусного капсида, при этом в структуре вириона может содержаться одна или две молекулы VP2 (Prasad В. V. et al., 1994). Несмотря на то, что этот белок не играет существенной роли для самосборки пустой вирусоподобной частицы in vitro, он повышает экспрессию ОРТ2 и стабилизирует структуру вириона in vivo (Glass R. et al., 2000).
Классификация калицивирусов
Отсутствие системы культивирования калицивирусов человека явилось основным препятствием в изучении их свойств, что усложнило использование многих критериев, применяемых для классификации других вирусов: физико-химические свойства, синтез белков в инфицированных клетках (протеиновый спектр), антигенные различия, клеточный тропизм. Международный комитет по таксономии вирусов {Iternational Commettee on Taxonomy of Viruses, ICTV) признал важность анализа нуклеотидных последовательностей в разрешении вопросов таксономии некультивируемых групп вирусов. Было определено, что нуклеотидные последовательности некультивируемых вирусов должны отвечать критериям «достаточной полноты генома» {reasonably complete genome) или «значимой части генома» {significant partial sequence). При этом должна быть доступна другая информация: морфология, антигенные свойства, мишень-хозяин, а также клинические особенности заболевания, вызванного данным патогеном (Maniloff J., 1995). Таким образом, основой классификации норовирусов, а также других калицивирусов является анализ нуклеотидных последовательностей.
В 2002 г. Международный комитет по таксономии вирусов принял и в 2006 г. оставил без изменений действующий в настоящее время вариант классификации, в основе которой лежит анализ нуклеотидных последовательностей генома калицивирусов (Табл. 1). В настоящее время в семейство Caliciviridae официально входит четыре рода - Lagovirus, Vesivirus, Norovirus и Sapovirus, патогенными для человека из которых являются два -Norovirus и Sapovirus. Представители двух других - Lagovirus и Vesivirus вызывают различные синдромы и заболевания у представителей животного мира (ICTVdB Management; 2006).
Следует отметить, что в настоящее время в семейство Caliciviridae предлагается внести еще один род, представители которого ранее относились к неклассифицируемым представителям калицивирусов - Newbury agent-1 (Newbury 1), являющийся патогенным для молодняка крупного рогатого скота. Данный патоген был впервые обнаружен в 1976 г. и на основании морфологических свойств, показателей плотности в градиенте хлористого цезия, а также наличия главного белка капсида и специфических аминокислотных мотивов был отнесен к калицивирусам (Woode G. N. et al., 1978; Bridger J. С. et al., 1984). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей показал, что этот вирус имеет сходство с другими калицивирусами в аминокислотных последовательностях менее чем 39 % и образует отдельную ветвь на дендрограмме (Oliver S. L. et al., 2006). Авторами были предложены два временных варианта названия: Becovirus (bovine enteric calicivirus), или Nabovirus (iVew/mryl и TVZtovine-like viruses). Однако официальное признание нового рода в семействе калицивирусов произойдет не ранее следующего заседания Международного комитета по таксономии вирусов, которое состоится в 2010 году.
В номенклатуру рода Norovirus официально также внесены несколько штаммов, описанных еще до принятия классификации и имеющих свои исторически сложившиеся названия. Такое допущение в некоторой степени позволяет сопоставить большой массив научных данных, полученных до введения официальной классификации и после. Однако в связи с тем, что в настоящее время генотипирование изолятов норовирусов проводится на основе молекулярно-биологических методов с последующим филогенетическим анализом, на первый план выходит неофициальная система обозначения изолятов норовирусов согласно их положению на дендрограмме по отношению к референсным штаммам (криптограмма). Но несмотря на то, что внутри рода Norovirus определены некоторые виды (табл. 2), Международный комитет по таксономии вирусов не имеет рекомендаций по классификации калицивирусов ниже уровня рода, а также до сих пор не определены критерии классификации норовирусов внутри геногрупп. Накопление данных о нуклеотидных последовательностях различных участков генома норовирусов, а также полных нуклеотидных последовательностях генома позволило оценить их генетическую вариабельность и филогенетические взаимоотношения внутри рода.
Изначально различные группы исследователей пытались дифференцировать варианты возбудителя на основании антигенных и морфологических свойств норфолк-подобных вирусов. Это нашло отражение в названии возбудителя, зачастую отражающем географическое место, где впервые был обнаружен патоген - Mexico virus, Hawaii virus и т. д. Возможность установления нуклеотидных последовательностей генома норовирусов, в том числе определяющих их антигенные свойства, а также международное сотрудничество, выражающееся в создании доступных онлайн баз данных, способствовали разделению рода Norovirus на геногруппы и далее на генотипы. По мере накопления данных количество описанных геногрупп и генотипов внутри геногрупп увеличивалось.
В настоящее время на основании нуклеотидных последовательностей гена капсида, определяющего антигенные свойства, норовирусы могут быть разделены на пять различных геногрупп (Green J. et al., 1995; Vinje J. et al., 2000; Fankhauser R. L. et al., 2002; Oliver S. L. et al., 2003; Okada M. et al., 2005). Три геногруппы (GI, Gil и GIV) были обнаружены у человека, при этом генотип 11 второй геногруппы был выделен от свиньи. Две геногруппы норовирусов (GUI и GV) были обнаружены у коров и мышей соответственно (Karst S. М. et al., 2003). Такая широкая вариабельность является прямым следствием ошибок в работе вирусной РНК-полимеразы, а также процессами рекомбинации между различными штаммами (Rohayem J. et al., 2005).
На основании группирования генетических взаимоотношений полных аминокислотных последовательностей ОРТ2 (при сходстве не менее 75 % (Green К. Y. et al., 1993) внутри геногрупп норовирусы могут быть далее разделены на генотипы. Эти генотипы были названы последовательно для каждой геногруппы: GI.1-GI.5, GII.1-GIL18 и т.д.
Норовирусная инфекция у детей раннего возраста Новосибирска с 2005 по 2008 гг
Для исследования молекулярно-эпидемиологических особенностей норовирусной инфекции было проведено многолетнее комплексное исследование распространенности норовирусной инфекции среди детей раннего возраста Новосибирска и части Новосибирского сельского района. 3.2.1. Организация исследования Проведение молекулярно-эпидемиологического исследования норовирусов у детей г. Новосибирска включало несколько этапов: Исследование проб фекалий госпитализированных пациентов на наличие ряда вирусных (норовирусы первой и второй геногрупп, ротавирусы группы А, астровирусы) и бактериальных энтеропатогенов (кампилобактерии, шигеллы, сальмонеллы, энтероинвазивные E.coli). Подсчет количества проб с норовирусами в абсолютном значении и процента от общего количества госпитализированных. Подсчет и анализ образцов, содержащих, помимо норовирусов, другие вирусные и бактериальные патогены. Анализ сезонных особенностей норовирусной инфекции. Анализ возрастного распределения норовирусной инфекции. Анализ эпидемиологических особенностей норовирусной инфекции. Исследование клинических особенностей норовирусной инфекции. Проведение генотипирования и анализ распространенности циркулирующих вариантов норовирусов. Данное исследование было проведено с марта 2005 г. по июнь 2008 г включительно. В этот период было исследовано 3496 образцов фекалий от детей в возрасте до трех лет, госпитализированных с диагнозом ОКИ. При поступлении у пациентов собирали образцы фекалий для дальнейшего исследования. Данные из истории болезни вносились в специально разработанную карту пациента, отражающую основные клинические и лабораторные показатели, а затем в электронную базу данных. На базе ФГУН ГНЦ ВБ Вектор проводилось комплексное ПЦР-тестирование всех поступивших фекальных проб на наличие вирусных (норовирусы первой и второй геногруппы, ротавирусы группы А, астровирусы) и бактериальных энтеропатогенов {Salmonella spp., Shigella spp., энтероинвазивные E. coli (EIEC), Campylobacter термофильной группы). Анализ данных проводился в пределах эпидемиологических периодов, равных по продолжительности календарным годам и длящимся ежегодно с июля по июнь включительно. Анализ этиологической структуры кишечных инфекций был выполнен с учетом данных диагностической лаборатории МУЗ ДГКБ №3, в которой исследование проводили микробиологическим посевом на Salmonella spp., Shigella spp., энтеропатогенные E. coli и условно-патогенные микроорганизмы. В исследование также была также включена группа сопоставления, сформированная из 118 детей до трех месяцев, госпитализированных в это же медицинское учреждение и не имевших клинических признаков кишечной инфекции. Ежегодное число обследованных детей с симптомами ОКИ, число пациентов контрольной группы, а также общее количество пациентов представлено в табл. 5. За весь период исследования кишечных инфекций у детей раннего возраста с диагнозом ОКИ было исследовано 3496 образцов фекалий. Норовирусы первой геногруппы были обнаружены 63 пробах, норовирусы второй геногруппы — в 551, в 12 пробах были обнаружены норовирусы обеих геногрупп (рис. 6). Таким образом, из исследованных 3496 образцов фекалий в 602 (17,3 %) были обнаружены норовирусы, что в целом совпадает с показателями встречаемости норовирусов при спорадических случаях ОКИ, полученными зарубежными исследователями, показанными на уровне 8-18 % (Bon F. et al., 1999; de Wit M. A. et al., 2001, Buesa J. et al., 2002; Sdiri-Loulizi K. et al, 2009; Kele B. et al, 2009). Вместе с тем, широкомасштабное
Клинические особенности норовирусной инфекции
В настоящее время патогенетические препараты для лечения кишечных инфекций вирусной этиологии в России широко не применяются; как правило, лечение направлено на компенсирование симптомов кишечного расстройства и купирование общих симптомов. Однако различие в патогенетических механизмах развития заболевания подразумевает некоторые особенности ОКИ, вызываемых различными вирусными патогенами. Для кишечной инфекции, вызываемой норовирусами, задолго до открытия возбудителя, были описаны специфические клинические проявления, так называемые критерии Каплана: инкубационный период 15-50 часов, рвота более чем в половине случаев, диарея, средняя продолжительность симптомов 12-60 часов, высокий уровень заболеваемости, а также образцы стула, отрицательные на бактериальные патогены (Kaplan J. Е. et al., 1982; Turcios R. M. et al., 2006). Эти признаки были описаны на основании наблюдений за взрослыми больными с норовирусной инфекцией. Однако у пациентов до трех лет в связи с особенностями детского возраста эти признаки могут отличаться. Для выявления особенностей ОКИ норовирусной этиологии у детей раннего возраста был проведен анализ 164 случаев ОКИ с лабораторно подтвержденной норовирусной моноинфекцией, а также 597 случаев ОКИ ротавирусной этиологии. В исследование были включены пациенты в возрасте от 3 до 24 мес. Результаты сравнения приведены в табл. 6.
В целом, по ряду клинических показателей обе инфекции не имели значительных различий. В клинической картине ОКИ норовирусной и ротавирусной этиологии ведущим являлся синдром острого гастроэнтерита. Сходными были средняя длительность пребывания в стационаре, число контактов с больными ОКИ, характер поражения кишечника, начало рвоты в первый день, наличие патологических примесей в стуле и т.д. Основное количество обращений за медицинской помощью как при норовирусной, так и при ротавирусной инфекции происходило до третьего дня от начала заболевания. Однако практически в четверти случаев пациенты были госпитализированы в более поздние сроки.
Вместе с тем, у больных норовирусной инфекцией заболевание характеризовалось менее острым началом и более легким течением, чем при ротавирусной инфекции. Токсикоз первой и второй степени при норовирусной ОКИ был выявлен у меньшего числа пациентов. Проявления эксикоза 1-й и 2-й степени при норовирусной инфекции также были менее выражены. Однако, процент детей с отягощенным алергоанамнезом при норовирусной инфекции был несколько больше, чем при ротавирусной инфекции. Приблизительно у 43 % пациентов с ОКИ норовирусной этиологии инфекция протекала на неблагоприятном преморбидном фоне (недоношенность, анемия, сопутствующие заболевания). Рвота с первого дня болезни отмечалась приблизительно у одинакового числа пациентов, но при норовирусной инфекции рвота сохранялась несколько дольше, чем при ОКИ ротавирусной этиологии. Патологический стул с наличием примесей как при норовирусной, так и при ротавирусной инфекции наблюдался практически у всех пациентов. При этом признаки реактивного панкреатита у пациентов с норовирусной инфекцией обнаруживались чаще, что свидетельствовало о выраженном воспалительном процессе в тонком кишечнике и вовлечении в него поджелудочной железы. В общем анализе крови у 47,0 % пациентов с норовирусной ОКИ отмечался умеренный лейкоцитоз (38,7 % при ротавирусной ОКИ).
Характер вскармливания пациентов отличался при норовирусной и ротавирусной инфекции. Если ранний отказ от грудного вскармливания был характерен для обеих инфекций практически в одинаковом проценте случаев, то число детей на искусственном вскармливании при ротавирусной инфекции было значительно больше, чем при норовирусной инфекции. Детей, находившихся на момент заболевания на грудном вскармливании, было больше при норовирусной инфекции. Таким образом, характер вскармливания может являться фактором риска для развития ротавирусной инфекции и не является определяющим фактором инфицирования при ОКИ норовирусной этиологии. Следует отметить, что при ротавирусной инфекции катаральные явления без сопутствующих клинических проявлений инфекции верхних дыхательных путей наблюдались значительно чаще, чем при норовирусной инфекции. Согласно литературным данным, этот симптом является характерным для 45-55 % пациентов с ротавирусной инфекцией и проявляется в виде гиперемии, отечности и зернистости слизистой оболочки ротоглотки, а также ринита и диффузной гиперемии барабанной перепонки (Васильев Б. Я. и др., 2000; Богомолов Б. П. и др., 2007). Возможно, что при норовирусной инфекции катаральные проявления также являются патогномичным симптомом, хотя и не таким выраженным, как при ротавирусной инфекции.
Таким образом, клиническая картина норовирусной ОКИ характеризовалась сочетанием гастроинтестинальных нарушений и интоксикационного синдрома. Проведенный сравнительный анализ показал, что у больных норовирусной инфекцией заболевание характеризовалось менее острым началом и более легким течением, чем при ротавирусной инфекции. Сходные данные для норовирусной и ротавирусной инфекции были получены также и зарубежными исследователями, в работе которых выборка пациентов включала детей как раннего, так и школьного возраста (Wu F. Т. et al., 2008). Особенности норовирусной инфекции не носили выраженного специфического характера, поэтому для верификации диагноза «норовирусная инфекция» необходимо применение специфических лабораторных методов диагностики.
