Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Современные представления о ротавирусах и ротавирусной инфекции 11
1.1. Классификация ротавирусов 11
1.2. Структурная и молекулярная организация ротавируса 12
1.2.1. Морфология и свойства ротавирусной частицы 12
1.2.2. Геном ротавируса 15
1.2.3. Вирусные белки 17
1.2.3.1. Структурные белки 18
1.2.3.2. Неструктурные белки 24
1.3. Ротавирусная инфекция 28
1.3.1. Значимость ротавирусного гастроэнтерита в инфекционной патологии детей раннего возраста на современном этапе 29
1.3.2. Патофизиология ротавирусной инфекции 32
1.3.3. Клинические проявления ротавирусной инфекции 33
1.3.4. Лабораторная диагностика ротавирусной инфекции 35
1.4. Эпидемиология ротавирусной инфекции 37
1.4.1. Антигенная характеристика ротавирусов группы А 37
1.4.1.1. Механизмы изменчивости ротавирусов 39
1.4.1.2. Разнообразие [P]G генотипов ротавирусов 43
1.4.1.3. Инфицирование несколькими штаммами ротавируса 46
1.4.1.4. Зоонозный потенциал ротавирусной инфекции 47
1.4.1.5. Асимптоматическая форма ротавирусной инфекции 51
1.4.2. Сезонность ротавирусной инфекции 54
1.4.3. Пути передачи ротавирусной инфекции 55
1.4.4. Иммунитет при ротавирусной инфекции 57
1.5. Вакцинопрофилактика ротавирусной инфекции 60
1.6. Заключение 63
2. Материалы и методы 65
2.1. Основная характеристика обследованных больных 65
2.2. Методы 66
2.2.1. Иммуноферментный анализ 66
2.2.2. Получение осветленного экстракта фекалий 67
2.2.3. Выделение РНК вирусов 67
2.2.4. Реакция обратной транскрипции 67
2.2.5. Амплификация фрагментов кДНК 68
2.2.6. Электрофоретический анализ продуктов амплификации 73
2.2.7. Компьютерный анализ 74
2.2.8. Статистический анализ 84
3. Результаты и обсуждение 85
3.1. Оценка распространенности ротавирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске 85
3.2. Сравнительная оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ротавирусов группы А 89
3.3. Изучение особенностей ротавирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске с 2005 по 2008 г 92
3.3.1. Гастроэнтериты, вызванные ротавирусами группы А 94
3.3.2. Гастроэнтериты, вызванные ротавирусами группы С 103
3.4. Молекулярно-генетическая характеризация изолятов ротавирусов группы А 105
3.4.1. Характеризация Р- и G- генотипов ротавируса группы А, циркулировавших в Новосибирске 106
3.4.2. Динамика циркуляции ротавирусов разных [PJG-генотипов в Новосибирске 110
3.4.3. [P]G генотипы ротавирусов группы А, циркулировавших в Омской области 114
3.4.4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК фрагментов генома ротавирусов группы А 117
4. Заключение 148
5. Выводы 151
Приложение 153
Список литературы
- Морфология и свойства ротавирусной частицы
- Антигенная характеристика ротавирусов группы А
- Получение осветленного экстракта фекалий
- Сравнительная оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ротавирусов группы А
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время острые кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, уступая по частоте лишь гриппу и острым респираторным заболеваниям. Ротавирусы группы А (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются наиболее распространенной причиной тяжелого гастроэнтерита у детей младшего возраста во всем мире (Wilhelmi I. et al., 2003). Ежегодно регистрируется более 100 млн. случаев ротавирусного гастроэнтерита, являющегося причиной 2 млн. госпитализаций и около 600 тыс. смертей детей в возрасте до 5-ти лет, при этом до 80 % летальных случаев приходится на развивающиеся страны (Bryce J. et al., 2005; Parashar U. D. et al., 2006). Однако эпидемиологические исследования показывают, что и в экономически развитых странах данная проблема стоит достаточно остро (Newall А. Т. et al., 2006; Soriano-Gabarro М. et al., 2006; Fischer Т. К. et al., 2007). Ротавирусная инфекция относится к числу заболеваний, этиологически верный диагноз которых возможен только после лабораторного подтверждения. К сожалению, не во всех специализированных лечебных учреждениях РФ проводят диагностику этого заболевания. Поэтому в России показатели заболеваемости ротавирусной инфекцией ниже, чем в развитых странах. По данным Федерального Центра Госсанэпиднадзора, в 2004-2005 гг. в РФ было официально зарегистрировано свыше 33-38 тыс. случаев ротавирусной инфекции в год, из которых 90,3-91,7 % приходились на детей до 14 лет, при этом дети до 2-х лет составили 76,4 — 75,7 % от всех заболевших детей (Информационный сборник статистических материалов, 2006).
Ротавирусная инфекция является высококонтагиозным заболеванием с множественными путями распространения. Источником инфекции служит человек с манифестной или бессимптомной формой заболевания, а также вирусоноситель (Васильев Б. Я. и др., 2000). Проблема профилактики
ротавирусной инфекции привлекает внимание специалистов во всем мире. В настоящее время накоплена обширная информация о генетическом разнообразии ротавирусов (Gentsch J. R. et al., 2005; Santos N., Hoshino Y., 2005). Современная классификация ротавирусов группы А разработана на основе вирусных антигенов VP7 и VP4, на которые вырабатываются вируснейтрализующие антитела (Gentsch J. R. et al., 1996; Kapikian A. Z., 2001). Среди ротавирусов человека различают 14 Р- и 10 G-генотипов (Gentsch J. R. et al., 2005; Santos N., 2005; Mascarenhas J. D. et al., 2007b). Существуют географические различия в распространенности ротавирусов различных генотипов даже в рамках одной страны, и частота их встречаемости изменяется со временем (Steele A. D. et al., 2003). Опубликованы данные о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавирусов и большом числе нетипируемых штаммов (Gentsch J. R. et al., 2005). В связи с этим для оценки эффективности уже созданных вакцин и разработки новых необходимо знание генетического спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории. Всемирный альянс вакцинации и иммунизации (GAVI) при сотрудничестве ВОЗ, Программы оптимальных технологий в здравоохранении (PATH, США) и Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США) в 2003 году активировал Ротавирусную программу вакцинации (). В рамках этой программы созданы пять региональных сетей мониторинга ротавирусного гастроэнтерита, которые охватывают более 40 стран мира. Пока Россия не входит ни в одну из этих сетей мониторинга. Ранее было проведено изучение генетических вариантов ротавирусов на европейской территории России (Васильев Б. Я. и др., 2000; Епифанова Н. В. и др., 2001; Новикова Н. А. и др., 2007; Подколзин А. Т. и др., 20076; Сагалова О. И. и др., 2007). В то же время исследований ротавирусной инфекции и молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов, циркулирующих в Западной Сибири, не проводилось.
Цель исследования: изучить особенности эпидемического процесса ротавирусной инфекции у детей до 3-х лет, госпитализированных в специализированную клинику, и определить молекулярно-генетическое разнообразие выявленных изолятов ротавируса.
Задачи исследования:
Оценить этиологическую значимость ротавирусов в структуре острых кишечных инфекций у детей до 3-х лет и проанализировать сезонные особенности ротавирусной инфекции в Новосибирске.
Изучить генетическое разнообразие ротавирусов, циркулирующих на территории Новосибирска, выявить динамику встречаемости генотипов в течение пятилетнего периода исследования, сравнить с генотипами ротавирусов, циркулирующими в Омске и Омской области.
Определить нуклеотидные последовательности кДНК четвертого и девятого фрагментов генома ротавирусов, кодирующих белки VP4 и VP7.
Провести сравнительный филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей двух изучаемых фрагментов генома ротавирусов различных генотипов с ранее опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями кДНК аналогичных генотипов.
Научная новизна
Впервые проведено пятилетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование ротавирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске. Установлена высокая этиологическая значимость ротавирусов группы А в структуре спорадической заболеваемости детей острыми кишечными инфекциями. Представлены новые данные, свидетельствующие о широком распространении микст-инфекций: ротавирусно-вирусной и ротавирусно-бактериальной сочетанной этиологии.
Впервые проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов группы А, циркулирующих в Новосибирске. Выявлено изменение генетического спектра популяции ротавирусов в
течение пяти лет. Проведено сравнение выявленных генотипов ротавирусов с генотипами, циркулирующими в Омске и Омской области. Показано, что генетические спектры ротавирусов, циркулировавших в Новосибирске, Омске и Омской области в один эпидемический сезон, существенно различались.
Показано, что ротавирусы группы С являются достаточно редкой этиологической причиной острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в Новосибирске.
Впервые определены и зарегистрированы в базе данных GenBank (NCBI, США) нуклеотидные последовательности кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4, и девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7, изолятов ротавируса группы А, выявленных в Новосибирске и Омске.
Практическая значимость
Сравнительный анализ имеющихся в РФ диагностических тестов для выявления ротавируса группы А показал, что комплект реагентов для ПЦР-диагностики «АмплиСенс Rotavirus-290» (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) по диагностической эффективности превосходит существующие ИФА-тесты и может быть рекомендован для детекции ротавирусов в клинических образцах и проведения молекулярно-генетических исследований.
Оперативное выявление и установление этиологически точного диагноза, позволило врачам специализированной детской клиники проводить более рациональное лечение детей раннего возраста и исключить развитие лекарственных осложнений. Такая своевременная диагностика сокращает время пребывания пациента в стационаре и снижает стоимость проводимого лечения.
Полученные данные о выявлении ротавирусной инфекции включены в статистические отчеты городской специализированной клиники и вошли
в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области в 2006 и 2007 годах.
Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики.
Результаты мониторинга генетического спектра циркулирующих ротавирусов могут быть использованы при решении вопроса о проведении вакцинации детей раннего возраста с учетом соответствия антигенного состава существующих ротавирусных вакцин доминирующим в Западной Сибири генотипам вируса.
Апробация работы
По материалам диссертации опубликованы 9 статей. Результаты работы были представлены на 5-ти российских и 4-х Международных конференциях: V Российская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных болезней", Новосибирск, 2005; III Российская научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2006; VII Межрегиональная научно-практической конференция с международным участием "Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения", Омск, 2007; Межрегиональная научно-практическая конференция "85-летие образования Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации", Тюмень, 2007; VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Молекулярная диагностика -2007", Москва, 2007; 7th International Rotavirus Symposium, Lisbon, Portugal, 2006; 4th International Conference on Vaccines for Enteric Diseases - VED 2007, Lisbon, Portugal, 2007; 3rd International Conference «Basic Science for Medicine», Novosibirsk, Russia, 2007; 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008.
Вклад автора
Диссертационная работа была выполнена в 2003-08 гг. в лаборатории разработки средств экстренной профилактики ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках выполнения проекта МНТЦ №293 5р (рук. — академик РАМН В] В. Малеев).
Диагностика ротавирусной инфекции методом ИФА проводилась автором лично. Выделение препаратов РНК и комплексная ПЦР-диагностика вирусных (ротавирусы, норовирусы, астровирусы) патогенов осуществлялись автором совместно с А. Ю. Тикуновым и С. А. Бодневым. Бактериологический посев на Salmonella spp., Shigella spp. и условно-патогенную флору производился сотрудниками микробиологической лаборатории МУЗ ДГКБ № 3. ПЦР-диагностика бактериальных патогенов {Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter) проводилась к.б.н. Т. Э. Юн. Создание базы данных, эпидемиологический анализ ротавирусной инфекции у детей раннего возраста за пятилетний период в Новосибирске и генотипирование выявленных изолятов ротавирусов выполнялись лично автором. Выделение препаратов РНК и генотипирование изолятов ротавирусов, выявленных в Омской области, проводилось автором лично. Секвенирование кДНК фрагментов генома ротавирусов, кодирующих белки VP4 и VP7, осуществлялось к.б.н. А. В. Качко и к.б.н. И. В. Бабкиным. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК четвертого и девятого фрагментов генома ротавирусов различных генотипов проводился автором лично.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы "Результаты и обсуждение", заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 41 рисунком, включает 22 таблицы и одно приложение. Библиография включает 445 работ: 55 — отечественных авторов и 390 - зарубежных.
11 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Современные представления о ротавирусах и ротавирусной инфекции
Морфология и свойства ротавирусной частицы
Вирус получил свое название от латинского rota — колесо, так как вирусные частицы под электронным микроскопом выглядят как маленькие колесики с широкой ступицей, 20 короткими "спицами" и круговым ободком (рис. 1). Ротавирусная частица имеет в диаметре приблизительно 75 нм. Криоэлектронная микроскопия показала, что зрелый вирион ротавируса имеет сферическую форму, икосаэдрическую симметрию с триангуляционным числом Т-13. Вирион состоит из ядра, включающего в себя геном, представленный одиннадцатью сегментами двуцепочечной РНК (дцРНК), окруженный тремя концентрическими слоями белковых оболочек (Estes М. К., 2001). Рис. 1. Иммуноэлектронная микроскопия ротавирусных частиц в фекальной пробе ребенка больного острым гастроэнтеритом (Parashar U. D. etal., 1998).
Внешний слой (наружный капсид) состоит из 780 единиц гликопротеина VP7 (37 кДа) и 60 шипов длиной 12 нм, образуемых димерами белка VP4 (87 кДа); средний слой (внутренний капсид) - из 260 тримеров белка VP6 (41 кДа); внутренний слой - из 60 димеров белка VP2 (102 кДа). В пределах внутренней белковой оболочки на один сегмент геномной РНК приходится одна или несколько молекул РНК-полимеразы VP1 (125 кДа) и гуанилил-трансферазы VP3 (98 кДа) (Estes М. К., 2001; Patton J. Т. et al., 2007).
Белки VP1, VP2, VP3 и геном образуют вирусное ядро ротавируса. Ядра, окруженные белком VP6 - так называемые вирусоподобные частицы - обладают транскриптазной активностью и являются источником вирусной мРНК в клетке. Ротавирусные мРНК уникальны и отличаются от клеточных мРНК, так как кэпированы на 5 -конце, но не содержат поли-(А)-последовательности на З -конце. Во время репликации вирусные мРНК выполняют две функции: обеспечивают синтез белка и являются матрицей для синтеза второй цепи РНК в процессе продукции дцРНК (Patton J. Т., Spencer Е., 2000). Отличительной чертой структуры ротавируса является наличие 132 каналов, пронизывающих внешний и средний слои. В зависимости от размеров и пространственного расположения различают 3 вида каналов. Двенадцать каналов 1-го типа и шестьдесят каналов И-го типа имеют размер входного отверстия 40 А и располагаются вдоль икосаэдральных осей пятого и шестого порядка, соответственно. По краю каналов П-го типа расположены двулопастные выступы наружного капсида, которые возвышаются над поверхностью на 12 нм. Шестьдесят каналов Ш-го типа имеют глубину 140 А и ширину 55 А. Каналы входят внутрь вирусной частицы, сужаются, а затем расширяются, и их максимальная ширина обращена к поверхности белков внутренней оболочки вируса. На поверхности внутреннего слоя имеются поры, которые соединяются с каналами Ш-типа в средней оболочке вириона. Возможно, в транскрипционно активных вирионах эти каналы обеспечивают проникновение метаболитов, необходимых для транскрипции РНК и выхода вновь синтезированных молекул РНК с последующей репликацией вируса. Каналы также могут иметь важное значение в транспортировке субстратов к РНК, а от нее - продуктов вирусной РНК-полимеразы, локализованной в сердцевине ротавируса (Estes М. К., 2001; Pesavento J. В. et al., 2001).
Ротавирусные частицы обладают определенным полиморфизмом, поэтому при электронной микроскопии выявляют несколько видов частиц (Estes М. К., 2001; Lepault J. et al., 2001): - зрелые "полные" вирионы (76,5 нм) - трехслойные частицы (TLP) -обладающие ядром и полным набором оболочек; - "неполные" вирионы (70 нм) - шероховатые вирусоподобные частицы, двухслойные частицы (DLP) - отсутствует наружный капсид; - сердцевины (50 нм) - ядра без оболочек, однослойные частицы (SLP) — отсутствуют внутренний и наружный капсиды; - тубулярные образования - продукты VP6. Инфекционной активностью обладают только зрелые трехслойные частицы вируса. "Неполные" вирионы и сердцевины не инфекционны. Коэффициент седиментации разных частиц ротавирусов равен 525 S, 390 S, 280 S, соответственно. Плавучая плотность зрелых вирусных частиц составляет 1,36 г/см, вирусоподобных частиц - 1,38 г/см", а вирусной сердцевины — 1,44 г/см". Инфекционная активность ротавирусов стабильна при значениях рН от 3 до 9 (Estes М. К., 2001).
Антигенная характеристика ротавирусов группы А
Белки наружного капсида VP4 и VP7 являются основными антигенами ротавирусов и определяют их генетическое разнообразие (Estes М. К., 2001). Они индуцируют in vivo образование нейтрализующих антител (Arias С. F. etal., 1994; Higo-Moriguchi К. etal., 2004; Ray P. G., Kelkar S. D., 2004). По этим двум антигенам разработана классификация ротавирусов (Gouvea V. et al., 1990; Gentsch J. R. et al., 1992; Kapikian A. Z., 2001). Так как белок VP7 является гликопротеином, то определяемые им серо-/генотипы обозначаются как G-тип. Для определения G-серотипа применяют следующие методы: твердофазная иммуноэлектронная микроскопия с использованием гипериммунных сывороток к отдельным серотипам; иммуноферментный анализ на основе серотипспецифических моноклональных антител; реакция молекулярной гибридизации с использованием клонированных кДНК генов, кодирующих серотипопределяющие белки (Taniguchi К. et al., 1987; Flores J. et al., 1989; Woods P. A. etal., 1992; Kelkar S. D. etal., 2004). Ранее для определения генотипов ротавирусов использовали метод РНК-РНК гибридизации с Р32-меткой и последующим электрофоретическим разделением фрагментов (Nakagomi О. etal., 1989). В настоящее время для G-генотипирования стали широко применять метод ОТ-ПЦР (Gouvea V. et al., 1990; Das В. К. etal., 1994). Показано, что G-серотип коррелирует с G-генотипом, так как праймеры, используемые для генотипирования, расположены в области детерминант, определяющих серотип белка VP7 (Gouvea V. et al., 1990).
Белок VP4 является протеазочувствительным и определяемые им серо- и генотипы обозначаются как Р-тип. Так как минорный белок VP4 представлен всего 250 молекулами на вирусную частицу, то получить моноклональные антитела к нему довольно сложно (Coulson В. S., 1993). Это послужило основой для разработки альтернативных подходов к дифференциации штаммов по гену VP4 и определению Р-генотипа. На основе корреляции между серотипом и нуклеотидной последовательностью гена VP4 были разработаны генотип-специфичные праймеры для определения Р-генотипов с помощью метода ОТ-ПЦР (Gentsch J. R. et al., 1992; Das B. K. et al., 1994). В связи с существованием различий между генетически и серологически определяемыми Р-типами в номенклатуре ротавирусов принято результат Р-генотипирования заключать в квадратные скобки (Gentsch J. R. etal., 1996). Генотипы ротавирусов группы А, согласно современной классификации, обозначают [P]G (Gentsch J. R. et al., 1996). К настоящему времени идентифицировано 27 Р- и 15 G-генотипов ротавирусов человека и животных, из которых 14 Р- и 10 G-генотипов циркулируют в человеческой популяции (Gentsch J. R. et al., 2005; Santos N., Hoshino, Y., 2005; Mascarenhas J. D. et al., 2007b).
Дополнительно ротавирусы группы А по антигенным детерминантам внутреннего белка VP6 разделяют на 4 подгруппы, имеющие различную подгрупповую специфичность (SG). У ротавирусов человека выделяют четыре варианта подгрупповой специфичности: SGI, SGII, SGI+П и ни SGT, ни SGI1 (Cunliffe N. A. et al., 1997; Kapikian A. Z., 2001; Iturriza-Gomara M. et al., 2002a).
Кроме того, существует пять генотипов неструктурного белка NSP4 (А-Е) ротавирусов человека и животных (Ciarlet М. et al., 2000; Kapikian A. Z., 2001). При филогенетическом анализе генотипы NSP4 образуют кластеры согласно виду хозяина ротавируса (Kirkwood С. D., Palombo Е. А., 1997; Ciarlet М. et al., 2000). У ротавирусов человека чаще всего определяют генотипы NSP4(A) и NSP4(B), есть редкие случаи выявления генотипа NSP4(C) (Cunliffe N. A. et al., 1997; Banerjee I. et al., 2007b).
Исследования последних лет показали, что в человеческой популяции одновременно циркулирует огромное число различных генетических вариантов ротавирусов (Gentsch J. R., 2005; Santos N., Hoshino Y., 2005; Mascarenhas J. D. et al., 2007b). Межвидовой барьер при ротавирусной инфекции существует, но не носит абсолютного характера. Генетический материал ротавирусов животных может изменять популяцию ротавирусов человека (Iturriza-Gomara М. et al., 2004а; Cook N. et al., 2004; Gentsch J. R. et al., 2005).
Получение осветленного экстракта фекалий
В стерильные 5 мл пробирки с завинчивающейся крышкой вносили стерильный 0,9 % раствор NaCl (ОАО "Красфарм", Россия), содержащий глицерин (15 %) (ICN Biomedicals) и азид натрия (0,05 %). Пробирки маркировали. Образцы проб фекалий объемом до 1 мл (0,4-1,0 г) помещали в пробирки с раствором NaCl. Взвесь фекалий встряхивали на вортексе до образования суспензии. Полученную суспензию осветляли центрифугированием в течение 5 мин при 10 тыс. об/мин. Супернатант (10-20% осветленный экстракт фекалий) использовали для выделения РНК. Оставшуюся суспензию фекалий хранили при -70С.
Выделение РНК вирусов проводили из 10-20 % осветленных фекальных экстрактов с использованием комплекта реагентов для выделения РНК сорбцией на силикагеле "РИБО-сорб" (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) согласно инструкции производителя. Очищенную РНК хранили при -70С. к ДНК получали методом обратной транскрипции на матрице РНК вирусов с использованием комплекта реагентов "Реверта-L" (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) согласно инструкции производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили сразу после выделения РНК, в течение 30 мин при 37С в амплификаторе "Терцик" (ДНК-технология, Россия). Готовый препарат кДНК хранили при -70С.
В качестве матрицы в полимеразной цепной реакции использовали кДНК, полученную в реакции обратной транскрипции. ПНР проводили с использованием технологии «горячий старт» в амплификаторах "Терцик" и "Mastercycler gradient" (Eppendorf, Германия). Продукты амплификации до проведения анализа хранили при +4С.
Амплификацию участка кДНК длиной 290 п.н. для детекции ротаеирусов группы А проводили с использованием комплекта реагентов для ГЩР "АмплиСенс Rotavirus-290" (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) согласно инструкции производителя.
Для амплификации участка кДНК длиной 205 п.н. ротаеирусов группы С использовали праймеры Rota С-1 и Rota С-2, любезно предоставленные сотрудниками лаборатории кишечных инфекций (ЦНИИ эпидемиологии, Москва). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: ІхТод-полимеразньш буфер, 2,5 мкл dNTPs с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого, 1 е.а. Taq ДНК-полимеразы, по 9 пмоль каждого олигонуклеотидного праймера и 10 мкл раствора кДНК ротавирусов.
Амплификация кДНК фрагментов генома, кодирующих белки VP4 и VP7, для типирования ротавирусов группы А. Четвертый фрагмент РНК-генома кодирует поверхностный протеазочувствительный белок VP4, домен VP8 которого определяет Р-генотип ротавирусов. Девятый фрагмент генома кодирует гликопротеин наружного капсида VP7, определяющий G-генотип. В нашем исследовании для определения Р- и G-генотипа мы использовали модифицированные методики мультиплексной ОТ-ПЦР, разработанные в ЦНИИ эпидемиологии на основе методов, детально описанных в ряде работ (Gouvea V. et al., 1990; Gentsch J. R. et al., 1992; Das В. K. etal., 1994). В этих методиках используются генотипспецифические праймеры, которые позволяют определять широко распространенные в мире генотипы ротавирусов(табл. 1).
Модификация методик заключалась в разделении мультиплексных реакционных смесей для второго раунда генотипирования на две части для облегчения интерпретации результатов (табл. 2).
Первый раунд. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 1х Гад-пол и меразный буфер, 2,5 мкл dNTPs с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого, 1 е.а. Taq ДНК-полимеразы, по 9 пмоль каждого олигонуклеотидного праймера и Юмкл раствора кДНК ротавирусов. Для амплификации кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующего домен VP8 белка VP4, использовали праймеры СопЗ и Соп2 (рис. 5). Для амплификации кДНК девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7, использовали праймеры Beg9 и 9Соп2 (рис. 6).
Второй раунд. Ампликоны, полученные в первом раунде, являлись матрицей для второго раунда амплификации. Использовали разведение 1:10 в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 1хГод-полимеразный буфер, 2,5 мкл dNTPs с конечной концентрацией 0,2 мМ каждого, 1 е.а. Taq ДНК-полимеразы, по 9 пмоль (для Р-типа) и 4,5 пкмоль (для G-типа) каждого олигонуклеотидного праймера (см. табл. 2), Юмкл (1:10) раствора ампликона. Замена праймера во втором раунде G-типирования позволяла проводить вложенную ПЦР, что повышало чувствительность и специфичность исследования.
Сравнительная оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ротавирусов группы А
Ротавирусный гастроэнтерит относится к числу инфекционных заболеваний, этиологически верный диагноз которых возможен только после лабораторного подтверждения. Поэтому для проведения длительного мониторинга ротавирусной инфекции необходимо было выбрать наиболее подходящий из имеющихся в РФ наборов для детекции ротавирусов группы А. ИФА наборы "Premier Rotaclone" (Meridian Bioscience, США) и "IDEIA Rotavirus" (DakoCytomation, Великобритания) для обнаружения антигенов ротавирусов человека группы А имеют высокие показатели специфичности и чувствительности и рекомендованы ВОЗ для проведения мониторинга ротавирусного гастроэнтерита, но они коммерчески недоступны на территории РФ. В специализированных клиниках России применяют отечественные ИФА наборы "Рота-антиген" (НЛП "Аквапаст", Санкт-Петербург) и "Рота-анализ" (ЗАО "Биоиммуноген", Москва). Такие методы выявления, как электронная микроскопия, электрофорез РНК, также могут быть использованы, но являются более трудоемкими, требуют специального оборудования и не подходят для проведения диагностики большого количества проб. В последние годы ПЦР, как наиболее чувствительный и специфический метод, стал широко использоваться как для диагностики, так и для молекулярной характеристики патогенов. В ЦНИИ Эпидемиологии (Москва) разработаны комплекты реагентов для ПЦР-диагностики РНК ротавирусов группы А "АмплиСенс Rotavirus-290". Поэтому на данном этапе работы мы провели сравнительную оценку существующих в РФ наборов реагентов для выявления ротавирусов группы А.
Для проведения оценки диагностической эффективности наборов реагентов была использована панель из 200 проб, собранных в период сезонного подъема заболеваемости ротавирусным гастроэнтеритом в Новосибирске с февраля по апрель 2004 г. В ее состав вошло 90 проб, в которых ИФА набором "Premier Rotaclone" были выявлены антигены ротавирусов человека группы А, и 110 проб, имеющие отрицательный результат анализа. ИФА набор "Premier Rotaclone" обладает высокими качественными параметрами и может быть использован в качестве референс-стандарта (WHO, 2002).
Существуют общепринятые критерии сопоставления результатов диагностики испытуемым тестом по сравнению с референс-стандартом (Лакин Г. Ф., 1990). Метод альтернативной корреляции с использованием таблиц 4-х полей позволяет определить не только показатели чувствительности и специфичности теста, но и суммарный показатель совпадения результатов диагностики с референс-стандартом.
Панель проб была протестирована ИФА набором "Рота-антиген" и ПЦР набором "АмплиСенс Rotavirus-290". Наилучшие диагностические специфичность (95,5 %) и чувствительность (94,4 %), а также суммарный показатель совпадения результатов с референс-тестом (95 %) показал ПНР набор "АмплиСенс Rotavirus-290" (табл. 15).
В параллельных экспериментах девяносто три образца (27 положительных, 66 отрицательных) были дополнительно протестированы ИФА тест-системой "Рота-анализ". Данный набор показал очень низкую чувствительность (48 %) по сравнению с референс-тестом (см. табл. 15).
Таким образом, ПЦР набор реагентов "АмплиСенс Rotavirus-290" по показателям диагностической эффективности превосходит коммерчески доступные в РФ иммуноферментные наборы. Поэтому именно он и был использован при проведении дальнейших исследований циркуляции ротавирусов группы А.
Проведен анализ клинических случаев госпитализации детей раннего возраста в специализированную клинику с марта 2005 по июнь 2008 г. Всего было обследовано 3486 детей до 3-х лет с ОКИ. Так как у детей неонатального периода возможна асимптоматическая форма ротавирусной инфекции, то была сформирована группа сопоставления. В эту группу были включены дети до 3-х месяцев (142 ребенка), госпитализированные в отделение респираторных инфекций и не имевшие клинических проявлений кишечной инфекции.
Схема проведения исследования представлена на рисунке 9. В ДГКБ № 3 Новосибирска образцы фекалий от детей в возрасте до 3-х лет с диагнозом ОКИ собирались не позже второго дня поступления в профильное отделение, чтобы исключить внутрибольничное инфицирование. В микробиологической лаборатории больницы проводился стандартный бактериологический посев на Salmonella spp., Shigella spp., энтеропатогенные E. coli и условно-патогенные микроорганизмы (МУ №04-23/3 от 17.12.84). Собранные пробы, вместе с письменным информированным согласием и идентификационным листом, еженедельно доставлялись в ГНЦ ВБ "Вектор". Информация об анамнезе заболевания и данные лабораторных исследований вносились в индивидуальные медицинские карты, которые поступали к нам после выписки ребенка из стационара. В лаборатории ГНЦ ВБ "Вектор" нами проводилась комплексная ГЩР-диагностика всех поступивших фекальных проб на наличие вирусных (ротавирусы группы А, норовирусы, астровирусы) и бактериальных (Salmonella spp., Shigella spp. и энтероинвазивные Е. Coli (EIEC), Campylobacter термофильной группы) энтеропатогенов с использованием наборов реагентов "АмплиСенс-Rotavirus-290", "AMnnnCQHc-Astrovirus-J65", "АмплиСенс-Norovirus 1,2 genotypes-306/322", "АмплиСєнс-ЗаїтопеїІаspp", "AuunnCeHC-Shige/Iaspp.", "AMumiCQHc-Campylobacterspp." (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва). Метод ПЦР позволяет выявлять и дифференцировать РНК/ДНК патогенов в пробах. Параллельное использование нескольких методов повышает диагностическую ценность результатов лабораторных исследований, поэтому пробы также тестировались методом ИФА, который выявляет антигены ротавирусов группы А, с использованием коммерческих ИФА наборов "Premier Rotaclone" (Meridian Bioscience, США) "IDEIA Rotavirus" (DakoCytomation, Великобритания).
