Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1 Этиология, патогенез и классификация форм эпилепсии 12
1.2. Роль генов ионных каналов в развитии эпилепсии 20
1.3. Роль нейромедиаторных систем мозга в развитии эпилепсии 29
Глава II. Материал и методы
П. 1. Материалы исследования 38
II.2. Методы исследования 39
11.2.1. Выделение геномной ДНК 39
11.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 39 П.2.3. SSCP-анализ 43
11.2.4. ПНР - ПДРФ 44
Статистическая обработка результатов 46
Глава III. Результаты исследования и обсуждение
III. 1. Исследование гена al - субъединицы нейронального натриевого канала (SCN1A) и сцепленных с ним полиморфных ДНК-локусов D2S2330 и D2S124 у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров из Башкортостана 47
III. 1.1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса D2S2330, сцепленного с геном SCN1A, у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров 47
III. 1.2. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса D2S124, сцепленного с геном SCN1A, у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров 5 2 III. 1.3. Поиск мутаций и полиморфизмов в гене al - субъединицы нейронального натриевого канала (SCN1 А) 63
Ш.2. Исследование гена у2 субъединицы рецептора гамма -аминомасляной кислоты (GABRG2) и сцепленных с ним полиморфных ДНК-локусов D5S422 и D5S402 у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров из Башкортостана 72
Ш.2.1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса D5S422, сцепленного с геном GABRG2, у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров 72
ІІІ.2.2. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса D5S402, сцепленного с геном GABRG2, у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров 80
Ш.2.3 Поиск мутаций и полиморфизмов в гене у2 субъединицы рецептора гамма - аминомасляной кислоты (GABRG2) 82
ІІІ.З. Исследование полиморфных вариантов гена R5 субъединицы каинатного рецептора глутамата (GRIK1) у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров из Башкортостана. 106 Ш.3.1. Анализ ассоциации STR полиморфного варианта гена GRIK1
с идиопатической эпилепсией 106
Ш.3.2. Анализ ассоциаций 522А>С полиморфного варианта гена GRIK1 с идиопатической эпилепсией 109
Ш.4. Исследование полиморфных вариантов гена рецептора D2 дофамина (DRD2) у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров из Башкортостана. 114
Ш.4.1 Анализ ассоциаций TaqI А полиморфного варианта гена DRD2 с идиопатической эпилепсией 114
Ш.4.2 Анализ ассоциаций Ncol полиморфного варианта гена DRD2 с идиопатической эпилепсией 117
III. 5 Исследование полиморфизмов гена переносчика дофамина (SLG6A3) у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров из Башкортостана 121
Ш.5.Г Анализ ассоциаций VNTR полиморфного варианта гена
SLC6A3 с идиопатической эпилепсией 121
Ш.5.2 Анализ ассоциаций MspL полиморфного варианта гена SLC6A3 с идиопатической эпилепсией 124
Заключение 128
Выводы 133
Список литературы
- Этиология, патогенез и классификация форм эпилепсии
- Роль нейромедиаторных систем мозга в развитии эпилепсии
- Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 39 П.2.3. SSCP-анализ
- Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса D5S422, сцепленного с геном GABRG2, у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров
Введение к работе
1. Актуальность проблемы
Эпилепсия представляет собой хроническое заболевание головного мозга, характеризующееся спонтанными приступами нарушений двигательных, чувствительных, вегетативных, мыслительных или психических функций, возникающих вследствие чрезмерных нейронных разрядов [Петрухин А.С., 2000]. Данная патология является серьёзной медико-социальной проблемой в связи с ее высокой распространенностью во всех возрастных группах населения. Показатель заболеваемости по миру колеблется в пределах 40-70 человек на 100 000 населения [Epidemiology, ™ 2001], в России 130 - 560 человек на 100 000 населения, а по Республике Башкортостан - 137 на 100 000 человек [Борисова Н.А., 2003].
Эпилепсия характеризуется чрезвычайным полиморфизмом эпилептических приступов, отличающихся друг от друга этиологией, характером приступов, течением и прогнозом. Достижения нейрорадиологических методов диагностики, видео-ЭЭГ-монторинга позволили создать в 1989 году практически полную классификацию различных форм эпилепсии [Commission on Classification and Terminology of the International League against epilepsy. Proposal for classification of epilepsies and epileptic syndromes, 1989]. Согласно ей, по анатомическому признаку и характеру приступов эпилепсии делятся на генерализованные и локально-обусловленные (фокальные) формы, по этиологическому признаку - на симптоматические, криптогенные и идиопатические.
Современная гипотеза этиопатогенеза эпилепсии предполагает многофакторную и полигенную природу данного заболевания, а также сложный характер взаимодействия генетической предрасположенности к судорожной активности с факторами среды. Наиболее интересными с точки зрения генетики являются идиопатические формы эпилепсии, (ф представляющие собой самостоятельное заболевание, не связанное с органическим поражением мозга или другими заболеваниями. Они традиционно рассматриваются как случаи с высокой наследственной предрасположенностью, о чем свидетельствуют наследственная отягощенность и высокая степень конкордантности среди монозиготных близнецов (65%) по сравнению с гетерозиготными (12%) [Kjeldsen M.J. et al., 2003]. На основании данных, полученных при молекулярно - генетических исследованиях семей, страдающих различными моногенными формами ИЭ, а также принимая во внимание современные представления о патофизиологических механизмах идиопатической эпилепсии, можно выделить следующие группы генов, участвующих в развитии ИЭ: гены потенциал - зависимых ионных каналов (натриевого, кальциевого, хлорного); гены рецепторов и переносчиков нейромедиаторов торможения и возбуждения (гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), серотонина, глутамата) и др. [Wallace, R.H. et al., 2003; Haug,K. et al., 2003; Sugawara, T. et al., 2002; Ohmori, I. et al., 2002; Harkin, L.A. et al., 2002; De Fusco, M. et al., 2000]. Нарушения в этих генах могут прямым или косвенным образом приводить к аномальному повышению возбудимости нейронов.
Наиболее распространенными по сравнению с моногенными-являются сложнонаследуемые формы эпилепсии, для которых на сегодняшний день картирован ряд локусов сцепления: 8q24, 14q23, 3q26, ІбрІЗ, 6р21, 15ql4 [Liu A.W.et al., 2000; Sander, T. et al.,2000; Durner M.et al., 2001; Robinson, R. et al., 2002]. В процессе развития данных форм заболевания предполагается участие нескольких взаимодействующих между собой генов, расположенных в данных областях. Вклад каждого из них в риск развития эпилепсии может быть небольшим, но, тем не менее, приводящим к наследуемым изменениям, предрасполагающим к судорожной активности. Несмотря на то, что в последние годы во всем мире активно ведутся исследования молекулярно- генетических основ как редких моногенных форм эпилепсии, так и сложнонаследуемых форм, это всего лишь первые шаги в понимании (• этиологии и патогенеза этого сложного заболевания.
Принципиально важным при исследовании ассоциаций полиморфных локусов генов-кандидатов с риском развития ИЭ является учет этнической принадлежности обследованных лиц. Разные народы мира имеют особенности генетической структуры и могут характеризоваться различным набором и соотношением факторов риска заболевания [Kamboch М. et al., 1999], ассоциации, обнаруженные в одних этнических группах, не всегда встречаются в других [Bishop, Sham. Et al., 2003].
В рамках проблемы выявления факторов, определяющих наследственную предрасположенность к идиопатическои эпилепсии у больных из Республики Башкортостан, весьма актуальным является изучение полиморфных вариантов генов-кандидатов, белковые продукты которых оказывают влияние на процессы нейрональной возбудимости.
2. Цель и задачи исследования
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась оценка роли генов ионных каналов, глутаматэргической и дофаминэргической систем в развитии ИЭ в Башкортостане. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи.
1. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов D2S2330, D2S124, сцепленных с геном а 1 -субъединицы нейронального натриевого канала (SCN1A), у больных идиопатическои эпилепсией и здоровых доноров.
2. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов D5S422, D5S402, сцепленных с геном у2 -субъединицы рецептора гамма - аминомасляной кислоты (GABRG2), у больных идиопатическои эпилепсией и здоровых доноров.
3. Провести поиск мутаций и полиморфизмов в генах SCN1A и GABRG2 у пациентов с идиопатическои эпилепсией, проживающих в Башкортостане.
4. Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов 315С Т, 588С Т гена GABRG2 с идиопатическои эпилепсией.
5- Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена R5 -субъединицы каинатного рецептора глутамата GRIK1 (STR, 522А С) с идиопатической эпилепсией.
6- Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена D2 рецептора дофамина DRD2 (TaglA, Ncol) и гена переносчика дофамина SLC6A3 (VNTR, Mspl) с идиопатической эпилепсией.
3. Научная новизна
Впервые в Республике Башкортостан создана коллекция ДНК больных идиопатической эпилепсией. Проведен поиск мутаций и полиморфизмов в гене SCN1A у пациентов с ИЭ, в результате которого обнаружена мутация (Ф G396A и два изменения нуклеотидной последовательности (1212G A, 2817G C), последнее из которых ранее не было описано в литературе. Выявлены два полиморфных варианта гена GABRG2 {315С Т, 588С Т), для которых показана ассоциациях риском развития идиопатической эпилепсии. Впервые проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов D2S2330, D2S124, сцепленных с геном SCN1A, и D5S422, D5S402, сцепленных с геном GABRG2, с идиопатической эпилепсией. Обнаружены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов данных полиморфных маркеров между больными ИЭ и здоровыми донорами различного этнического происхождения, проживающими в Башкортостане (русскими, татарами и ( башкирами), а также выраженные межэтнические отличия. Получены данные об ассоциации полиморфных локусов генов рецепторов глутамата (GRIK1) и дофамина (DRD2), а также переносчика дофамина (SLC6A3) с повышенным риском развития идиопатической эпилепсии.
4. Научно - практическая значимость работы
Результаты исследования вносят вклад в понимание молекулярно генетических основ возникновения идиопатической эпилепсии, позволяют выявить генетические маркеры, ассоциированные с повышенным/пониженным риском развития заболевания. Полученные данные могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
5. Положения, выносимые на защиту
1. Маркеры повышенного риска развития идиопатической эпилепсии по полиморфным ДНК-локусам D2S2330 и D2S124, сцепленным с геном al -субъединицы нейронального натриевого канала SCN1A: у русских — аллели D2S2330 9, D2S1244, D2S124 5y генотип D2S124 3/ 5, у татар - аллель D2S124 5 и генотип D2S124 4/ 5, у башкир - аллель D2S1244.
2. Идентификация мутации G396A и двух полиморфных вариантов 1212G A, 2817G C гена al - субъединицы нейронального натриевого канала SCN1A у больных с идиопатической эпилепсией из Башкортостана.
3. Ассоциация аллеля D5S422 10 полиморфного ДНК-локуса D5S422, сцепленного с геном у2 - субъединицы рецептора гамма-аминомасляной кислоты GABRG2, с развитием идиопатической эпилепсии у татар; аллеля D5S422 ! - у русских.
4. Увеличение риска развития идиопатической эпилепсии при наличии аллелей 315 С и 588 С, гомозиготных генотипов 315 С/ С и 588 С/ С, а также сочетания генотипов 315 С/ С - 588 С/ С по полиморфным вариантам 315С Т, 588С Т гена у2 - субъединицы рецептора гамма-аминомасляной кислоты GABRG2.
5. Ассоциация генотипа 522 А/ А полиморфного варианта 522А С гена R5 - субъединицы каинатного рецептора глутамата GRIK1 с риском развития идиопатической эпилепсии у башкир.
6. Генетический маркер повышенного риска развития идиопатической эпилепсии у татар — генотип SLC6A3 G/ G Mspl-полиморфизма гена переносчика дофамина (SLC6A3).
Этиология, патогенез и классификация форм эпилепсии
Существуют разные взгляды на этиологию и патогенез эпилепсии, и классификации форм эпилепсии, как правило, отражают какую-либо одну особенность клинической картины или патогенеза. Созданию единой классификации препятствует и разнообразие клинических проявлений эпилепсии, нередко наблюдаемое у одного и того же больного. Наиболее широкое рас пространение получила Международная классификация эпилепсии, принятая на конгрессе Международной Лиги Борьбы с Эпилепсией (ILAE) в 1989 году [Commission on Classification and Terminology of the International League against epilepsy. Proposal for classification of epilepsies and epileptic syndromes, 1989]. В ее основу положены два принципа: локализации и этиологии. По анатомическому признаку и характеру приступов эпилепсии делятся на генерализованные и локально-обусловленные (фокальные). По этиологическому признаку все формы эпилепсии делятся на следующие группы: симптоматические, криптогенные и идиопатические.
Под симптоматическими формами подразумеваются синдромы с известной этиологией и верифицированными морфологическими нарушениями (опухоли, рубцы, глиоз и др.). Среди них преобладают посттравматическая, сосудистая и алкогольная эпилепсия. При этом, этиологическим фактором развития заболевания может являться взаимодействие генетически детерминированного снижения судорожного порога с массивным экзогенным воздействием [Мухин К.Ю., Петрухин А.С., 2002]. В последнее время также начали выделять такие наследственные формы симптоматических эпилепсии, как инфантильные спазмы, синдром Леннокса - Гасто и эпилепсия с миокло-ническими абсансами [Commission on Classification and Terminology of the International League against epilepsy. Proposal for classification of epilepsies and epileptic syndromes, 1989]. При симптоматических формах эпилепсии поражение нейронов со стойким эписиндромом является частью распространённого системного дегенеративного процесса, обусловленного болезнями обмена веществ, хромосомными синдромами [Иллариошкин С.Н., 2002]
Криптогенными считаются те формы эпилепсии, причины возникновения которых пока неизвестны. Данные формы не удовлетворяют критериям идиопатических форм, но нет доказательств их симптоматического характера.
Идиопатическая эпилепсия (ИЭ) происходит от греческих слов "idios" (собственный) и "pathos" (болезненный), означая, что данная форма эпилеп сии обусловлена нарушением функции собственно головного мозга и является самостоятельным заболеванием, не связанным с органическими поражениями мозга или другими заболеваниями. Современная классификация определяет ИЭ как различные формы эпилепсии, при которых отсутствуют другие причины заболевания, кроме наследственной предрасположенности. Данные формы характеризуются возраст - зависимым дебютом, клиническими и электроэнцефалографическими особенностями и обычно генетически детерминированы [Петрухин АС, 2000].
Согласно Международной классификации эпилепсии и эпилептических синдромов (1989) среди идиопатических фокальных форм эпилепсии выделяют первичную эпилепсию чтения, доброкачественную эпилепсию детского возраста с центральнотемпоральными спайками. Гораздо большее число форм эпилепсии входят в группу идиопатических генерализованных эпилепсии (ИГЭ): доброкачественные семейные судороги новорожденных, доброкачественная миоклоническая эпилепсия младенчества, детская абсанс эпилепсия, юношеская абсанс эпилепсия, юношеская миоклоническая эпилепсия, эпилепсия с генерализованными судорожными приступами пробуждения, первичная фотосенситивная эпилепсия [Commission on Classification and Terminology of the International League against epilepsy. Proposal for classification of epilepsies and epileptic syndromes, 1989]. Распространенность ИГЭ по обобщенным данным составляет 290 на 100 000 населения, заболеваемость - 14.8 на 100 000 [Sander J.W. et al., 1999]. Наиболее полно изучена эпидемиология абсансных форм эпилепсии, так как они составляют не менее 15% всех форм эпилепсии и около 50% всех случаев ИГЭ. В итальянской популяции детей от 6 до 14 лет распространенность абсансов (с или без генерализованных судорожных припадков) составляет 40 на 100 000 населения, в Соединенном Королевстве - 60 на 100 000, а в Западной Германии - 70 на 100 000 [Pfafflin М. et al., 2003]. Генерализованные судорожные приступы являются одним из наиболее частых видов приступов (23%) при идиопатических генерализованных формах эпилепсии.
Роль нейромедиаторных систем мозга в развитии эпилепсии
Формы эпилепсии, обусловленные нарушениями в генах кальциевых каналов. Потенциал-зависимые кальциевые каналы идентифицированы в ци-топлазматической мембране клеток, обладающих электрической возбудимостью, в частности клеток сердечной и скелетной мышц, нервных клеток и др [Jouvencaen A., et al. 2001]. Снижение внеклеточной концентрации ионов кальция приводит к увеличению возбудимости нейронов; повышение внеклеточного уровня, напротив, влечет за собой снижение возбудимости [Николе Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж.., 2003]. Неирональный кальциевый канал является белковым комплексом, в состав которого входит а - субъединица, формирующая структурную основу канала, и дополнительные р, у и 5 - субъединицы [Escaug A., De Waard М., Lee D.D. et al., 2000] (рис. 5).
Известно не менее семи генов, кодирующих различные изоформы субъединицы сії, и четыре гомологичных гена, кодирующих субъединицы pVpY кальциевого канала. Взаимодействие субъединиц регулирует амплитуду тока ионов кальция, его активацию и инактивацию [De Waard М., Campbell К., 1995].
В канадской семье у пациентов с ювенильной миоклонической эпилепсией были обнаружены две мутации в гене CACNB4, кодирующем 34-субъединицу кальциевого канала L- типа [Escaug A. et al., 2000]. Известен случай сочетания абсансов с эпизодической атаксией второго типа, вызванный мутацией R1820stop в гене а-А1 - субъединицы кальциевого канала P/Q-типа (CACNA1A), расположенного на хромосоме 19р13. Данная мутация приводит к образованию преждевременного стоп - кодона и, как следствие, к полной потере С-области белка, что резко сокращает время инактивации канала и снижает поток ионов кальция в активизированные нейроны в процессе генерации потенциала действия [Chioza,B. et al., 2001].
Формы эпилепсии, обусловленные нарушениями в генах хлорных каналов. Детальное изучение области 3q26, с которой ранее было обнаружено сцепление идиопатической эпилепсии, позволило картировать расположенный в этой области ген CLCN2, кодирующий N2 субъединицу хлорного канала [Sander Т. et al., 2000]. Исследование двадцати четырех экзонов этого гена у больных детской абсансной эпилепсией позволило выявить три мутации. Нонсенс-мутация и мутация сайта сплайсинга, M200fsX231 и del 174-117, вызывают накопление внутриклеточных ионов хлора, а третья мутация E715G, хотя и не нарушает нормальную амплитуду тока ионов хлора, приводит к тому, что канал открывается при меньшем отрицательном заряде. В конечном итоге, при всех этих мутациях нарушается механизм освобождения ионов хлора, что резко сокращает ингибирующее освобождение ГАМК [Haug К. etal, 2003]. Ионные каналы играют ключевую роль в нервной системе, обеспечивая генерацию, ингибирование и распространение потенциалов действия. Последние достижения молекулярно-генетических исследований эпилепсии выявили, что в основе некоторых идиопатических форм лежит нарушение деятельности именно ионных каналов. Вполне вероятно, что их широкое распространение в головном мозге, а также мутации в них способствуют возникновению судорожной активности.
Помимо классических эффектов, реализующихся через потенциал-чувствительные ионные каналы и непосредственное изменение электрических мембранных потенциалов, многие нейромедиаторы (катехоламины, се-ротонин и некоторые нейропептиды) оказывают модулирующее влияние на функции нервных клеток. Нейрохимические и фармакологические исследования свидетельствуют о том, что ведущим механизмом эпилептогенеза является нарушение равновесия ингибирующей и возбуждающей нейромедиа-торных систем мозга [Bate L. et al., 1999; Kullmann D. et al., 2002].
ГАМКергическая система в развитии идиопатической эпилепсии. ГАМК (у-аминомасляная кислота) обеспечивает процессы ингибирования в центральной системе с помощью трех классов рецепторов (ГАМК-А, В и С). Наиболее распространенными в гиппокампе являются ГАМК-А рецепторы. Из шестнадцати субъединиц ГАМК-А рецепторов в формировании типичной молекулы канала принимают участие две а-субъединицы, две р-субъединицы и одна у-субъединица [Николе Дж.Г. с соавт., 2003] (рис. 6). Гидрофильные поверхности субъединиц формируют канал, селективный к ионам хлора. Ин гибирующий эффект ГАМКэргической нейропередачи связан именно с по вышением проницаемости мембран для ионов хлора и, следовательно, ги перполяризацией и снижением возбудимости нейронов.
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 39 П.2.3. SSCP-анализ
Исследование образцов ДНК на наличие мутаций и полиморфизмов проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP), основанным на различной электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК, различающихся вследствие нуклеотидных замен по конформации молекул, в неденатурирующем полиакриламидном геле[ОгкаМ. etal., 1989].
Каждый индивидуальный экзон амплифицировали с помощью специфических праймеров, фланкирующих изучаемый экзон (табл. 2). Для каждой пары праймеров индивидуально подбирали необходимую концентрацию ионов магния, температуру отжига и режим амплификации. SSCP - анализ проводили с помощью щелочной денатурации.
После проведения ПЦР 10 мкл амплификата смешивали с 0,3 мкл 0,5 М NaOH, 0,3 мкл 0,5М ЭДТА и нагревали в течение 15 минут при 42G. После этого к пробам добавляли 2 мкл формамида, смешанного с 0,5% бромфенолового синего и 0,5% ксилолцианола, и наносили на 10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида/метиленбисакриламида 29:1) с 5% глицерином. В качестве электрофорезного буфера использовали 0,5 ТВЕ (рН=8,8). Электрофорез геля длиной 20 см, толщиной 1 мм проходил при комнатной температуре при напряжении 100В в течение 20 часов. Окраску геля проводили в течение 15 минут азотно-кислым серебром.
Гель после прохождения электрофореза инкубировали в 0,1% водном растворе AgN03 в течение тридцати минут. Потом гель три раза промывали дистилированной водой при покачивании в течение двух минут. После этого гель проявляли, покачивая в 3% растворе гидроксида натрия, содержащем 0,2% формалина. После проявления гель промывали дистиллированной водой для остановки окраски. Секвенирование образцов ДНК с измененной подвижностью проводилось на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems).
Для подтверждения результатов секвенирования у больных использовали метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Обнаруженные нами однонуклеотидные замены в третьем и пятом экзонах гена GABRG2 приводили к появлению сайтов для специфических рестриктаз. После проведения ПЦР 3 экзона гена GABRG2 отбирали 10 мкл амплификата и обрабатывали в стандартных условиях рестриктазой M/aTV («Fermentas»), а амплификат 5 экзона рестриктазой TspEl («Fermentas»).
Полиморфизм 2319G A гена DAT1 типировали при расщеплении ПЦР продукта эндонуклеазой рестрикции Mspl («Fermentas»), полиморфизмы 10541Т С и 31SHis His гена DRD2 - рестриктазами TaglA и Bspl9\ («Fermentas»), полиморфизм 522А С гена GRIK1 - рестриктазой BstDSl («Fermentas»). Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 7% полиакриламидном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали под ультрафиолетовыми лучами.
Математическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ статистического анализа "Rows х Columns" [Roff, Bencen, 1989], оценивающей значимость сравнений при помощи метода Монте-Карло, основанного на использовании многократных повторяющих симуляций, что позволяет не учитывать дальнейшей поправки на множественность сравенений [Sham, Curtis, 1995], программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft) и компьютерной программой RxC (Rows х Columns) на основе алгоритма, описанного Роффом и Бенценом (1989).
Частоты аллелей определяли по формуле [Животовский, 1991] Pi=Ni/N, где Nj - число i-ых аллелей, N - объем выборки. Стандартную ошибку частоты аллелей рассчитывали по формуле: S=Vpi(l-pi)/2N Так как в наших выборках встречались значения частот р 0,02 и р 0,8, доверительный интервал для значения частоты определяли по формуле [Животовский, 1991]: p = n/[n + (N-n+l) F] р" = (п+ 1) F 7 [N-n + (n + 1) F"], где F - критическое табличное значение F - распределения с числом степеней свободы v i = 2 (N - n + 1) и v 2 = 2 п для уровня значимости а/2; F" - критическое значение F - распределения с v"i = 2 (n+l), v" = 2 (N-n) для того же уровня а/2. Генеральное значение находится в интервале р р р" (Р=1-а).
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса D5S422, сцепленного с геном GABRG2, у больных идиопатической эпилепсией и здоровых доноров
Ранее R. Wallace с соавторами было показано сцепление полиморфного локуса D5S422 с детской абсансной эпилепсией и фебрильными судорогами (значение логарифма соотношения шансов (LOD) равно 6,06. Нами проведено изучение полиморфизма данного микросаттелитного локуса у больных ИЭ и здоровых доноров, расположенного на 0,66 сМ дистальнее гена GABRG2. При анализе этого локуса было идентифицировано 17 аллелей (от ПО п.о. до 142 п.о.). На рисунке 22 представлена электрофореграмма результатов амплификации.
При анализе характера распределения частот аллелей и генотипов полиморфного ДНК-локуса D5S422 в объединенной группе больных по сравнению с контролем с учетом поправки на множественность аллелей достоверных различий не выявлено (р 0,05). Однако при попарном сравнении частот аллелей было обнаружено, что аллель D5S422 ! встречался у больных ИЭ достоверно чаще (8%) по сравнению с контрольной группой (2,85%) (OR=2,9; СГ95% 1,2-7,5; Х2=6,09; р=0,01). В исследуемых группах преобладающим был аллель D5S422 9, он определялся на 15,3% хромосом в контрольной группе и 14% - у больных ИЭ. Следующими по встречаемости в обеих группах оказались аллели D5S422 5 и D5S422 10, обнаруженные у здоровых доноров с частотой 9,25% и 12,1%, а у больных эпилепсией с частотой 12% и 11,6% (см. приложение, табл. 6).
При изучении полиморфного локуса D5S422 в общей выборке больных ИЭ найдено 69 различных генотипов, в контрольной группе - 54. Обнаружено, что среди здоровых лиц контрольной группы с наибольшей частотой встречались генотипы D5S422 5/ 9, D5S422 6/ 10 и D5S422 ! 1/ 15, определенные в 8,5%, 6,4% и 4,3% случаев, соответственно. Частота наиболее распространенного в группе больных генотипа D5S422 5/ 9 составила 8%, генотипы D5S422 l/ 6, D5S422 4/ 9, D5S422 4/ 1Q и D5S422 5/ 1() встречались с одинаковой частотой (4,8%). Частота других генотипов в исследуемых группах не превышала 3% (см. приложение, табл. 7). Значение фактической гетерозиготности полиморфного локуса D5S422 у больных эпилепсией составило 0,98, у здоровых доноров -0,94.
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного ДНК-локуса D5S422 в целом не выявил достоверных различий между выборками здоровых лиц различной этнической принадлежности, однако попарное сравнение частот аллелей показало, что контрольная группа татар достоверно отличалась от русских и башкир. Аллель D5S422 2 чаще встречался у татар (11,5%), чем у русских (2,7%) (х =5,25; р 0,02) и башкир (1,5%) (х2=4,3; р=0,038). В то же время аллель D5S422 10 обнаруживался в группе татар гораздо реже (5,7%), чем у русских (18,7%) (х 7,16; р=0,008) (рис. 23).
При анализе распределения частот аллелей полиморфного ДНК-локуса D5S422 в группах больных разного этнического происхождения также было выявлено, что частоты аллелей у татар достоверно отличаются от таковых в группах больных русской и башкирской этнической принадлежности. Аллель D5S422 4 в выборках больных башкирской этнической принадлежности (14,3%) встречался чаще, чем в выборке больных татарской этнической принадлежности (1,3%) (%=7,1; р=0,009). Аллель D5S422 9 оказался в группе последних более редким (5,4%), чем у русских (15%) (х2=2,8; р=0,09) и башкир (21,4%) (х2=7,14; р=0,008) (рис. 24). Попарное сравнение частот генотипов показало статистически значимые различия между всеми группами больных эпилепсией. Наиболее распространенный у больных башкирской этнической принадлежности генотип D5S422 4/ 10 , обнаруженный в 14,3% случаев, отсутствовал у больных русской (х2=4,2; р=0,04) и татарской (;(2=3,86; р=0,05) этнической принадлежности (см. приложение, табл. 7). различной этнической принадлежности, проведенный с учетом поправки на множественность аллелей, не выявил статистически значимых отличий ни в одной из этнических групп, достоверные различия получены лишь при попарном сравнении частот аллелей и генотипов.
У русских среди пациентов была значительно выше частота встречаемости аллеля D5S422 ! (11,3% по сравнению с 1,8% у здоровых доноров) (OR=6,9; С195% 1,34-48,3; р=0,01) (рис. 25). Частота встречаемости аллеля D5S422 10 у пациентов была ниже (7,5%) по сравнению с таковой у здоровых доноров (18,8%) ( Ж=0,35; С195% 0,12-0,89; р=0,04) (табл. 10). При попарном сравнении частот генотипов было обнаружено, что преобладающий у больных русской этнической принадлежности (10%) генотип D5S422 l/ 6 отсутствует в соответствующем контроле (OR=13,9; С195% 1,74-304; х2=8,07; р=0,005) (см. приложение, табл. 7). OR=035
